专利摘要

本发明提供了一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法，制备方法包括：(1)将透明质酸、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、1‑羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇反应，制得HA‑SH；(2)将罗丹明接枝于HA‑SH上，制得RhB‑HA‑SH；(3)将Fe3O4纳米粒、RhB‑HA‑SH和H2O2反应，制得超顺磁性荧光HA‑SH；(4)超顺磁性荧光HA‑SH、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、1‑羟基苯并三唑、PEG‑FA和anti‑EpCAM抗体反应，制得。该磁性材料饱和磁化强度高，磁响应性和生物相容性好，能够实现与循环肿瘤细胞的特异性结合，并具有一定的普适性。

权利要求

1.一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇混合，进行反应，制得HA-SH；

(2)将罗丹明接枝于HA-SH上，制得RhB-HA-SH；

(3)将Fe₃O₄纳米粒、RhB-HA-SH和H₂O₂反应，制得超顺磁性荧光HA-SH；

(4)将超顺磁性荧光HA-SH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、PEG-FA和anti-EpCAM抗体反应，制备靶向功能超顺磁性荧光HA-SH。

2.根据权利要求1所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体过程为：将透明质酸溶于PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，搅拌反应2-3h，然后再加入胱胺盐酸盐搅拌过夜，最后加入二硫苏糖醇继续反应24-36h，制得HA-SH；其中，透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比为1-2:2-4:2-4:2-4:3-6。

3.根据权利要求1或2所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比为1:3:3:3:5。

4.根据权利要求1所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体过程为：将Fe₃O₄纳米粒分散在氯仿中，RhB-HA-SH溶于去离子水中，然后将两者混合，置于冰浴中，超声分散3-4次，最后一次分散时加入H₂O₂，然后将所得物用PBS缓冲液洗涤，制得磁性荧光HA-SH；其中Fe₃O₄纳米粒和RhB-HA-SH的重量比为1-3:1-3。

5.根据权利要求1或4所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中Fe₃O₄纳米粒和RhB-HA-SH的重量比为1:1。

6.根据权利要求5所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中Fe₃O₄纳米粒通过以下方法制备得到：将乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇、油酸、油胺和苄醚混合，在氮气保护下升温至200℃，升温速率20℃/3min，保温2h；然后继续加热升温至300℃，回流1h，待回流产物冷却至室温后，加乙醇磁分离，再用正己烷溶解，最后真空干燥，制得；其中乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇、油酸和油胺的摩尔比为1:5:3:3。

7.根据权利要求1所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体过程为：将超顺磁性荧光HA-SH加入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑的PBS溶液中，于4℃反应3-5h，然后磁分离弃去上清液，然后分散于PBS中，接着加入PEG-FA，室温反应3-5h后置于4℃，再加入anti-EpCAM抗体反应5-7h，所得物经磁分离后用PBS洗涤。

8.根据权利要求1或7所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中超顺磁性荧光HA-SH的浓度为1mg/mL。

9.根据权利要求1或7所述的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中超顺磁性荧光HA-SH、含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、PEG-FA和anti-EpCAM抗体的重量比为1:95-100:65-70:1-3:0.005-0.015。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法制得的用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料。

说明书

技术领域

本发明属于磁性材料技术领域，具体涉及一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法。

背景技术

近年来，恶性肿瘤已逐渐成为危害人类健康的重大疾病之一。其较高的发病率和居高不下的致死率引起了医生和科学工作者等在内的众多领域研究者们的关注。癌症相关细胞/因子的早期检测在癌症的诊疗和预后监测方面发挥着至关重要的作用。临床实践表明，原发组织的恶性肿瘤一般不会直接导致患者的死亡，而肿瘤转移大大降低了肿瘤患者的存活率，因此，肿瘤转移的早期诊断和检测对提高患者的存活率具有重要的现实意义。

循环肿瘤细胞(CTCs)，是一种游离在肿瘤转移患者血液循环系统的具有侵袭能力的肿瘤细胞，可以通过一种非侵袭的方式从患者血液中分离出来，用以监测患者的病程状况。因此，CTCs检测，也被称为“液态活检”，在癌症的早期诊断和诊疗预后方面发挥着越来越重要的作用。

目前，研究者们利用不同的功能化策略构建多功能的超顺磁性纳米材料体系，用以快速精确检测循环系统中存在的极少量的CTCs，以期为肿瘤早期诊断和治疗预后等临床研究提供具有指导意义的理论依据。其中，大多数方案均使用上皮细胞粘附因子抗体(anti-EpCAM抗体)作为靶向功能分子用以实现对CTCs的靶向识别和捕获。然而，临床研究表明，由于不同CTCs表面EpCAM的表达量具有明显差异，甚至有些具有侵袭能力的肿瘤细胞不表达，这导致这一类功能化策略受到明显的限制。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于循环肿瘤细胞高效检测的磁性材料及其制备方法，该磁性材料具有粒径分布窄，饱和磁化强度高，磁响应性和生物相容性好等优点，多靶向配体的应用使该磁性材料能够实现与循环肿瘤细胞(CTCs)的特异性结合，并对多种肿瘤细胞具有一定的普适性。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料，其制备方法包括以下步骤：

(1)将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇混合，进行反应，制得HA-SH；

(2)将罗丹明接枝于HA-SH上，制得RhB-HA-SH；

(3)将Fe₃O₄纳米粒、RhB-HA-SH和H₂O₂反应，制得超顺磁性荧光HA-SH；

(4)将超顺磁性荧光HA-SH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、PEG-FA和anti-EpCAM抗体反应，制备靶向功能超顺磁性荧光HA-SH。

进一步地，步骤(1)具体过程为：将透明质酸溶于PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，搅拌反应2-3h，然后再加入胱胺盐酸盐搅拌过夜，最后加入二硫苏糖醇继续反应24-36h，制得HA-SH；其中，透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比为1-2:2-4:2-4:2-4:3-6。

进一步地，步骤(1)中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、胱胺盐酸盐和二硫苏糖醇的摩尔比为1:3:3:3:5。

进一步地，步骤(3)具体过程为：将Fe₃O₄纳米粒分散在氯仿中，RhB-HA-SH溶于去离子水中，然后将两者混合，置于冰浴中，超声分散3-4次，最后一次分散时加入H₂O₂，然后将所得物用PBS缓冲液洗涤，制得磁性荧光HA-SH；其中Fe₃O₄纳米粒和RhB-HA-SH的重量比为1-3:1-3。

进一步地，Fe₃O₄纳米粒和RhB-HA-SH的重量比为1:1。

进一步地，步骤(3)中Fe₃O₄纳米粒通过以下方法制备得到：将乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇、油酸、油胺和苄醚混合，在氮气保护下升温至200℃，升温速率20℃/3min，保温2h；然后继续加热升温至300℃，回流1h，待回流产物冷却至室温后，加乙醇磁分离，再用正己烷溶解，最后真空干燥，制得；其中乙酰丙酮铁、1,2-十六烷二醇、油酸和油胺的摩尔比为1:5:3:3。

进一步地，步骤(4)具体过程为：将超顺磁性荧光HA-SH加入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑的PBS溶液中，于4℃反应3-5h，然后磁分离弃去上清液，然后分散于PBS中，接着加入PEG-FA，室温反应3-5h后置于4℃，再加入anti-EpCAM抗体反应5-7h，所得物经磁分离后用PBS洗涤。

进一步地，步骤(4)中超顺磁性荧光HA-SH的浓度为1mg/mL。

进一步地，步骤(4)中超顺磁性荧光HA-SH、含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、PEG-FA和anti-EpCAM抗体的重量比为1:95-100:65-70:1-3:0.005-0.015。

本发明提供的一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法，具有以下有益效果：

(1)该磁性材料具有粒径分布窄，饱和磁化强度高，磁响应性和生物相容性好等优点，多靶向配体的应用使该磁性材料能够实现与循环肿瘤细胞(CTCs)的特异性结合，并对多种肿瘤细胞具有一定的普适性。

(2)TMCs对MCF-7-GFP细胞具有强烈的特异性作用；同时与Jurkat T细胞相比，TMCs对MCF-7-GFP细胞具有更高的亲和能力，TMCs对MCF-7-GFP细胞的捕获效率高达87％。

(3)本发明制得的磁性材料在混合细胞体系中，在大量干扰细胞(约10⁶个/mL Jurkat T细胞)条件下，该多靶向TMCs对MCF-7-GFP细胞的捕获率约为88％，且其相应检测限约为50个/10⁶个(MCF-7-GFP/Jurkat T)，说明该磁性材料不受其他干扰细胞的影响，可有效捕获肿瘤细胞。

(4)对TMCs捕获的肿瘤细胞进行再培养实验后，其肿瘤细胞仍保持良好的生长活力和较强的增殖能力，说明本发明制得的磁性材料对肿瘤细胞不会造成伤害，可有效捕获肿瘤细胞，用于临床研究。

附图说明

图1为MCs的性能表征图。

图2为MCs的磁化曲线结果图。

图3为MCs的TGA曲线结果图。

图4为TMCs的合成示意图。

图5为TMCs表面anti-EpCAM抗体的验证结果图。

图6为MCF-7-GFP细胞与不同浓度TMCs孵育后捕获的细胞荧光照片。

图7为单细胞体系中，TMCs对不同种类细胞的捕获率结果。

图8为MCF-7-GFP和Jurkat T混合细胞体系与TMCs作用前后的共聚焦荧光照片。

图9为混合细胞体系中，TMCs对MCF-7-GFP细胞和Jurkat T细胞的捕获率和相对选择性结果。

图10为TMCs对混合细胞体系中不同数目MCF-7-GFP细胞(20-500个/mL)捕获的状态图及相应线性拟合图。

图11为TMCs捕获的MCF-7-GFP细胞和/或Jurkat T细胞的放大图。

图12为TMCs捕获后MCF-7-GFP细胞的再培养及传代培养结果。

图13为不同时间点伤口愈合实验照片及伤口愈合面积比率。

具体实施方式

实施例1 罗丹明(RhB)标记的HA-SH的合成

将透明质酸HA(Mw＝100KD，806mg，2mmol)溶于200mL PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)中，待HA完全溶解后，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC(1.15g，6mmol)和1-羟基苯并三唑HOBt(0.81g，6mmol)，然后置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，然后称取胱胺盐酸盐(1.35g，6mmol)加入反应体系，磁力搅拌反应过夜，将所得反应液透析以除去未反应的反应物，用去离子水透析24h。取二硫苏糖醇DTT(1.54g，10mmol)加入透析后反应液中继续反应24h后，将反应液转移至透析袋中，用去离子水透析2天以除去未反应的DTT，制得HA-SH。

采取上述同样的缩合方法将RhB接枝于HA-SH上即可得RhB标记的HA-SH，记为RhB-HA-SH。

取HA-SH(0.2g，0.5mmol)溶于50mL PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)中，待完全溶解后，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC(0.29g，1.5mmol)和1-羟基苯并三唑HOBt(0.20g，1.5mmol)，然后置于磁力搅拌器上磁力搅拌2h，再加入RhB(0.014g，0.037mmol)，避光，磁力搅拌反应过夜。将所得反应液透析以除去未反应的反应物，用去离子水透析24h，冻干后低温避光保存。

实施例2 超顺磁性荧光HA-SH胶囊(magneticcapsules,MCs)的制备

取10mg Fe₃O₄纳米粒(Fe₃O₄ NPs)分散在1mL氯仿中，10mg RhB-HA-SH溶于25mL去离子水中，将两者混合后置于冰浴中。用细胞破碎仪超声处理3次，每次处理5min(570W)，在第3次处理时加入1mL H₂O₂以促进巯基交联，将所得物进行磁分离(磁分离为将样品放在磁铁上富集)，磁分离结束后弃去上清液，并用PBS缓冲液洗涤数次，最后调整浓度至1mg/mL，制得超顺磁性荧光HA-SH胶囊。

其中，Fe₃O₄纳米粒通过高温分解法制备，具体过程如下：体系除水除氧后，将乙酰丙酮铁(2mmol)、1,2-十六烷二醇(10mmol)、油酸(6mmol)、油胺(6mmol)和苄醚(约20mL)在氮气保护下搅拌混合并缓慢升温至200℃，升温速率20℃/3min，保温2h；然后继续加热升温至300℃，回流1h。待冷却至室温，转移墨绿色/黑色液体至250mL锥形瓶，加入适量乙醇磁分离沉淀产物，3500rpm(低速离心)离心5min，弃去上层无色液体，并用少量正己烷分散黑色沉淀，然后再置于8000rpm(高速离心)离心10min，弃去沉淀，收集上层黑色分散液并加入适量乙醇进行磁分离沉淀；重复低速离心收集黑色沉淀，并重新分散在正己烷中，旋转蒸发并真空干燥得到黑色Fe₃O₄纳米粒粉末，充入氮气密封保存备用。

MCs的性能表征图及磁化曲线和TGA曲线见图1-3；其中，图1中a为MCs的SEM图片和粒径分布图(图中小图部分)，b为MCs的TEM图及局部放大图(图中的小图部分)。图2为MCs的磁化曲线结果图。图3为MCs的TGA曲线结果图。

SEM照片结果显示，所制得的MCs呈中空胶囊结构，粒径较为均一，约190.8±20.2nm，这一结果与DLS数据相吻合(图1a小图)。TEM照片进一步证实了这种中空壳层结构。由于TEM照片是三维结构在二维平面上的投影，所以我们在TEM照片上观察到纳米粒(深色)在中空结构边缘部形成颜色较深区域，如图1b所示。另外，测试得MCs悬浮液的Zeta电位约-23.8mV，表明大量羧基的存在，从而为进一步的功能化奠定了基础。

如图2所示，与Fe₃O₄纳米粒子相比，纳米复合球的饱和磁化强度从61emu/g降至42emu/g，这可能是因为MCs中HA-SH壳层较薄，Fe₃O₄的含量较高。同时也说明HA-SH的交联对纳米粒子的磁性能没有明显影响。由磁化曲线原点附近区域的细节可以看出，磁化曲线上几乎可忽略的剩磁和矫顽力表明MCs在室温下均表现出超顺磁性。

由TGA数据分析可知在200℃～500℃范围内，HA-SH和其它有机物均已分解殆尽，因此我们假设在500℃时，测试样品中所剩余的即为Fe₃O₄磁纳米粒。如图3所示，500℃时，Fe₃O₄纳米粒子的质量略有降低，但其质量仍剩余约84％。而在同样温度下，MCs中HA-SH被分解殆尽，质量减少约29％，剩余Fe₃O₄纳米粒子质量约为71％，这一较高的磁含量保证了MCs具有较高的饱和磁化强度，与VSM数据相一致。

综上所述，所制备的具有中空囊状结构的MCs保有优异的超顺磁性和较高的饱和磁化强度，其表面丰富的羧基为进一步功能化供了结构和功能基础，进而为CTCs的体外识别和检测提供了可能。

实施例3 靶向功能超顺磁性荧光HA-SH胶囊(TMCs)的制备

TMCs的合成过程如图4所示。取约5mL MCs悬浮液，加入含1MEDC和1M HOBt的PBS溶液2.5mL，4℃缓慢摇晃4h以活化MCs，然后磁分离弃去上层清液并将活化后的MCs重新分散于PBS中。取10mg PEG-FA加入并室温反应4h后转移至4℃，并加入约50μg anti-EpCAM抗体继续反应6h。所得产物经磁分离收集并用PBS缓冲液洗涤数次以除去未反应的反应物，置于4℃保存备用。

对上述反应产物进行验证，验证过程为：取适量TMCs与适量Goat Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)在4℃孵育30min。用PBS溶液洗涤三次后重新分散在PBS中，并在荧光显微镜下观察，验证结果见图5。由图5可知图中绿色荧光为FITC标记的二抗，由此可知我们利用二抗验证了TMCs成功结合了anti-EpCAM抗体；TMCs自身的红色荧光与二抗发射的绿色荧光在各自视图下都比较明显，在组合视图下能够完全重合，表明anti-EpCAM抗体成功引入到MCs上。

实施例4 细胞靶向与捕获实验

1、单细胞体系

为研究TMCs与细胞之间的相互作用，我们通过细胞计数的方法计算了TMCs对不同细胞的捕获率，并做了相应分析。

具体步骤和过程简述如下：取适量细胞悬浮液分别与1mL含有不同TMCs浓度的10％FBS的PBS缓冲液在细胞培养箱中孵育15min，然后对细胞悬浮液进行磁分离富集TMCs识别的细胞，同时收集TMCs未识别的细胞。接下来用细胞计数仪(Coun-terStar)对相应细胞进行计数分析，同时，已捕获的细胞重新分散在300μL培养基中并接种于35mm玻底皿中继续培养。培养数小时后，用Hoechst 33342(blue，20μM)对MCF-7-GFP细胞染色15皿，并在外加磁场作用下用PBS润洗三次后加入适量PBS以备共聚焦荧光显微镜测试(CLSM)。图6为MCF-7-GFP细胞与不同浓度TMCs孵育后捕获的细胞荧光照片(a-e，标尺为10μm)和细胞局部放大图(f，标尺为5μm)(用Hoechst 33342(蓝色)染细胞核)。

由图6可知，随着TMCs浓度的增加，MCF-7细胞周围TMCs的数量也有所增加；当浓度增加至0.3mg/mL时，TMCs已足以与肿瘤细胞结合。另外，大部分与靶向细胞结合的TMCs在细胞上的分布均有一定规律，即TMCs大多分布于细胞表面其中一部分区域，而非随机均匀于整个细胞表面。取图c样品中细胞作局部特写(图f)，亦作进一步证实。其中原因可能是在外加磁场中分离TMCs捕获的靶向细胞时，TMCs对外加磁场的响应更快速，导致其更倾向于运动到靶向细胞与磁铁之间，从而形成在细胞表面聚集分布的现象。

上述细胞经固定干燥后用SEM观察其形貌，并作EDS分析。

细胞捕获率通过以下公式计算得到：

细胞捕获率/％＝(N₀-N₁)/N₀×100％

其中，N₀为TMCs孵育前细胞总数，N₁为TMCs孵育后未识别的细胞数。

同时，为验证TMCs与EpCAM高表达细胞的特异性作用，在其他参数相同条件下，我们分别计算了TMCs对Jurkat T、MCF-7-GFP、HepG2和Hela等细胞的捕获率，其结果见图7。

由图7可知，本发明制备的TMCs对MCF-7-GFP细胞的捕获效率高达87％，说明TMCs对MCF-7-GFP细胞具有强烈的特异性作用；同时与Jurkat T细胞相比，TMCs对MCF-7-GFP细胞具有更高的亲和能力。

2、混合细胞体系

为计算TMCs对MCF-7-GFP细胞的检测限，并研究其在大量干扰细胞(约10⁶个/mL Jurkat T细胞)条件下对MCF-7-GFP细胞的识别能力，我们测试了TMCs对混合细胞体系中不同数目MCF-7-GFP细胞的捕获。具体而言，向六组样品中分别加入20，50，100，200，300和500个MCF-7-GFP细胞，与大量T细胞充分混合后按照0.3mg/mL材料浓度分别加入相应量的TMCs，于细胞培养箱中孵育15min后进行磁分离并弃去为识别捕获的细胞；将捕获所得细胞重新分散于500μL PBS，并五等份分别加入96孔板中，在荧光显微镜下分区域尽可能完全地对所有视野进行拍照，并对视场中呈绿色荧光的细胞逐一计数并换算得其相应捕获效率，结果见图8和9。

图8为MCF-7-GFP和Jurkat T混合细胞体系与TMCs作用前后的共聚焦荧光照片；其中，a为捕获前，b为捕获后，c为未捕获的细胞；两种细胞均用Hoechst33342染色。

为提高两种细胞在共聚焦显微镜下的辨识度并清楚地观察MCF-7-GFP(绿色)细胞，我们以两种细胞数量比约1:1构建混合细胞体系。在该混合体系中，所有细胞均用Hoechst 33342(细胞核，蓝色)预处理，实验前后分别用共聚焦显微镜观察TMCs对样本中MCF-7-GFP的捕获情况，如图8所示。捕获实验前，样本中MCF-7-GFP细胞约占总细胞数的50％(图8a)；其中，在激发光下，所有细胞细胞核均呈蓝色，且MCF-7-GFP呈明显绿色荧光。经TMCs捕获富集后(图8b)，在可观察范围内，视野中均为绿色的MCF-7-GFP细胞，表明TMCs对混合细胞体系中MCF-7-GFP具有较好的选择性作用。为验证这一推断，我们取磁分离后弃去的细胞悬浮液在同等条件下观察(图8c)，视野中仅有蓝色荧光点，而未见明显的绿色荧光，表明该细胞悬浮液中含有大量的Jurkat T细胞，而含有极少量或不含有MCF-7-GFP细胞。

图9为混合细胞体系中，TMCs对MCF-7-GFP细胞和Jurkat T细胞的捕获率和相对选择性结果；其中，a为TMCs对不同浓度的MCF-7-GFP细胞的捕获率；b为在不同浓度的MCF-7-GFP细胞条件下，TMCs对Jurkat T细胞的捕获率；c为TMCs对细胞的相对选择性。由图9可知，在混合细胞体系中，在大量干扰细胞(约10⁶个/mL Jurkat T细胞)条件下，该多靶向TMCs对MCF-7-GFP细胞的捕获率约为88％。

为进一步表征TMCs对两种细胞的相对结合能力，我们用TMCs在特定浓度下对MCF-7的捕获率除以相应地Jurkat T细胞的捕获率，得到TMCs对两种细胞的相对结合系数。如图9中c所示，在所测试浓度范围，TMCs在0.3mg/mL时对MCF-7的相对结合能力最强，其相对结合系数约17。

图10为TMCs对混合细胞体系中不同数目MCF-7-GFP细胞(20-500个/mL)捕获的状态图及相应线性拟合图；其中，a为相应线性拟合，b为荧光显微镜下观察到的TMCs捕获的细胞的典型状态图。

由图10可知，在实验范围内，TMCs所捕获的肿瘤细胞数目呈良好的线性关系，其斜率即为TMCs对样品中MCF-7-GFP细胞的捕获效率，约为88％，这与单细胞体系中所得结果相一致。值得注意的是，当每10⁶个Jurkat T细胞中MCF-7-GFP细胞数目降至20个时，所得结果与实际结果已产生较大误差(16.8±13.2)，说明该结果已超出了TMCs的检测限。故而，从该实验中我们可以知道，在实验条件下，所制备的多功能TMCs的检测限约为50个/10⁶个(MCF-7-GFP/Jurkat T)。图10b为荧光显微镜下TMCs捕获的MCF-7-GFP细胞在不同标尺下的典型状态照片，可以看出捕获的MCF-7-GFP可在荧光显微镜下清楚地观察计数。

图11为TMCs捕获的MCF-7-GFP细胞和/Jurkat T细胞的放大图，图中标尺为25μm；其中a为单细胞体系中，TMCs捕获的MCF-7-GFP细胞的放大图；b为混合细胞体系中，TMCs捕获的MCF-7-GFP细胞和吸附的Jurkat T细胞的放大图。

如图11所示，图中恰有MCF-7-GFP(蓝色，绿色)和Jurkat T细胞(蓝色)，且在绿色MCF-7-GFP细胞周围可见明显的材料聚集(见图11bRhB视图)，表明TMCs对MCF-7-GFP的特异性作用。综上所述，所制备的多功能TMCs对混合细胞体系中的MCF-7-GFP细胞具有良好的选择性。

实施例5细胞增殖能力和迁移能力测试

我们通过对捕获后的肿瘤细胞进行再培养研究其增殖能力。适当浓度的细胞悬浮液与1mL含有0.3mg TMCs的10％FBS的PBS缓冲液充分混匀后在细胞培养箱中孵育15min，然后对细胞悬浮液进行磁分离富集TMCs识别的细胞。收集TMCs识别的细胞并用PBS洗涤两遍，重新分散于新鲜细胞培养基中，并置于六孔板中继续培养。分别于0，24，48，72h对细胞拍照以监测其生长状况，结果见图12。

细胞再培养实验表明所捕获的肿瘤细胞仍保有良好的生长活力和较强的增殖能力。

我们利用伤口愈合实验测试TMCs所捕获的细胞的迁移能力。具体步骤如下：待所捕获细胞增殖至铺满六孔板后，用灭菌后的200μL枪头垂直轻划孔板底部以形成横线划痕，并用PBS洗涤三遍以除去划下的细胞，然后取2mL无血清DMEM培养基加入孔中。分别于0h，6h，12h和24h对划痕处进行拍照，并利用Imaging-Pro-Plus软件对划痕面积进行半定量表征，结果见图13。

伤口愈合面积百分率通过以下公式计算得到：

伤口愈合面积百分率/％＝(A0-An)/A0×100％

其中，A0为0h时无细胞区面积，An为nh时的无细胞区面积。

伤口愈合实验表明所捕获的肿瘤细胞与正常为处理的肿瘤细胞没有显著性差异。

一种用于高效检测循环肿瘤细胞的磁性材料及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。