专利摘要

本发明涉及一种7‑酮基胆甾醇‑9‑羧基壬烷及其荧光标记物的合成方法。本发明以胆固醇和壬二酸为原料，以1,3‑二环已基碳化二亚胺和4‑二甲氨基吡啶作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，建立氧化体系并通过建立脂缩反应等最终得到7‑酮基胆甾醇‑9‑羧基壬烷。本发明提供了一种操作简便、原料易得，杂质含量少、生产成本低的7‑酮基胆甾醇‑9‑羧基壬烷的合成方法，以及提供一种引入NBD‑荧光基团的7‑酮基胆甾醇‑9‑羧基壬烷的合成方法，在保证其基本骨架结构的基础上引入NBD‑荧光基团，最终合成NBD‑oxLig‑1，使7‑酮基胆甾醇‑9‑羧基壬烷(oxLig‑1)可自发荧光，为其在细胞生物学中的示踪应用。

权利要求

1.7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，其特征在于，其合成步骤如下；

方案(1)：首先以胆固醇和壬二酸为原料，以1,3-二环已基碳化二亚胺DCC和4-二甲氨基吡啶DMAP作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：胆固醇＝2：1.5：1：1，应始终保证壬二酸过量，在50-80℃充分反应，缩合成胆固醇壬二酸脂，重结晶纯化；

重结晶溶剂为下列一种或两种以下任意比例的组合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水；重结晶溶剂用量为所得胆固醇壬二酸脂质量的0.1～100倍；

反应式如下：

以上一步的胆固醇壬二酸酯为原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/CrO₃为氧化体系，铬酐CrO₃溶于二氯甲烷，待搅拌溶解完全后再加入一次胆固醇壬二酸脂以及4A分子筛，然后用恒压分液漏斗滴加体积分数为70％的TBHP到反应液中室温反应20-36h，滤去反应固体，除杂，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到出粗产物7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷；氧化反应的物料比满足中间产物胆固醇壬二酸酯反应完全，以摩尔数记，胆固醇壬二酸酯：铬酐＝6～7:1，TBHP：CrO₃＝50～60:1；

反应如下：

方案(1)中所述的酯化反应和酰胺化反应催化体系为DCC/DMAP、EDCl/DMAP或EDC/DMAP，所述的丙烯位氧化反应为TBHP/CrO₃、PCC/SiO₂、吡啶/CrO₃，TBHP/CuCl₂/Bu₄NBr或O₂/NHPI；

方案(2)：首先以胆固醇和乙酸酐为原料由吡啶催化反应生成胆固醇乙酸酯，其他反应条件与方案(1)相同，以摩尔数记，吡啶：胆固醇＝5～15:1，酸酐：胆固醇＝2～10:1；充分反应，缩合成胆固醇乙酸酯，重结晶纯化；

重结晶溶剂为下列一种或两种以上任意比例的组合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水；所述重结晶溶剂用量为所得胆固醇乙酸酯质量的0.1～100倍；

建立丙烯位氧化，以TBHP/CrO₃为氧化体系，反应得到7-酮基胆固醇乙酸酯，其他反应条件与方案(1)相同，以摩尔数记，丙烯位氧化中，胆固醇乙酸酯：铬酐＝6～7:1，TBHP：CrO₃＝50～60:1；

皂化反应，利用KOH碱性水解7-酮基胆固醇乙酸酯，按照7-酮基胆固醇乙酸酯：KOH＝1:1～2的摩尔比，7-酮基胆固醇乙酸酯完全溶解在四氢呋喃溶液中，KOH完全溶解在甲醇中，混合后回流30min，冷却到室温，旋干溶剂，得到7-酮基胆固醇，再由7-酮基胆固醇与壬二酸经酯化反应，7-酮基胆固醇与壬二酸的摩尔比＝2:1，得到7-酮基胆甾醇-9羧基壬烷；

具体如下：

2.根据权利要求1所述的7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，其特征在于，7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的荧光标记物的合成方法是引入NBD-荧光基团，其具体合成方法为：

首先，以NBD-胆固醇和壬二酸为原料，以1,3-二环已基碳化二亚胺DCC和4-二甲氨基吡啶DMAP作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：NBD-胆固醇＝2：1.5：1：1，应始终保证壬二酸过量，在50-80℃充分反应，缩合成NBD-胆固醇壬二酸脂，重结晶纯化；

重结晶溶剂为下列一种或两种以上任意比例的组合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水；重结晶溶剂用量为所得NBD-胆固醇壬二酸脂质量的0.1～100倍；

以上一步的NBD-胆固醇壬二酸酯为原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/CrO₃为氧化体系，铬酐CrO₃溶于二氯甲烷，待搅拌溶解完全后再加入一次NBD-胆固醇壬二酸脂以及4A分子筛，然后用恒压分液漏斗滴加体积分数为70％的TBHP到反应液中室温反应20-36h，滤去反应固体，除杂，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到出粗产物NBD-7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷；以摩尔数记，胆固醇壬二酸酯：铬酐＝6～7:1，TBHP：CrO₃＝50～60:1；

反应如下：

3.根据权利要求2所述的7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，其特征在于，所述的NBD-7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷自发荧光，应用于细胞生物学中的示踪。

说明书

技术领域

本发明涉及一种7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷及其荧光标记物的合成方法。

背景技术

7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxlig-1)最先由刘庆平等人从氧化低密度脂蛋白(oxLDL)中分离得到，被用来作为血清糖蛋白β2-GPI的特异性配体(Liu et al.，J Lipid Res 2002，43：1486-95)。随着研究的深入发现oxLig-1可以激活CD36以及PPARγ信号通路，上调ABCA1表达，调节促进胆固醇的流出，抑制动脉粥样硬化发生(Wenzhe Li,Dan Wang,et al:Atheroclerosis.2013,226；102-109Chi,Y,et al.，J Atherosclerosis，2014，234(2):461-468)。

7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-1)作为一类活性脂应用价值巨大，但PCT/JP02/00723所公开利用WSC/DMAP催化剂体系化学合成oxLig-1的方法，以昂贵的7-酮基胆固醇(7-KC)为原料，大大增加了成本，因此，开发一种高效、环保且降低成本的合成方法，具有较高的科学意义和经济以及社会价值。

如上所述，7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-1)有着如此巨大的科研和生物医学潜力，但其作用机理并没有完全清晰，难点主要是其分子无法荧光标记，现有的放射性标记技术，条件苛刻，易产生放射性污染，应用有限。本发明在保证其基本骨架结构的基础上引入NBD-荧光基团，使7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-1)可自发荧光，以便被示踪。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种操作简便、原料易得，杂质含量少、生产成本低的7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，以及提供一种引入NBD-荧光基团的7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法。

本发明提供的合成7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的技术方案如下：

方案(1)：首先以胆固醇和壬二酸为原料，以1,3-二环已基碳化二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：胆固醇＝2：1.5：1：1，应始终保证壬二酸过量，在50-80℃下，大约2h，充分反应，缩合成胆固醇壬二酸脂，重结晶纯化。

重结晶溶剂为下列一种或两种以上任意比例的组合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水。更进一步，所述重结晶溶剂最优选乙醇。

所述重结晶溶剂用量为所得胆固醇壬二酸脂质量的0.1～100倍，优选1～5倍。

反应式如下：

以上一步的胆固醇壬二酸酯为原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/CrO₃为氧化体系，铬酐(CrO₃)溶于二氯甲烷，待搅拌溶解完全后再加入一次胆固醇壬二酸脂以及4A分子筛。然后用恒压分液漏斗滴加体积分数为70％的TBHP到反应液中，室温反应20-36h，滤去反应固体，除杂，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到出粗产物7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷，氧化反应的物料比满足中间产物胆固醇壬二酸酯反应完全，以摩尔数记，胆固醇壬二酸酯：铬酐＝6～7:1；优选6.5～7:1；TBHP：CrO₃＝50～60:1，优选60:1，反应如下：

方案(1)中的以胆固醇为原料，得到中间产物胆固醇壬二酸酯及其建立丙烯位的氧化最后得到7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷，所使用的酯化反应和酰胺化反应催化体系不仅包含文中提到的DCC/DMAP，还应有EDCl/DMAP，EDC/DMAP等一系列的催化体系。所使用的丙烯位的氧化反应也不仅包含TBHP/CrO₃，还应有PCC/SiO₂，吡啶/CrO₃，TBHP/CuCl₂/Bu₄NBr，O₂/NHPI等氧化体系。

方案(2)：首先以胆固醇和乙酸酐为原料由吡啶催化反应生成胆固醇乙酸酯，其他反应条件与方案(1)相同，以摩尔数记，吡啶：胆固醇＝5～15:1优选10:1；酸酐：胆固醇＝2～10:1，优选5～8：1；充分反应，缩合成胆固醇乙酸酯，重结晶纯化；

所述重结晶溶剂为下列一种或两种以上任意比例的组合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水，更进一步，所述重结晶溶剂最优选乙醇。

所述重结晶溶剂用量为所得胆固醇乙酸酯质量的0.1～100倍，优选1～5倍。

建立丙烯位氧化，以TBHP/CrO₃为氧化体系，反应得到7-酮基胆固醇乙酸酯，其他反应条件与方案(1)相同，以摩尔数记，丙烯位氧化中，胆固醇乙酸酯：铬酐＝6～7:1；优选6.5～7:1；TBHP：CrO₃＝50～60:1，优选60:1。

皂化反应，利用KOH碱性水解7-酮基胆固醇乙酸酯，按照7-酮基胆固醇乙酸酯：KOH＝1:1～2的摩尔比，7-酮基胆固醇乙酸酯完全溶解在四氢呋喃溶液中，KOH完全溶解在甲醇中，混合后回流30min，冷却到室温，旋干溶剂，得到7-酮基胆固醇(7-KC)，再由7-酮基胆固醇(7-KC)与壬二酸经酯化反应，7-酮基胆固醇与壬二酸的摩尔比＝2:1，得到7-酮基胆甾醇-9羧基壬烷(oxLig-1)。

具体如下：

本发明方案(2)中先由胆固醇合成比较昂贵的7-酮基胆固醇，再合成目的产物oxLig-1，此方案就是以降低成本为原则，得到成本低廉的目的产物oxLig-1。

7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的荧光标记物的合成方法是引入NBD-荧光基团，就是利用NBD-胆固醇代替方案(1)中的胆固醇，其具体合成方法为：

首先，以NBD-胆固醇和壬二酸为原料，以1,3-二环已基碳化二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：NBD-胆固醇＝2：1.5：1：1，应始终保证壬二酸过量，在50-80℃充分反应，缩合成NBD-胆固醇壬二酸脂，重结晶纯化。

重结晶溶剂为下列一种或两种以上任意比例的组合：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、水，更进一步，所述重结晶溶剂最优选乙醇。

所述重结晶溶剂用量为所得NBD-胆固醇壬二酸脂质量的0.1～100倍，优选1～5倍。

以上一步的NBD-胆固醇壬二酸酯为原料，建立丙烯位氧化，以TBHP/CrO₃为氧化体系，铬酐(CrO₃)溶于二氯甲烷，待搅拌溶解完全后再加入一次NBD-胆固醇壬二酸脂以及4A分子筛。然后用恒压分液漏斗滴加体积分数为70％的TBHP到反应液中室温反应20-36h，滤去反应固体，除杂，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到出粗产物NBD-7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷。

以摩尔数记，胆固醇壬二酸酯：铬酐＝6～7:1；优选6.5～7:1；TBHP：CrO₃＝50～60:1，优选60:1。

反应如下：

本发明的有益效果效果是：本发明提供了一种操作简便、原料易得，杂质含量少、生产成本低的7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，以及提供一种引入NBD-荧光基团的7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷的合成方法，在保证其基本骨架结构的基础上引入NBD-荧光基团，最终合成NBD-oxLig-1，即NBD-7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-1)，使7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷(oxLig-1)可自发荧光，为其在细胞生物学中的示踪应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

以胆固醇和壬二酸为原料，以1,3-二环已基碳化二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：胆固醇＝2：1.5:1:1，缩合成胆固醇壬二酸脂,反应物在60℃水浴下进行，搅拌反应12h后回流12h，最后过滤。粗产物经饱和NaCl萃取清洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥过夜，隔天蒸干备用。

建立氧化体系，烯丙位的氧化：铬酐溶于二氯甲烷，待搅拌溶解完全后再加入一次反应产物以及4A分子筛。然后用恒压分液漏斗滴加体积分数为70％的TBHP到反应液中，室温搅拌24小时停止反应。滤去反应固体，除杂，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到出粗产物oxLig-1。

建立脂缩反应：0.25mmol的壬二酸、0.1875mmolDCC和0.125mmol催化剂DMAP溶于15mL二氯甲烷中，由恒压漏斗逐滴加入同样溶于二氯甲烷的0.125mmol胆固醇，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：胆固醇＝2：1.5:1:1；反应物在60℃搅拌反应12h后回流12h，期间利用薄层层析随时监测反应情况。

反应后处理：将反应产物进行减压过滤，除去不溶的脲；饱和NaCl萃取3次，手机有机相；无水硫酸钠干燥过夜。

建立烯丙位氧化体系：将0.00035gCrO3溶于25ml二氯甲烷中，再加入1.3g(0.0023mol)胆甾醇壬二酸酯已基0.2g4A分子筛。然后，将3ml(0.020mol)体积分数为70％THBP滴加到反应液中。试问下搅拌24h后停止反应。

反应后处理：将氧化反应液过滤，倒入分液漏斗中，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和NaCl溶液，洗至中性，然后无水硫酸钠干燥过夜。

拌样：称取干燥产物3倍质量的拌样硅胶(100-140目)与产物与少量二氯甲烷溶解，自然晾干。

装柱：称取干燥产物50倍质量的纯化硅胶(200-300目)，连续导入柱子中，颠实；加入拌样硅胶，最后压成一薄层。

纯化：先后用纯氯仿、氯仿：甲醇＝200:1和氯仿：甲醇＝50:1三种极性的洗脱液进行纯化。

纯品收集：将含有纯品的洗脱液收集，旋干得到成品oxLig-1。

样品分析：测定熔点，红外谱，核磁碳谱、氢谱，质谱检测合成样品。

实施例2

(1)建立反应(胆甾醇→胆甾醇乙酸酯)：在装有冷凝管、温度计的四颈瓶中，加入15ml(0.18mol)吡啶，10.0g(0.023mol)胆甾醇，加热搅拌；待胆甾醇在吡啶中全部溶解后，再加入20ml(0.21mol)乙酸酐，75℃恒温反应6h，停止加热，冷却至室温。

(2)反应后处理：加入100ml蒸馏水将反应物转移至分液漏斗中，然后分别用40ml二氯甲烷萃取3次，合并萃取液；滤液分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，蒸馏水洗至中性。

用50g无水硫酸钠干燥，过滤掉固体，减压除去溶剂。

将粗品转移至蒸发皿，自然干燥24h。

(3)纯化：将干燥后的粗品，加100ml无水乙醇，75℃加热使其溶解至澄清；趁热过滤，将滤液自然冷却至室温后，放入4°冰箱放置24h；过滤，将结晶移至蒸发皿中，自然干燥48h；向结晶固体中加入60ml无水乙醇进行重结晶，将重结晶的固体移入蒸发皿自然干燥得到胆甾醇乙酸酯。

(4)建立反应(胆甾醇乙酸酯→7-羰基胆甾醇乙酸酯)：将0.0018mol铬酐(CrO3)溶于1.95mol二氯甲烷中，再加入0.0012mol胆甾醇乙酸酯以及1.0g 4A分子筛；将0.10mol体积分数为70％TBHP滴加到反应液中，室温下搅拌24h后停止反应。

(5)反应后处理：过滤除去24小时反应后的固体；分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，洗至中性。将洗至中性的溶液倾入分液漏斗中，加入40ml二氯甲烷萃取，萃取三次，合并萃取相，加入5g无水硫酸钠过夜干燥。将经无水硫酸钠干燥的溶液过滤，将粗产物移入蒸发皿中，自然干燥。

(6)纯化：将脱脂棉放入色谱柱底部，并加入少量洗脱剂(石油醚-乙酸乙酯10:1，v/v)使其塞紧，然后将50g柱层析硅胶，200～300目吸附剂用洗脱剂中极性最低的调成糊状，将其边敲打边倒入柱中，同时，打开下旋活塞，在色谱柱下面用干燥的锥形瓶进行接收洗脱剂，当装入的吸附剂有一定的高度时，洗脱剂下流速度变慢，待所有吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂，过夜平衡柱子。

将1g样品以适量10:1石油醚-乙酸乙酯展开剂溶解，加样前，打开色谱柱下端活塞，用滴管将样品溶液滴加到色谱柱上，打开下端活塞，待溶液刚好全部进入吸附剂界面时，立即用滴管取少量用于溶解样品的纯溶剂沿玻璃管内壁注入，当界面的溶剂大部分进入色谱柱后，开始淋洗洗脱。合并流分，减压除去溶剂，移至蒸发皿中，自然干燥48h。

(7)建立反应(7-羰基胆甾醇乙酸酯→7-酮基胆甾醇)：将0.0011mol 7-羰基胆固醇乙酸酯溶于0.062mol四氢呋喃中，再加入0.0013mol 3％氢氧化钾(KOH)的甲醇溶液0.074mol中，水浴锅59.5℃回流30min。

(8)反应后处理：冷却至室温，减压旋干溶剂；将粗品转移至蒸发皿中，室温下自然干燥24h。

(9)纯化：称取30g(200～300目)柱层析用硅胶，用100ml石油醚将吸附剂调成糊状，将其边敲打边倒入柱中，同时打开下旋活塞，在色谱柱下面用干燥的锥形瓶接收洗脱剂，流动泵循环平衡柱子3小时。柱子填充完后在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂。

将样品以适量展开剂石油醚-乙酸乙酯(3:2)溶解，加样前，打开色谱柱下端活塞，让溶剂慢慢流出，直到溶剂的液面稍高于砂子表面，关闭活塞，用滴管将样品溶液滴加到色谱柱上，打开下端活塞，待溶液刚好全部进入吸附剂界面时，立即用滴管取少量用于溶解样品的纯溶剂沿玻璃管内壁注入，当界面的溶剂大部分进入色谱柱后，开始淋洗。

洗脱剂淋洗，石油醚-乙酸乙酯(3:2)；分别接受洗脱组分，并合并相同组分。

实施例3

以NBD-胆固醇和壬二酸为原料，以1,3-二环已基碳化二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为合成反应的催化剂，二氯甲烷作为溶剂，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：胆固醇＝2：1.5:1:1，缩合成胆固醇壬二酸脂,反应物在60℃水浴下进行，搅拌反应12h后回流12h，最后过滤。粗产物经饱和NaCl萃取清洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥过夜，隔天蒸干备用。

建立氧化体系，烯丙位的氧化。铬酐溶于二氯甲烷，待搅拌溶解完全后再加入一次反应产物以及4A分子筛。然后用恒压分液漏斗滴加体积分数为70％的TBHP到反应液中，室温搅拌24小时停止反应。滤去反应固体，除杂，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠水溶液，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到出粗产物oxLig-1。

建立脂缩反应：0.25mmol的壬二酸、0.1875mmolDCC和0.125mmol催化剂DMAP溶于15mL二氯甲烷中，由恒压漏斗逐滴加入同样溶于二氯甲烷的0.125mmol胆固醇，各物质摩尔比为壬二酸：DCC：DMAP：胆固醇＝2：1.5:1:1；反应物在60℃搅拌反应12h后回流12h，期间利用薄层层析随时监测反应情况。

反应后处理：将反应产物进行减压过滤，除去不溶的脲；饱和NaCl萃取3次，收集有机相；无水硫酸钠干燥过夜。

建立烯丙位氧化体系：将0.00035gCrO3溶于25ml二氯甲烷中，再加入1.3g(0.0023mol)胆甾醇壬二酸酯已基0.2g4A分子筛。然后，将3ml(0.020mol)体积分数为70％THBP滴加到反应液中。试问下搅拌24h后停止反应。

反应后处理：将氧化反应液过滤，倒入分液漏斗中，分别用1N盐酸溶液，5％碳酸氢钠溶液，饱和NaCl溶液，洗至中性，然后无水硫酸钠干燥过夜。

拌样：称取干燥产物3倍质量的拌样硅胶(100-140目)与产物与少量二氯甲烷溶解，自然晾干；称取干燥产物50倍质量的纯化硅胶(200-300目)，连续导入柱子中，颠实；加入拌样硅胶，最后压成一薄层。

纯化：先后用纯氯仿、氯仿：甲醇＝200:1和氯仿：甲醇＝50:1三种极性的洗脱液进行纯化。

纯品收集：将含有纯品的洗脱液收集，旋干得到成品oxLig-1。

样品分析：测定熔点，红外谱，核磁碳谱、氢谱，质谱检测合成样品。

7-酮基胆甾醇-9-羧基壬烷及其荧光标记物的合成方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。