专利摘要

一种用于木质素分解的细菌复合菌剂。属于微生物领域。它解决了目前缺少能够分解木质素的细菌复合菌系的问题。该复合菌剂按重量份数比包括25~30份假单胞菌ACCC11691发酵液、15~25份施式假单胞菌DSM6084发酵液、25~35份微杆菌DSM20618发酵液、20~25份不动杆菌DSM9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为109个/mL以上。本发明的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用，其为以纤维素为主要原料的造纸制浆工艺提供了应用基础，为木质素的细菌分解的研究提供了研究基础。

权利要求

1.一种用于木质素分解的细菌复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比包括25~30份假单胞菌（Pseudomonas sp.）ACCC 11691发酵液、15~25份施式假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DSM 6084发酵液、25~35份微杆菌（Microbacterium sp.）DSM 20618发酵液、20~25份不动杆菌（Acinetobactergenospecies 3）DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

2.根据权利要求1所述的一种用于木质素分解的细菌复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比包括26~29份假单胞菌（Pseudomonas sp.）ACCC 11691发酵液、16~24份施式假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DSM 6084发酵液、26~34份微杆菌（Microbacterium sp.）DSM 20618发酵液、21~24份不动杆菌（Acinetobactergenospecies 3）DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

3.根据权利要求2所述的一种用于木质素分解的细菌复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比包括28份假单胞菌（Pseudomonas sp.）ACCC 11691发酵液、20份施式假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DSM 6084发酵液、30份微杆菌（Microbacterium sp.）DSM 20618发酵液、22份不动杆菌（Acinetobactergenospecies 3）DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于木质素分解的细菌复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂按重量份数比还包括15~20份的甘油。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种由多种微生物发酵菌液组成的复合菌剂。

背景技术

木质素是一种广泛存在于植物中的、结构复杂的高分子化合物，它与纤维素、半纤维素等一起构成超分子结构，起到增强植物细胞机械强度的作用。芦苇是一种禾本科草本植物，其广泛分布于东北的辽河三角洲、松嫩平原和三江平原，据统计，上述地区每年芦苇总产量约为300万吨，芦苇因其纤维含量较其他草本植物高，纤维长度较长，一直是草本植物中造纸的优选原料。组成芦苇秸秆的主要成分为木质纤维素，木质素是木质纤维素的组成成分之一，但其也是造纸废水中COD与色度形成的主要原因，因而是否能够有效去除木质素会直接影响抄造、干燥、漂白等造纸制浆工艺过程，这也是制约纤维素有效利用的因素之一。

目前，对造纸原料中木质素去除的预处理方法主要有物理法、化学法以及生物法。物理方法对设备要求高，耗能巨大且效果不显著；化学方法虽效果显著，但其对环境污染及其严重。相对于以上方法，生物方法因其具有对环境造成的污染少，对设备要求低以及成本低廉等优点一直倍受青睐。目前，对于木质素的微生物分解研究较为透彻的为真菌，然而真菌由于生长周期长、单一菌体易受污染等原因并未被投入到大规模的工业生产中。相对于真菌，细菌由于来源广泛、生长快速，因而易于大规模应用。但目前针对细菌对木质素的分解作用的研究相对较少，且研究细菌对木质素分解作用多集中在探索新菌以及新的木质素分解途径方面，对细菌复合菌系对木质素分解作用的研究更是鲜有报道。专利申请号为CN200910072568.3的专利申请公开了一种草类原料清洁制浆的生物制剂，其中包括以漆酶、木素酶等木质纤维素分解酶为主剂的酶类，以白腐真菌以及少量化学制剂为辅剂，该制剂有助于木素的改性，纤维的解离，从而使原料易于转化为纸浆；申请号为CN200910117165.6的专利申请公开了一个生物制浆的微生物复合菌剂，其中包括复合酵母菌与复合纤维素分解菌，而纤维素分解菌包括白腐真菌、康氏木霉、芽支分支霉菌、康氏木霉、子囊菌组成，均非细菌；专利申请号为CN200910248800.4的专利申请公开了一个用于麻梳的生物制浆技术，其中所涉及的菌种为厌氧芽孢杆菌，为细菌单菌。可见研究细菌复合菌系对木质素的分解作用并将其应用于造纸制浆工艺显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前缺少能够分解木质素的细菌复合菌系的问题，而提供一种用于木质素分解的细菌复合菌剂。

 该用于木质素分解的细菌复合菌剂按重量份数比包括25~30份假单胞菌（Pseudomonas sp.）ACCC 11691发酵液、15~25份施式假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DSM 6084发酵液、25~35份微杆菌（Microbacterium sp.）DSM 20618发酵液、20~25份不动杆菌（Acinetobactergenospecies 3）DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

该复合菌剂中的假单胞菌ACCC 11691为好氧细菌，可分解秸秆中的天然木质素以及高聚合度的芳香族化合物，该菌种保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC），保藏号为ACCC No.11691。施式假单胞菌DSM 6084的最适宜温度为30℃，可分解秸秆中天然木质素以及2-甲基萘等低聚合度芳香族化合物，该菌种保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），保藏号为DSM No.6084。微杆菌DSM 20618的最适生长温度为30℃，可分解愈创木酚甘油-B-松泊醇醚（GGE）等木质素基本结构单元，该菌种保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），保藏号为DSM No.20618；不动杆菌DSM 9318可分解丁草胺等低聚合度芳香族化合物，该菌种保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ），保藏号为DSM No.9318。以上四种菌种均可以通过其相应的菌种保藏机构购买获得。

上述四种菌具有高度的协同作用，将该复合菌剂接种于以1g/L碱性木质素为碳源的矿物盐培养基（MSM）中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，碱性木质素的分解率可达19.0%~20.7%。将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养10天，芦苇中木质素分解率可达60.1%，半纤维分解率为40.1%，纤维素分解率为0%；将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养15天，芦苇中木质素分解率可达60.9%，半纤维素分解率为43.0%，纤维素分解率为2.0%。以上数据表明，本发明的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用，其为以纤维素为主要原料的造纸制浆工艺提供了应用基础，为木质素的细菌分解的研究提供了研究基础。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的用于木质素分解的细菌复合菌剂按重量份数比包括25份假单胞菌（Pseudomonas sp.）ACCC 11691发酵液、15份施式假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DSM 6084发酵液、25份微杆菌（Microbacterium sp.）DSM 20618发酵液、20份不动杆菌（Acinetobactergenospecies 3）DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。

该复合菌剂的制备方法的步骤如下：

（一）菌种的活化：将保藏的假单胞菌ACCC 11691、施式假单胞菌DSM 6084、微杆菌DSM 20618以及不动杆菌DSM 9318分别接种于装有50mL活化培养基的100mL三角瓶内，接种量为5%~10%，培养温度为25℃~30℃，培养方式为静止培养。所述的活化培养基为NaNO₃ 2.5~3.0g；KH₂PO₄ 0.8~1.0g；NaCl 0.4~0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.4~0.5g；CaCl₂ 0.05~0.1g；微量元素混合液0.8mL~1mL；碱性木质素1g/L。所述的微量元素混合液为FeCl₃·6H₂O 0.15~0.16g；ZnSO₄·7H₂O 1.4~1.5g；CoCl₂·6H2O 0.15~0.16g；CuSO₄·5H₂O 0.14~0.15g；MnSO₄·H₂O 1.0~1.5g；H₃BO₃ 0.2~0.3g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05~0.1g，蒸馏水1L，pH值为7.5~8.3。 

（二）菌种的扩大培养：将步骤（一）中经活化的菌种培养液分别接种于增殖培养基中，在培养温度为25℃~30℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%~10%的比例转接，当发酵液中的有效活菌数达到10⁹个/mL时终止培养。所述的增殖培养基每升中含：NaNO₃ 2.5~3g；NH₄NO₃ 0.8~1.0g；KH₂PO₄ 0.8~1.0g；NaCl 0.4~0.5；MgSO₄·7H₂O 0.4~0.5g；CaCl₂ 0.05-0.1g；微量元素混合液0.8mL~1mL；碱性木质素1g/L。所述的微量元素混合液为FeCl₃·6H₂O 0.15~0.16g；ZnSO₄·7H₂O 1.4~1.5g；CoCl₂·6H₂O 0.15~0.16g；CuSO₄·5H₂O 0.14~0.15g；MnSO₄·H₂O 1.0~1.5g；H₃BO₃ 0.2~0.3g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.05~0.1g，蒸馏水1L，pH值为7.5-8.3。

（三）复合菌剂的制备：将步骤（二）中得到的菌种发酵液按重量份数比混合后即得到本实施方式的用于木质素分解的细菌复合菌剂。

将本实施方式的复合菌剂接种于以1g/L碱性木质素为碳源的矿物盐培养基（MSM）中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，碱性木质素的分解率可达20.7%。将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养10天，芦苇中木质素分解率可达60.1%，半纤维分解率为40.1%，纤维素分解率为0%；将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，芦苇中木质素分解率可达60.9%，半纤维素分解率为43.0%，纤维素分解率为2.0%。以上数据表明，本实施方式的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用。

所述的矿物盐培养基（MSM）为（g/L）：NaNO₃ 2.5g；KH₂PO₄ 1.0g；NaCl 0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5；CaCl₂ 0.1；微量元素混合液1 mL。

所述的微量元素混合液为（g/L）：FeCl₃·6H₂O 0.16g；ZnSO₄·7H₂O 1.5g；CoCl₂·6H₂O 0.16g；CuSO₄·5H₂O 0.15g；MnSO₄·H₂O 1.5g；H₃BO₃ 0.3g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g。

本实施方式可按重量份数比在复合菌剂中加入15份的甘油，甘油能够使复合菌剂隔绝空气并调节渗透压。

具体实施方式二：本实施方式的用于木质素分解的细菌复合菌剂按重量份数比包括30份假单胞菌ACCC 11691发酵液、25份施式假单胞菌DSM 6084发酵液、35份微杆菌DSM 20618发酵液、25份不动杆菌DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的复合菌剂的制备方法与具体实施方式一相同。

将本实施方式的复合菌剂接种于以1g/L碱性木质素为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，碱性木质素的分解率可达20.1%。将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养10天，芦苇中木质素分解率可达59.9%，半纤维分解率为38.1%，纤维素分解率为0%；将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，芦苇中木质素分解率可达60.1%，半纤维素分解率为42.30%，纤维素分解率为1.8%，以上数据表明，本实施方式的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用。

本实施方式可按重量份数比在复合菌剂中加入20份的甘油，甘油能够使复合菌剂隔绝空气并调节渗透压。

具体实施方式三：本实施方式的用于木质素分解的细菌复合菌剂按重量份数比包括26份假单胞菌ACCC 11691发酵液、16份施式假单胞菌DSM 6084发酵液、26份微杆菌DSM 20618发酵液、21份不动杆菌DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的复合菌剂的制备方法与具体实施方式一相同。

将本实施方式的复合菌剂接种于以1g/L碱性木质素为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，碱性木质素的分解率可达20.2%。将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养10天，芦苇中木质素分解率可达59.2%，半纤维分解率为39.4%，纤维素分解率为0%；将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养15天，芦苇中木质素分解率可达59.8%，半纤维素分解率为42.3%，纤维素分解率为1.7%。以上数据表明，本实施方式的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用。

本实施方式可按重量份数比在复合菌剂中加入16份的甘油，甘油能够使复合菌剂隔绝空气并调节渗透压。

具体实施方式四：本实施方式的用于木质素分解的细菌复合菌剂按重量份数比包括29份假单胞菌ACCC 11691发酵液、24份施式假单胞菌DSM 6084发酵液、34份微杆菌DSM 20618发酵液、24份不动杆菌DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的复合菌剂的制备方法与具体实施方式一相同。

将本实施方式的复合菌剂接种于以1g/L碱性木质素为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，碱性木质素的分解率可达19.9%。将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养10天，芦苇中木质素分解率可达58.6%，半纤维分解率为38.7%，纤维素分解率为0%；将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养15天，芦苇中木质素分解率可达58.9%，半纤维素分解率为40.7%，纤维素分解率为1.6%。以上数据表明，本实施方式的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用。

本实施方式可按重量份数比在复合菌剂中加入19份的甘油，甘油能够使复合菌剂隔绝空气并调节渗透压。

具体实施方式五：本实施方式的用于木质素分解的细菌复合菌剂按重量份数比包括28份假单胞菌ACCC 11691发酵液、20份施式假单胞菌DSM 6084发酵液、30份微杆菌DSM 20618发酵液、22份不动杆菌DSM 9318发酵液；以上四种菌的发酵菌液中的有效活菌数均为10⁹个/mL以上。本实施方式的复合菌剂的制备方法与具体实施方式一相同。

将本实施方式的复合菌剂接种于以1g/L碱性木质素为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养15天，碱性木质素的分解率可达19.0%。将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0，30℃静止培养10天，芦苇中木质素分解率可达60.0%，半纤维分解率为39.9%，纤维素分解率为0%；将该复合菌剂接种于以2%芦苇为碳源的MSM培养基中，初始pH值为8.0， 30℃静止培养15天，芦苇中木质素分解率可达60.4%，半纤维素分解率为40.8%，纤维素分解率为1.9%。以上数据表明，本实施方式的复合菌剂对木质素具有十分显著的分解作用。

本实施方式可按重量份数比在复合菌剂中加入17份的甘油，甘油能够使复合菌剂隔绝空气并调节渗透压。

一种用于木质素分解的细菌复合菌剂专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。