专利摘要

用于鉴定生物流体样品中的抗原或抗体的测试装置，其包含：其上具有亲水表面的基底；所述表面包含收集区以及从其延伸出的至少一个检测区；其中所述生物流体样品可以与特定抗原或抗体混合、沉积在收集区上并且通过毛细管作用被转移至检测区；所述生物流体样品中的抗原或抗体与合适的所述抗体或抗原反应，从而在检测区产生可见的指示。

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定生物流体中的抗原和抗体。尽管本发明将具体参照其在测定人血型中的应用来描述，应理解还可以设想本发明的其他应用。

背景技术

血液对维持组织存活是必不可少的，其最重要的作用是提供氧和其他可溶的营养物、免疫保护以及代谢更新。尽管本身是组织，但从化学意义来说可以认为血液是稳定、高度浓缩的胶体悬浮液，其由包含许多生物分子(例如，白蛋白、脂肪酸、激素)、代谢物和电解质之流体溶液(血清)中所携带的红细胞(红血球，4～6百万/mL，6～8μm)、白细胞(白血球，4000～6000/mL，10～21μm)、血小板(150,000～400,000/mL，2～5μm)组成。这些生物分子的一部分(例如负责组织免疫(抗原)和血型的结合蛋白)直接吸附于血细胞的表面。常见的便携式血液测试法包括分析葡萄糖含量、胆固醇、代谢组(metabolic panel)(钠、钾、碳酸氢盐、血尿素氮、镁、肌酸、钙、甘油三酯)、微生物和疾病标志物以及蛋白质分子谱(肝、前列腺)。令人惊讶的是，尽管至关重要，仍没有可以对血型进行“现场(on the spot)”分析的方便、低成本、一次性的测试。血液样品通常外包至分析实验室。能立即且可信地提供关键的血液分析而无需精密实验室分析仪器(例如，层析和光谱方法)的可信低成本测试会对提高经济资源有限的发展中国家的人民健康有很大价值。血液分析在非人应用(例如，兽医学)中也很重要，需要适于现场使用的低成本且通用的装置。

发明内容

鉴于此，根据本发明的一个方面，提供了用于鉴定生物流体样品中的抗原或抗体的测试装置，其包含；

其上具有亲水表面的基底；

所述表面包含收集区以及从其延伸出的至少一个检测区；

其中所述生物流体样品可与特异性抗原或抗体混合、沉积在收集区上并且通过毛细管作用被转移至检测区；

所述生物流体样品中的抗原或抗体与合适的所述抗体或抗原反应，从而在检测区产生可见的指示。

根据本发明的另一个方面，提供了用于鉴定生物流体样品中的抗原或抗体的测试装置，其包含：

其上具有亲水表面的基底；

所述表面包含收集区以及从其延伸出的至少一个检测区；

所述检测区具有固定于其中的抗体或抗原；

其中所述生物流体样品可沉积在收集区上并且通过毛细管作用被转移至检测区；

所述生物流体样品中的抗原或抗体与检测区中合适的所述抗体或抗原反应，从而在检测区产生可见的指示。

基底可以由纸或其他纤维素物质形成。或者，基底可以在其上包含层析层或者可以是可湿性多孔介质。

被测试的生物流体样品可优选地是血液，可见的指示可产生自与特异抗体反应后的血液凝集，其导致血液在检测区中芯吸(wicking)和/或分离的降低。

基底表面上可以具有限定出收集区和检测区的亲水微流体通道图案。优选地，从收集区可以延伸出多个检测区。

已发现由特异性抗原相互作用所触发的红细胞凝集极大地降低纸或层析介质上的血液芯吸和分散。该凝集过程还相当大地增强单个血液成分的层析分离(洗脱)，尤其是红细胞从血清中的分离。本发明的测试装置由于其可见的指示而可以允许直接分析血细胞。这可以用内置于装置中的检测/报告系统或者与其他离线分析设备联合进行即时实现。所述测试装置还可允许鉴定和定量特异性生物分子(例如，抗原和抗体)，其基于所诱导的凝固和之后来自血液样品的可溶蛋白质级分在多孔基底上的芯吸和洗脱(分离)而进行。其凝固直接影响其芯吸/分离的血液胶体可以存在于目的流体中(例如，血液的红细胞)或作为纳米颗粒(金、银、微硅粉(micro-silica)、沸石、二氧化钛等)而引入。在后一种情况下，纳米颗粒通常覆盖有用作敏感报道分子成分的感兴趣的特异性的反生物分子或分子。胶体颗粒的大小可以是1nm至100μm，并且可以将其引入被分析的生物流体中。

在本发明用于测定血型的应用中，本发明可测定存在于血液样品中的抗原，所述抗原决定血型是否是A、B、O、AB型和恒河猴(Rhesus)/-型。将抗体A、B和D(恒河猴)沉积到分别的检测区中。还可优选的是在检测区之一中包括未处理对照区。随后将血液滴沉积在中央收集区上，血液样品通过毛细管作用被转移至每个检测区。当血液样品接触适当抗体后，红细胞抗原与其对应抗体的反应导致红细胞凝集或凝固。该凝集使血液样品沿提供检测区之微流体通道运动的速度降低并使血细胞与血清分离。血液样品沿其他具有非特异性抗体之检测区移动的速度不受影响。这种可见的差异便于容易且快速地鉴定血液样品的血型。

本申请人开发了低成本纸基微流体系统，其在国际专利申请no.PCT/AU2009/000889(其详细内容通过引用并入本文)中描述，其细节通过引用并入本文。在该申请中描述的微流体系统使用纸基基底，所描述的制造方法在纸基基底上产生亲水微流体通道。应注意该申请中所使用的术语“纸”是指所有纤维素物质，包括织物和非织物纤维素物质以及纸。在这些申请中描述的微流体系统可以容易地适用于本发明目的。

本发明的测试装置还可以用于检测由血细胞形状异常的血细胞功能障碍所导致的疾病(如疟疾中的情况)。或者，本发明的测试装置可以用于通过鉴定抗原、抗体、病毒(例如，HIV、流感)或蛋白质的存在来检测疾病。

在所述国际申请中，通过将疏水试剂印制在基底表面以限定微流体通道的外边沿来制造微流体通道。根据本发明，还可以将抗体或抗原印制在微流体通道中。所用技术(即喷墨印刷技术)也可以用于将抗原或抗体印制在微流体通道中。

根据本发明的另一个方面，提供了用于鉴定生物流体样品中的抗原或抗体的方法，其包括：

将所述生物流体样品与特异性抗原或抗体混合，

将混合的生物流体样品沉积在测试装置的收集区上，所述测试装置包含其上具有亲水表面的基底，所述表面包含所述收集区和从其延伸出的至少一个检测区，生物流体样品通过毛细管作用被转移至检测区；和

通过在所述生物流体样品中的抗原或抗体与适当的所述抗体或抗原反应后在所述检测区中所产生的可见指示来鉴定所述抗原或抗体。

根据本发明的另一个方面，提供了用于鉴定生物流体样品中的抗原或抗体的方法，其包括：

将生物流体样品沉积在测试装置的收集区上，所述测试装置包含其上具有亲水表面的基底，所述表面包含所述收集区和从其延伸出的至少一个检测区，所述检测区具有固定于其中的抗体或抗原，生物流体样品通过毛细管作用被转移至检测区；和

通过在所述生物流体样品中的抗原或抗体与适当的所述抗体或抗原反应后在所述检测区中所产生的可见指示来鉴定所述抗原或抗体。

附图说明

参照附图进一步描述本发明是便利的，附图说明了本发明测试装置的一些优选的实施方案。本发明可有其他实施方案，因此不应将附图的具体内容理解为取代本发明的以上描述。

在附图中：

图1显示用于测定B+血液的本发明测试装置；

图2显示用于测定O+血液的本发明测试装置；

图3显示用于测定AB+和B+血液的本发明测试装置；

图4是显示作为时间之函数的血液芯吸和血液分离的本发明测试装置；

图5显示整合了阀的本发明测试装置；

图6A～F显示整合了阀和开关的本发明测试装置的运行；

图7是适用于测试不同血型的本发明测试装置的示意图；和

图8显示图7的测试装置，其中显示红细胞从血清中的分离。

具体实施方式

本申请人发现由特异性抗体-抗原相互作用介导的血液凝集极大地影响其与纸或任何薄层层析表面接触后的分离行为。本发明依赖于该生物化学现象以控制芯吸和分离的速率，这使得能够(i)鉴定和定量评价特异性抗体/抗原，(ii)血型检定，而且潜在地(iii)鉴定血源性病原体以作为对疾病的诊断。本发明主要旨在应用于人和兽医学以及生物技术。

用于检测血液凝集的标准技术通常是手动操作工的，涉及在载玻片上分散抗体并进行显微可视化(microscopic visualization)。然而，凝集的可视化通常是主观的，它的自动化需要精密的分析设备。本发明提供了简化的并且避免这些困难的单步骤血液测试。

本发明的一种应用涉及两步法，其中首先通过将血液样品与特异性目的抗体/抗原组合来使其凝固/凝集，随后将其沉积在分析基底(例如，非织物的纸或多孔网)上，在该基底上直接或间接测量通过洗脱/层析进行的样品芯吸和分离。可以通过使用内置阀和通道控制部件在纸基底上混合来加强并且更精确地进行这两个混合步骤。

本发明的第二种应用涉及单步法，其中将生物流体/样品直接沉积在预先已用特异性抗原/抗体处理的基底/装置上。对于该方法，分析物样品在同一基底上同时凝固和洗脱。所测量的洗脱速度和样品分离程度与凝固程度直接相关，这使要检测的生物分子的浓度被同时检测和定量。

本发明的两种应用可以施用至由纸或任何非织物层析表面(其相对划算)制成的测试装置上。还可用高级印刷技术对这些基底进行改造以产生由疏水物质制成的微流体部件，如之前在申请人的国际申请no.PCT/AU2009/000889中描述的那样。与使用印刷进行直接抗体沉积方法相联合，抗体试剂的制造和放置可使得能够在纸基底中非常准确地对血流进行空间控制。

实施例

实施例1：依次进行血液凝集/凝固和随后在纸上的芯吸：B+(两步法)(见图1)

使用抗体A和B(Epiclone^TM抗A、抗B和抗D；CSL，Australia)溶液。抗A和抗B分别为蓝色和黄色试剂。在本研究中使用“B+”血液。将血液样品装入具有抗凝剂的塑料瓶。将“B+”血液分别与纯抗A和抗B(按收到的原样使用)混合以制备100μL溶液。纸条(70mm×2mm)由Whatman#4滤纸制成，其上印制有2mm单位标记。使纸条浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用标准印迹纸(Drink Coster Blotting，280GSM)从纸条上去除过量的PBS。随后将纸条放置在Reflex Paper(80GSM)上。使用有刻度的微量加样器在纸条的中央分散20μL每种混合溶液。芯吸4分钟后拍照。

可见：

与抗体A溶液混合的B+血液被芯吸，并且在混合和纸洗脱/芯吸后没有分离。

与抗体B溶液混合的B+血液被芯吸且明显地分离(红细胞从血清中分离)，并且显示芯吸。

与抗体D(恒河猴+)溶液混合的B+血液被芯吸且明显地分离(红细胞从血清中分离)。

与其特异性抗体接触后凝集/凝固的血液样品在与纸接触后被分离/洗脱(在此是血液B+与抗B和抗D抗体)。

与非特异性抗体接触的血液样品(在此是血液B+与抗A)不凝集，并且在与纸接触后不分离/洗脱。

可以利用血液/抗体混合的洗脱/分离中的这种显著的差异来传达特异性凝集，从而可被用于鉴定血型。

实施例2：依次进行血液凝集/凝固和随后在纸上的芯吸：O+(两步法)(见图2)

使用抗体A和B(Epiclone^TM抗A、抗B和抗D；CSL，Australia)溶液。抗A和抗B分别为蓝色和黄色试剂。在本研究中使用“O+”血液。将血液样品装入具有抗凝剂的塑料瓶。将“O+”血液分别与抗A和抗B混合以制备100μL溶液。纸条(70mm×2mm)由Whatman#4滤纸制成，其上印制有2mm单位标记。使纸条浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用标准印迹纸(Drink Coster Blotting，280GSM)从纸条上去除过量的PBS。随后将纸条放置在Reflex Paper(80GSM)上。使用有刻度的微量加样器在纸条的中央分散20μL每种混合溶液。芯吸4分钟后拍照。

可见：

与抗体A溶液混合的O+血液被芯吸，并且在混合和纸洗脱/芯吸后没有分离。

与抗体B溶液混合的O+血液被芯吸且未分离(红细胞从血清中分离)，并且显示芯吸。

与抗体D(恒河猴+)溶液混合的O+血液被芯吸且明显地分离(红细胞从血清中分离)。

与其特异性抗体接触后凝集/凝固的血液样品在与纸接触后被分离/洗脱(在此是血液O+与抗D抗体)。

与非特异性抗体接触的血液样品(在此是血液O+与抗A和抗B)不凝集，并且在与纸接触后不分离/洗脱。

可以利用血液/抗体混合的洗脱/分离的这种显著差异来传达特异性凝集，从而可被用于鉴定血型。

实施例3：血液凝集/凝固随后的纸芯吸同时进行：抗原浓度的作用(一步法)(见图3)

在本发明的另一个实施方案中，在暴露于纯血样品前首先用特异性抗体处理纸、干燥或使其条件化(conditioned)。该实施例提供单步骤处理，其中唯一的需要是将血液滴沉积在纸上。该实施例还说明了稀释抗体溶液对血液在纸上之芯吸和分离性能的影响。抗体稀释影响血液(具有其抗原)抗体比。

使用抗体A和B(Epiclone^TM抗A和抗B；CSL，Australia)溶液。抗A和抗B分别为蓝色和黄色试剂。在本研究中使用“AB+”和“B+”血液。将血液样品装入具有抗凝剂的塑料瓶。纸条(70mm×2mm)由Whatman#4滤纸制成，其上印制有2mm单位标记。使纸条浸入不同浓度(抗A1.0×、0.8×、0.6×、0.4×、0.2×和0.0×)的抗体溶液中；用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为稀释剂。使用印迹纸从纸条上去除过量的PBS。随后将抗体(抗A)活性纸条放置在Reflex Paper上。使用有刻度的微量加样器在纸条的中央分散20μL的血液滴。测量中央至两个方向的芯吸距离。10分钟后拍照。

结果显示于图3。可见：

血液在用其特异性抗体处理的纸上芯吸后分离。

血液分离是所处理纸上抗体浓度的非线性函数。抗体浓度越高，细胞从血清中分离越具突跃性。

有最佳的浓度以使芯吸/分离/可视化最大化。

红细胞与其特异性抗体接触后的凝固显著降低其在层析表面上的芯吸/扩散速度，这促使细胞从血清中分离。这种洗脱速度的显著降低和差异可作为血型的直接指示。

实施例4：时间对血液在生物活性抗体纸上之芯吸/分离的作用(见图4)

在本发明的另一个实施方案中，在暴露于纯血样品前首先用特异性抗体处理纸、干燥或使其条件化。该实施例说明了血液-经抗体处理的纸的接触后间对血液在纸上的芯吸和分离性能的影响。

使用抗体A和B(Epiclone^TM抗A；CSL，Australia)溶液。抗A为蓝色试剂。在本研究中使用“AB+”血液。将血液样品装入具有抗凝剂的塑料瓶。纸条(70mm×2mm)由Whatman#4滤纸制成，其上印制有2mm单位标记。使纸条浸入抗体溶液(抗A)中；用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为稀释剂。使用印迹纸从纸条上去除过量的PBS。随后将抗体(抗A)活性纸条放置在Reflex Paper上。使用有刻度的微量加样器在纸条的中央分散20μL的血液滴。测量从中央向两个方向上的芯吸距离。在不同时间间隔后拍照。

可见：

约4分钟后血液芯吸/分离趋于稳定。

有允许恰当血液凝固/凝集和芯吸/分离所需的抗体/血液接触的最短时间。

有血液-抗体-纸接触的最佳时间。时间太短，血液不会恰当地凝集；时间太长，红细胞从血清中的分离可丧失一些锐度(sharpness)。

实施例5：控制流动、反应和稀释度的纸微流体系统(见图5)

在本发明的一个实施方案中，可以使用纸基微流体反应器来进行血型测试。将特异性抗体印制到在纸上设计的反应器中。随后将血细胞悬液引入同一反应器。经过所需的时间段以使抗体和细胞悬液可以接触并混合。在预定的时间段后，关闭反应器的阀以方便血液渗透穿过阀。如果仅观察到血清渗透，则测试是阳性的，这是由于混合期间血液的凝集。如果观察到血液渗透，则测试是阴性的。因此纸基微流体反应器可提供血型的快速可见测试。

实施例6：具有阀的微流体系统(见图6)

可以设计纸微流体装置以提高血液/抗体比并提供允许血液和抗体在测试前相互作用的所需时间延迟。本实施例表明所有这些步骤可以使用纸装置来进行。图6显示所述纸装置的设计。(A)印制滤纸片并如所述进行切割，在环状区域中印制或沉积特异性抗体。在装置的右手边制作纸开关。(B)将血液样品引入所示区域。(C)按照所示朝向血液样品折叠切割的纸。(D)使血液样品与加载了抗体的纸保持接触一段时间。(E)在短时间的接触后，按照所示关闭开关。如果测试是阳性的，则血液会凝聚，只有血清会沿开关芯吸。(F)在短时间的接触后，如所示关闭开关。如果测试是阴性的，则血液不会凝聚并且沿开关芯吸。

实施例7：用于血型检定的纸微流体系统(见图7)

在本发明的另一个实施方案中，将微流体系统印制在纸或层析介质上，将抗体A、B和D(恒河猴)印制到3个检测臂的每个上。通过在中央池放置血液滴来分析血型，读取结果。所有不同的血型组合及其表现显示在图7中。

实施例8：RBC/血清在纸上的层析分离(见图8)

图8显示在抗体活性纸表面使用层析分离红细胞(RBC)和血清来检测血型；(a)纸生物测定中层析分离的示意图；(b)和(c)(I)分别为使用A+血液样品的试验1和2；(b)(II)、(c)(II)分别为更好的分辨率下的(b)(I)、(c)(I)的经转换的图像(RGB色至BRG色)。

本领域技术人员认为显而易见的修改和变化包括在所附权利要求书所要求的本发明范围之内。

用于鉴定生物流体中的抗原和抗体的测试装置专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。