专利摘要

本发明公开了一种多烯雄甾酮化合物及其应用；该化合物是从思茅藤属植物中提取分离得到的，其结构式如下式所示：其中，R1、R2、R3均选自氢、羟基、甲基、卤素、脂肪烃基、脂肪氨基；实验证明本发明中报道的化合物具有很强的免疫抑制活性；本发明化合物为研制免疫抑制剂和抗肿瘤制剂提供了先导化合物，有利于开发利用植物药用资源。

权利要求

1.结构式如下式所示的多烯雄甾酮化合物：

多烯雄甾酮化合物名称为12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮。

2.权利要求1所述的多烯雄甾酮化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多烯雄甾酮化合物及其在制备免疫抑制、抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

甾体类药物是临床最常用的免疫抑制剂，如泼尼松、地塞米松、甲泼尼龙等。它能有效抑制炎症因子，减少各种免疫细胞。免疫抑制剂在临床为自身免疫病和器官移植后的排斥反应提供了有效的治疗药物，通常用来抑制器官移植后出现的排异反应，治疗骨髓移植后出现的移植物抗宿主病，或治疗类风湿性关节炎、克隆氏症等自身免疫性疾病。

目前了解约有100多种恶性肿瘤，死于癌症人数约占全世界疾病死亡人数的13%；预计全世界癌症死亡将继续增加，2030年估计将有1200万人死于癌症；肿瘤的发生和发展与整个机体免疫功能衰退密切相关，肿瘤一旦发生又会反过来加深对机体免疫功能的抑制，助长肿瘤的发展。肿瘤细胞从原发部转移到其它部位继续生长，乃是肿瘤威胁生命的重要原因。在肿瘤发病的诸多因素中，各种类型的免疫抑制分子在肿瘤的形成及发展过程中起着关键作用，可作为抗瘤药物的新靶点，为肿瘤的生物治疗提供新思路。

自身免疫性疾病和癌症大多为慢性或进行性疾病需要长期用药，而现有的糖皮质激素（如地塞米松）和免疫抑制剂长期用药普遍存在毒副作用大、使用不方便等缺点。中药作为一种天然产物，具有与人组织相容性质好、副作用小等优点，在免疫抑制剂和抗肿瘤制剂的研究中越来越受到人们的重视。因而，从天然产物中寻找具有免疫抑制和恶性肿瘤细胞增殖抑制作用的化合物，对于开发高效低毒的新型免疫抑制剂和抗肿瘤制剂具有应用价值。本发明提供的多烯雄甾酮化合物及其作为免疫抑制药物目前尚未见报道。

思茅藤属（Epigynum）是夹竹桃科思茅藤族的一个属，根据我们前期的研究结果，思茅藤属植物中主要含有雄甾烷、孕甾烷及其糖苷。在发现新药先导化合物的兴趣驱动下，我们对这些新化合物进行了大量的生物活性筛选实验，发现其中多烯雄甾酮化合物（12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮）在浓度为12.5μM时具有免疫抑制活性，在浓度为25、50μM时与模型组相比有显著性差异（P<0.05），具有更好的免疫抑制活性。在抗肿瘤试验中，我们针对人体急性淋巴细胞白血病细胞、慢性粒细胞白血病细胞、恶性黑色素瘤细胞、星状细胞瘤细胞、腺癌细胞、恶性上皮肿瘤细胞、多形性脑胶质母细胞瘤细胞、肺鳞癌细胞、卵巢腺细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞等开展细胞增殖抑制实验室，结果表明在浓度为25μM时与阳性对照地塞米松活性相当，且有5株细胞对地塞米松表现出耐药性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构式如式Ⅰ所示的多烯雄甾酮化合物：

Ⅰ

其中，R1、R2、R3均选自氢、羟基、甲基、卤素、脂肪烃基、脂肪氨基。

上述脂肪烃基和脂肪氨基中的脂肪取代基是指饱和或不饱和脂肪取代基，其中，饱和脂肪取代基是指直链或带有支链的烷基、环烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、环丙基环十二烷基等，而不饱和脂肪基是指链烯基、炔基或链二烯基，链烯基如烯丙基、异戊烯基、1-十二烯基，炔基如1-十八炔基、2-十八炔基，链二烯基如香叶基、1，3-十八烯基、9-十八烯基等。

本发明另一目的是提供一种结构式如式Ⅱ的12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮：

Ⅱ。

本发明的另一目的是将上述多烯雄甾酮化合物应用在制备免疫抑制药物中。

具体是免疫抑制药物应用在制备自身免疫性疾病的治疗药物中，或应用在制备器官移植抗排斥反应的治疗药物中。

本发明另一目的是将上述化合物应用在制备抗肿瘤药物中。

本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。

本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。

本发明中用健康的Balb/c小鼠来制备脾细胞用于试验。脾细胞制备完成后，通过ConA或者LPS进行诱导，同时在试验组加入不同浓度供试化合物，培养72 h后，通过CCK-8试剂法分别测定试验组、诱导对照组和未诱导对照组的吸光值，从而评价化合物刺激T细胞或者B细胞增殖的能力；实验结果表明本发明多烯雄甾酮化合物：12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮，对ConA（伴刀豆蛋白）刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组相比有显著性差异(p<0.05)。

取处于对数生长期人体肿瘤细胞调整为一定浓度的细胞悬液接种于96孔培养板，90μl/孔，培养24小时待其贴壁后加入不同浓度的化合物，10μl /孔，每个浓度均设3个复孔。细胞计数并使用台盘蓝染色法测定细胞的存活率，存活率＝未着色细胞数/细胞总数×100％，存活率＞95％者用于试验，细胞悬液调至1×106个/mL。设细胞空白对照组、阳性对照组（地塞米松）及样品组（浓度根据预试验结果定为 25μmol·L-1，均含等浓度的DMSO）。阴性对照为等体积培养基，同时设化合物25μg/mL时相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。加药后继续置于37℃，5％CO2培养箱培养，在药物分别作用1、3、6、12、18、24小时后，每孔加入MTT（5mg/mL）20μl，继续培养4小时，每孔加入三联液[10％SDS-5％异丁醇－0.012mol/L HCl (W/V/V)]100μl溶解甲臜。用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值推测出细胞增殖抑制率。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮的制备

取老挝小花思茅藤植物样品地上部分(茎和叶)干粉11.0kg，用75%乙醇回流提取3次，每次48h，过滤除去滤渣后合并三次提取的滤液，减压浓缩后再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯萃取层称重得352g；将乙酸乙酯层萃取物用C18柱进行粗分，分别用体积百分比20%、40%、50%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行洗脱总共得到6个部分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E)。Fr.D通过制备液相以体积百分比40%-80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱得到四个部分Fr.B1-B4。再将其中的Fr.B2通过200-300目的硅胶柱，以氯仿-丙酮（体积比20:1-3:1）为洗脱液进行洗脱，总共得到四个部分Fr.B2a-Fr.B2d。将Fr.B2b通过半制备高效液相（乙腈-水，70:30）纯化得到式Ⅱ中的化合物（20mg）。经鉴定，式Ⅱ中的多烯雄甾酮化合物为新化合物；鉴定结果如下：

式Ⅱ化合物12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮为淡黄色不定型粉末，易溶于氯仿甲醇混合液（氯仿：甲醇=1:1）、吡啶等。[α]26 D - 98.5 (c 0.04, MeOH); UV (MeOH)λmax (log ε): 203 nm (3.5); IR (KBr) νmax 3473 2902, 2831, 1733, 1717, 1458,1375, 1329, 1047, 962 cm–1;HR-ESI-MS m/z 284.1846 [M+H]+结合13CNMR谱推断其分子式C19H24O2。1H NMR (CDCl3, 500Mz)和13C NMR(CDCl3,125Mz) 见表1；以上数据结合2D NMR分析证实了该化合物的化学结构式为式Ⅱ所示，为一个新的天然有机化合物。

表1：12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮的1H NMR和13C NMR数据

。

实施例2：12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮的制备

取风干后的11 kg云南思茅藤茎样品，粉碎后用甲醇回流提取3次，回收溶剂，浓缩至小体积，再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯层，称重得1.2kg；将乙酸乙酯层部分用大孔吸附树脂D101进行粗分，分别用体积百分比40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行洗脱总共得到5个部分(Fr.A、Fr.B、Fr. C、Fr.D、Fr.E)。Fr.E (280g) 拌入1.5倍量的硅胶，拌样硅胶进行常规干燥，装柱，以氯仿-丙酮（0:100-95:5）两相体系为流动相进行梯度洗脱，根据TLC 检视合并得到三个部分Fr.E1-E3。Fr.E2用C18填料拌样上反相 C18 柱甲醇-水梯度洗脱得到两个部分，Fr.E2a-E2b。Fr.E2a通过硅胶柱以石油醚-丙酮体系进行洗脱，然后通过凝胶用氯甲（1:1, V/V）体系洗脱、再通过半制备高效液相纯化后得到式Ⅱ中的化合物（7mg）。经鉴定，式Ⅱ中的雄甾烷化合物为新的天然有机化合物。

实施例3：免疫抑制检测试验

（1）脾淋巴细胞悬液的制备

取18~22g的健康BABL/c小鼠放血处死，置于75%酒精中浸泡消毒5分钟，取出，置于无菌托盘中，左侧朝上，在超净台中，用消毒过的镊子夹起腹中部皮毛，作一切口，用另外一套器械剪开腹壁各层，用第三套器械将脾取出，去除脂肪和结缔组织，放入PBS（磷酸盐缓冲液）中，洗去浮血。然后将脾组织移至盛有RPMI 1640不完全培养液的平皿中，用剪刀剪成小块，用无菌注射器芯在200目不锈钢筛网中将脾研碎，用PBS少量多次冲洗，将悬液用移液器转移至15mL离心管中；1000r/min转速离心5min；吸弃上清液，加入3mL红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）混匀，静置2min后加入10 mL PBS终止反应，离心(1200rpm, 5min)，去上清，沉淀用5mL PBS洗涤两次，同样条件下离心；沉淀用5mL含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液悬浮；以0.8%台盼兰活细胞拒染法计数，活细胞数不少于95%，加RPMI 1640完全培养液稀释，调整细胞浓度至1×106个/mL左右。

（2）供试液的制备

精密称取单体化合物2mg，加入DMSO溶解，上样前用PBS稀释至所需浓度，并使得上样后的DMSO终浓度不超过0.1%。

（3）实验分组

正常对照组：100 μL脾细胞悬液+10 μL RPMI 1640完全培养基+10 μLPBS

模型组：100 μL脾细胞悬液+10 μLConA(终浓度为10 μg/mL)+10 μLPBS

样品组：100 μL脾细胞悬液+10 μLConA(终浓度为10 μg/mL)+10 μL样品

96孔板中，每孔加入淋巴细胞悬液（1×106个/mL）100 μL，ConA 10 μL (终浓度为10 μg/mL)，不同浓度试药化合物稀释液10μL (终浓度分别为12.5、25、50 μg/mL)，地塞米松也做三个对应的浓度组，正常对照组孔分别用10 μL的1640完全培养液（含10%胎牛血清）和10 μL 的PBS补齐，每个浓度组设4个平行。

（4）培养：置于37℃，5 % CO2培养箱内培养 72小时。

（5）CCK-8法测定细胞OD值

培养72小时后，每孔中加入10 μL 的CCK-8试剂 (碧云天)，置于37℃，5 % CO2培养箱内继续培养4小时后，在450nm处测定每孔的吸光值以计算细胞增殖情况，并按下式计算刺激指数（SI）：

SI（刺激指数）=加有丝分裂原培养物的OD值/不加有丝分裂原培养物的OD值；

（6）数据处理

实验数据OD值采用“平均数±标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用Origin软件完成。

（7）实验结果

表2：式Ⅱ化合物对ConA刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数

式Ⅱ中12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮在浓度为12.5、25、50μM时的刺激指数分别为2.90，2.52，1.79；显著性分析表明，中浓度和高浓度组与模型组相比有显著性差异（P<0.05）。

阳性对照结果为：

表3：地塞米松对ConA刺激的Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数

地塞米松在浓度为12.5、25、50μM时的刺激指数分别为1.62，1.41，1.21；显著性分析表明，各浓度组与模型组相比有显著性差异（P<0.05）。

实验结果表明，12β-羟基雄甾-3,5,14(15)-三烯-16-酮在浓度为12.5μM时具有免疫抑制活性，在浓度为25、50μM时与模型组相比有显著性差异（P<0.05），具有更好的免疫抑制活性。

实施例4：体外抗肿瘤活性试验

（1）材料

DMSO（美国Sigma公司）、胎牛血清（美国HyClone公司）、RPMI-1640培养液（美国HyClone公司）、磷酸盐缓冲液（上海beyotime公司）、双抗（美国HyClone公司）、CCK-8（东仁化学科技有限公司），人体肿瘤细胞（CCRF-CEM、MOLT-4、K-562、MALME-3M、UACC-62、SNB-75、OVCAR8、EKVX、U0-31、SF-295、NCI-H226、SK-OV3、MDA_MB-468、Hop92），本发明化合物及地塞米松均用DMSO配制。

（2）方法

取处于对数生长期人体肿瘤细胞调整为一定浓度的细胞悬液接种于96孔培养板，90ml/孔，培养24小时待其贴壁后加入不同浓度的化合物，10ml/孔，每个浓度均设3个复孔。细胞计数并使用台盘蓝染色法测定细胞的存活率，存活率＝未着色细胞数/细胞总数×100％，存活率＞95％者用于试验，细胞悬液调至1×106个 /mL。设细胞空白对照组、阳性对照组（地塞米松）及样品组（浓度根据预试验结果定为 25μmol·L-1，均含等浓度的DMSO）。阴性对照为等体积培养基，同时设化合物25mg/ml时相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。

（3）培养

加药后继续置于37℃，5％CO2培养箱培养。

（4）MTT法测定OD值

在药物分别作用1、3、6、12、18、24小时后，每孔加入MTT（5mg/ml）20ml，继续培养4小时，每孔加入三联液[10％SDS-5％异丁醇－0.012mol/L HCl (W/V/V)]100ml溶解甲臜，通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可以根据光密度OD值推测出活细胞的数目，并按下式计算细胞抑制率：

抑制率（％）＝（OD值对照孔－OD值加样孔）/ OD值对照孔×100％；

（5）数据处理

实验数据OD值采用“平均数±标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用Origin软件完成。

（6）实验结果

本发明式Ⅱ化合物对14种人体肿瘤细胞株有较好的抑制；结果显示其中有5株人体肿瘤细胞（MOLT-4、K-562、SNB-75、SF-295、NCI-H226）对地塞米松具有耐药性，本发明式Ⅱ化合物具有较好的细胞毒活性；此外式Ⅱ化合物对其他9株肿瘤细胞（SK-OV3、MDA_MB-468、Hop92、EKVX、U0-31、OVCAR8、UACC-62、MALME-3M、CCRF-CEM）有抑制作用且与阳性对照活性相当。

表4：式Ⅱ化合物对5种人体肿瘤细胞存活率的影响

一种多烯雄甾酮化合物及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。