专利摘要

专利摘要

一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法，属于微生物肥料领域。本发明采用固态发酵工艺，利用钾细菌将纤维素酶发酵废菌丝体、沼渣和钾矿粉混合物通过固态发酵生产生物钾肥。该方法具有成本低、肥效高、增产效果明显的优点，并大量利用发酵废菌丝体，具有环保和资源化利用双重优势，适于大规模生产及推广。

说明书

技术领域

本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料领域，涉及一种以纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣为主要原料生产生物钾肥的方法。

背景技术

丝状真菌是发酵工业重要的生产菌种，用于衣康酸、柠檬酸、真菌淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖酸钠、青霉素等多种产品的生产当中。当前，纤维素酶的生产已经成为我国第四大酶种，且其发酵方式已经从固态发酵转变为液态发酵，其发酵过程中产生的大量废菌丝体严重污染环境，亟待处理。目前，发酵废菌丝体可以提取壳聚糖、麦角固醇、蛋白质等(杜予民，蔡俊，杨建红，邱雁临。从柠檬酸废菌丝体中分离壳聚糖的方法。中国专利，CN 1260253C；谭天伟，罗辉，戚以政。一种利用废菌丝体提取麦角固醇的方法。中国专利，CN 1118472C；刘建军，李丕武。从发酵法生产衣康酸产生的土曲霉废菌丝体中提取壳聚糖的方法，中国专利，CN 101538335A)，但上述文献未提及纤维素酶发酵废菌丝体的有效处理方法，且所述及的方法因其处理成本高，也不适于大规模应用，大量的废菌丝体仍然得不到有效解决。在废菌丝体中，存在着约占其干重20-30％的几丁质和30％以上的蛋白质，营养充足，十分适于有机肥料的生产。其中几丁质经微生物降解后产生壳聚糖。较之虾、蟹壳来源的壳聚糖，真菌菌丝体壳聚糖具有来源广泛、质量安全稳定、不受季节影响等优点。此外，纤维素酶废菌丝体中残存的纤维素酶活力可以对纤维素类物质进行水解，提高纤维素类废弃物的利用效率。

沼渣一般可用作生物肥料，但其肥效较低且不稳定。考虑到其中仍含有部分木质纤维素，利用沼渣制备生物肥料已经有相关专利公开。专利申请书200810147682.3公开了用沼气渣制备微生物有机肥料的方法。其组分为：沼气渣经无害化处理后的有机肥料60-80％、腐殖酸肥料30-35％、微生物功能菌(侧孢芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)3-4％、微量元素1-1.5％。上述组分经搅拌均匀后可以得到生物肥料。专利申请书200810219155.9(CN101423425)公开了沼渣综合利用生产活性生物有机肥及其方法。其原料重量配比为：沼渣∶污泥有机物∶水葫芦干基∶糖蜜发酵废水∶EM菌＝55-62∶15-20∶12.5-15∶10-14∶0.5-1.0。所获得的活性生物有机肥可以明显促进作物生长，提高产量。专利申请书201010011344.4公开了沼渣有机肥及其制备方法，以沼渣为主要原料(用量大于80％)，与腐植酸、氮肥、磷肥、钾肥及微量元素配合后在浅池中经有氧二次发酵、风干、固化后制成有机肥。发明专利申请书200810025668.6公开了一种有机生物肥料的生产方法。该方法主要包括如下步骤：首先将动物粪便、木制碎末、废渣、补充料和菌种(芽孢杆菌即酵母菌)构成的原料与水混合均匀；其次，将混合物进行常温堆肥发酵40-55天并充入空气2-4次，在混合物中含水量达到20％-25％时成为肥料。上述专利虽然利用沼渣作为原料，但未针对性对其中主要成分纤维素做进一步降解处理，导致沼渣中木质纤维素水解不充分、肥效不高，实际应用效果不理想。

专利申请书200810025668.6公开了一种有机生物肥料的生产方法，将动物粪便、木制碎末、废渣、补充料和菌种构成的原料与水混合均匀后进行常温堆肥发酵，发酵时间为40-55天，其间向混合物中通入空气2-4次，在含水量为20-25％时即成肥料。该方法所用菌种为酵母和芽孢杆菌，所得肥料营养成分不确定，且因是常规堆肥，钾细菌生物活力不确定，肥效不稳定，有效活菌数难以达标，不利于商品化。专利申请书200410088855.0(CN 1257267C)公开了一种钾细菌及利用该细菌生产微生物肥料菌种剂的方法，提供了新菌种和新技术方案生产微生物菌种剂，其所采用的方法为液态发酵法，所制成的菌剂再与常规肥料配合使用。该发明较好解决了生物钾肥中的有效活菌浓度问题，但未提及废弃物综合利用问题，且生产成本较高，不利于大规模推广。

本发明公开了一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法，利用两种工农业废弃物生产生物钾肥，可以大大降低生产成本，并解决了沼渣的高效利用问题，有利于大规模沼气工程的推广和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法。

本发明由如下步骤组成：(1)沼渣的预处理：采用纤维素酶发酵废菌丝体与沼渣混合，利用其中的纤维素酶活力水解沼渣中的纤维素；(2)固态发酵培养基的配制：预处理好的沼渣连同其中的纤维素酶发酵废菌丝体，尿素，过磷酸钙，氯化钾，磷酸二氢钾，钾矿粉，初始含水量60％-80％，pH 6-8。；(3)环状芽孢杆菌及胶冻样芽孢杆菌的培养：两种细菌的培养方法可以从公开文献获得，其主要步骤均为将经斜面培养的菌体接种入摇瓶后培养获得摇瓶种子(一级种子)，再将摇瓶种子接种到发酵罐中进行放大培养(二级种子)；(4)固态发酵生产生物钾肥：将环状芽孢杆菌液体种子液和胶冻样芽孢杆菌种子液分别用无菌水稀释成10亿个/毫升，按照比例接入固态发酵培养基中。接种后在发酵池中混合均匀，发酵时间为2-8天；(5)干燥。

本发明所用菌种：环状芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)获得。其中环状芽孢杆菌可以为CGMCC编号为1.383，1.553，1.554，1.2411，1.2394，1.2008其中之一；胶冻样芽孢杆菌可以为CGMCC编号为1.231，1.232，1.2326其中之一。

本发明中如无特殊说明，原料用量均为重量份。

文中所提到纤维素酶发酵废菌丝体是指，纤维素酶液态发酵结束后经过滤处理所得到的真菌菌丝体。所涉及的真菌主要为产纤维素酶的真菌，如曲霉、青霉以及木霉。

文中所提及的沼渣是指，利用畜禽粪便和含纤维素废弃物为原料制取过程中排放的废弃物经固液分离后所得的固体组分，特别地，是指以农作物秸秆为主要原料制取沼气过程中排放的废弃物经固液分离后所得的固体组分。

文中所提及的钾矿粉是指钾长石矿粉、霞石矿粉、杂卤石矿粉、明矾石矿粉一种或几种的混合物。

文中所提及的生物钾肥是指：有效活菌数符合中国NY227-94农业行业标准规定的固体硅酸盐细菌肥料。

本发明的具体技术方案如下：

(1)沼渣的预处理：纤维素酶发酵废菌丝体1-5份，沼渣2-6份，在发酵池中充分混合后调节含水量为50％-70％(w/w)，调节pH为4-6，于20℃-50℃条件下处理1-5天，其间翻料3-8次。

(2)固态发酵培养基的配制：预处理好的沼渣连同其中的纤维素酶发酵废菌丝体100-200份，尿素3-8份，过磷酸钙5-10份，氯化钾0-3份，磷酸二氢钾2-5份，钾矿粉10-20份，初始含水量60％-80％，pH 6-8。上述培养基经121℃灭菌30分钟后备用。

(3)环状芽孢杆菌及胶冻样芽孢杆菌的培养。本步骤包括环状芽孢杆菌的斜面培养基培养、液态发酵培养和胶冻样芽孢杆菌的斜面培养基培养、液态发酵培养两部分。

①所述环状芽孢杆菌的培养：

斜面培养基：蛋白胨1，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，琼脂2，水100，pH 7.0。菌体在上述斜面培养基上于培养箱中32℃培养至斜面长满后用于环状芽孢杆菌的大量制备。

液体培养基：淀粉5，蔗糖1，CaCO₃1，FeCl₃0.1，豆饼粉0.5，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，自来水1000，pH 7.2。

摇瓶种子培养：摇床培养条件为：转速200转/分，温度35-40℃，培养时间20-30小时获得摇瓶种子。

发酵罐种子培养：以10％(v/v)接种量向发酵罐中接入摇瓶种子，转速300-400转/分，培养温度35-40℃，溶氧控制在20％以上，通气量为1∶1(体积比，以装液量为基准)培养15-28小时获得二级种子。

②所述胶冻样芽孢杆菌的培养：

斜面培养基：蔗糖10，磷酸二氢钠2，硫酸镁0.5，硫酸铵2，氯化铁0.05，碳酸钙1.0，酵母粉2，琼脂20(斜面)，水1000，pH 7.0，121℃灭菌30分钟。菌体在上述斜面培养基上于32℃培养箱培养至斜面长满后用于液体摇瓶种子制备。

液体培养基：淀粉7，蔗糖1，CaCO₃1，FeCl₃0.1，豆饼粉0.5，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，自来水1000，pH 7.2。

摇瓶种子培养条件为：摇床转速200转/分，温度30-35℃，培养时间10-15小时获得摇瓶种子。

发酵罐种子培养：以10％(v/v)接种量向发酵罐接入摇瓶种子，转速300-400转/分，培养温度30-35℃，溶氧控制在20％以上，通气量为1∶1(体积比，以装液量为基准)培养15-24小时获得二级种子。

(4)固态发酵。将环状芽孢杆菌液体种子液和胶冻样芽孢杆菌种子液分别用无菌水稀释成10亿个/毫升，按照如下比例接入固态发酵培养基中。固态发酵培养基的配制方法见步骤(2)。

环状芽孢杆菌种子液5-10，胶冻样芽孢杆菌5-10，固态发酵培养基100-250。接种后在发酵池中混合均匀，控制温度为25-40℃，湿度为90％-95％，发酵时间为2-8天，其间翻料3-10次。

(5)干燥。固态发酵结束后，将所得发酵肥料于40-60℃条件下烘干或者晒干，控制其含水量在20-30％即可获得生物钾肥产品。

本发明的有益效果是：首次采用纤维素酶发酵废菌丝体中残存的纤维素酶活性处理沼渣，可以部分降解其中的木质纤维素，提高沼渣的微生物利用率；该过程所产生的可发酵糖可以做碳源促进所接种微生物生长，节约商品碳源(如葡萄糖、淀粉等)成本，在无外加碳源情况下大幅提高肥料中的有效活菌数；废菌丝体中的部分还原糖和蛋白质可以用做微生物发酵所需的碳源和氮源；废菌丝体中的几丁质/壳聚糖可以作为肥料缓释剂，保证肥效持久。本发明采用纤维素酶发酵废菌丝体提高沼渣的可利用率，解决了沼渣作为肥料肥效不稳定、商业化难度大的问题。通过本发明方案实施，可以解决大中型沼气工程中沼渣肥料商品化的难题，能够明显提高这些工程的经济效益。

具体实施方式

以下结合实施例对发明进行进一步说明，但本发明不仅限于此。

实施例1

一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法，它包括如下步骤：(1)沼渣的预处理：纤维素酶发酵废菌丝体2份，沼渣3份，在发酵池中充分混合后调节含水量为60％(w/w)，调节pH为5，于30℃条件下处理3天，其间翻料6次。

(2)固态发酵培养基的配制：预处理好的沼渣连同其中的纤维素酶发酵废菌丝体120份，尿素4份，过磷酸钙6份，氯化钾1份，磷酸二氢钾3份，钾矿粉15份，初始含水量70％，pH 7.2。上述培养基经121℃灭菌30分钟后备用。

(3)环状芽孢杆菌及胶冻样芽孢杆菌的培养。

①将环状芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌分别在各自斜面培养基上进行活化。

②待斜面长满后用接种针分别接入各自的液体培养基中进行摇瓶培养。环状芽孢杆菌液体培养基：淀粉5，蔗糖1，CaCO₃1，FeCl₃0.1，豆饼粉0.5，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，自来水1000，pH 7.2。胶冻样芽孢杆菌液体培养基：淀粉7，蔗糖1，CaCO₃1，FeCl₃0.1，豆饼粉0.5，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，自来水1000，pH 7.2。

③摇瓶种子培养：用接种针挑取少量斜面上的菌体接种于装有液体培养基(经121℃灭菌30分钟)的三角瓶中(300毫升三角瓶装入液体培养基100毫升)后上摇床(HQL300恒温冷冻摇床(武汉中科科仪技术发展有限责任公司)培养。环状芽孢杆菌培养条件为：转速200转/分，温度35℃，培养时间20小时获得摇瓶种子。胶冻样芽孢杆菌培养条件为：转速200转/分，温度32℃，培养时间12小时获得摇瓶种子。

④发酵罐种子培养：100升发酵罐装入液体培养基70升，消泡剂4毫升，121℃灭菌30分钟后冷却，以10％(v/v)接种量接入摇瓶种子。环状芽孢杆菌培养条件：转速300转/分，培养温度35℃，溶氧控制在20％以上，通气量为1∶1(体积比，以装液量为基准)培养22小时获得二级种子；胶冻样芽孢杆菌培养条件为：转速400转/分，培养温度33℃，溶氧控制在20％以上，通气量为1∶1(体积比，以装液量为基准)培养18小时获得二级种子。两种细菌种子液中菌体浓度经平板活菌计数达到10-15亿个/毫升以上，在后续工作中作为固态发酵种子。

(4)固态发酵：将环状芽孢杆菌液体种子液和胶冻样芽孢杆菌种子液用无菌水稀释成10亿个/毫升，按照如下比例接入固态发酵培养基中。环状芽孢杆菌种子液10，胶冻样芽孢杆菌种子液10，固态发酵培养基100。接种后在发酵池中混合均匀，控制温度为32℃，湿度为90％，发酵时间为5天，其间翻料8次。

(5)干燥：将所得发酵肥料于50℃条件下用烘干，控制含水量为25％即得生物钾肥。生物钾肥中有效活菌数为4-5亿个/克，杂菌率低于10％。

实施例2

一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法，它包括如下步骤：(1)沼渣的预处理：纤维素酶发酵废菌丝体5份，沼渣2份，在发酵池中充分混合后调节含水量为80％(w/w)，调节pH为5，于40℃条件下处理2天，其间翻料5次。

(2)固态发酵培养基的配制：预处理好的沼渣连同其中的纤维素酶发酵废菌丝体100份，尿素8份，过磷酸钙9份，氯化钾3份，磷酸二氢钾5份，钾矿粉18份，初始含水量75％，pH 7.2。上述培养基经121℃灭菌30分钟后备用。

(3)环状芽孢杆菌及胶冻样芽孢杆菌的培养，同实施例1步骤(3)。

(4)固态发酵：将环状芽孢杆菌液体种子液和胶冻样芽孢杆菌种子液用无菌水稀释成10亿个/毫升，按照如下比例接入固态发酵培养基中。环状芽孢杆菌种子液5，胶冻样芽孢杆菌种子液5，固态发酵培养基250。接种后在发酵池中混合均匀，控制温度为36℃，湿度为95％，发酵时间为6天，其间翻料6次。

(5)同实施例1步骤(5)。生物钾肥中有效活菌数为2-3亿个/克，杂菌率低于10％。

实施例3

一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法，它包括如下步骤：(1)沼渣的预处理：纤维素酶发酵废菌丝体1份，沼渣6份，在发酵池中充分混合后调节含水量为50％(w/w)，调节pH为4.8，于30℃条件下处理5天，其间翻料8次。

(2)固态发酵培养基的配制：预处理好的沼渣连同其中的纤维素酶发酵废菌丝体200份，尿素8份，过磷酸钙10份，氯化钾3份，磷酸二氢钾5份，钾矿粉10份，初始含水量80％，pH 8。上述培养基经121℃灭菌30分钟后备用。

(3)环状芽孢杆菌及胶冻样芽孢杆菌的培养，同实施例1步骤(3)。

(4)固态发酵。将环状芽孢杆菌液体种子液和胶冻样芽孢杆菌种子液分别用无菌水稀释成10亿个/毫升，按照如下比例接入固态发酵培养基中。环状芽孢杆菌种子液5，胶冻样芽孢杆菌10，固态发酵培养基150。接种后在发酵池中混合均匀，控制温度为25℃，湿度为90％，发酵时间为8天，其间翻料10次。

(5)同实施例1步骤(5)。生物钾肥中有效活菌数为2-2.5亿个/克，杂菌率低于15％。

实施例4

一种利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法，它包括如下步骤：(1)沼渣的预处理：纤维素酶发酵废菌丝体5份，沼渣2份，在发酵池中充分混合后调节含水量为60％(w/w)，调节pH为6，于32℃条件下处理3天，其间翻料6次。

(2)固态发酵培养基的配制：预处理好的沼渣连同其中的纤维素酶发酵废菌丝体150份，尿素6份，过磷酸钙10份，氯化钾0份，磷酸二氢钾2份，钾矿粉20份，初始含水量75％，pH 7.5。上述培养基经121℃灭菌30分钟后备用。

(3)环状芽孢杆菌及胶冻样芽孢杆菌的培养，同实施例1步骤(3)。

(4)固态发酵。将环状芽孢杆菌液体种子液和胶冻样芽孢杆菌种子液分别用无菌水稀释成10亿个/毫升，按照如下比例接入固态发酵培养基中。环状芽孢杆菌种子液10，胶冻样芽孢杆菌10，固态发酵培养基120。接种后在发酵池中混合均匀，控制温度为37℃，湿度为90％，发酵时间为6天，其间翻料10次。

(5)同实施例1步骤(5)。生物钾肥中有效活菌数为5-6亿个/克，杂菌率低于10％。

利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。