专利摘要

本发明公开了一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法，属于天然药物化学研究领域。本发明以蒺藜茎叶为原料经有机溶剂提取、过滤、浓缩、浓缩液用水稀释后过大孔吸附树脂柱吸附，先用低浓度有机溶剂的水溶液进行洗脱后再高浓度有机溶剂的水溶液进行洗脱，得到含有海柯酮单体的螺甾总皂苷，取螺甾总皂苷进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。本发明的制备方法提取效率高，操作简单，适合工业化生产，获得的海柯酮单体纯度高，可用于制备药物组合物及其他产品。

权利要求

1.一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法，其特征在于：取干燥的蒺藜茎叶5Kg粉碎，用70％乙醇水溶液回流提取三次，乙醇水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、 2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂至无乙醇味；浓缩液加水稀释，稀释液过AB-8大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的35％的乙醇溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用体积比为8：4：0.9的氯仿-甲醇-水为展开剂进行薄层层析检验，用50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml 的A试剂和体积比为4：1的1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液和浓盐酸的E试剂显色，结果显示此时洗脱的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用80％乙醇溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷；取螺甾总皂苷30g，以体积比为5：3：1的乙酸乙酯：乙醇：水为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B 10.1g；将组分B以体积比为6：1：1：0.1的石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

2.一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法，其特征在于：取干燥的蒺藜茎叶5Kg粉碎，用70％甲醇水溶液回流提取三 次，甲醇水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、 2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂至无醇味；浓缩液加水稀释，稀释液过D101大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的30％的甲醇溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用体积比为8：4：0.9的氯仿-甲醇-水为展开剂进行薄层层析检验，用50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml 的A试剂和体积比为4：1的1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液和浓盐酸的E试剂显色，结果表明此时洗脱下来的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用80％甲醇溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷；取螺甾总皂苷30g，以体积比为5：3：1的乙酸乙酯：乙醇：水为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B 9.2g；将组分B以体积比为6：1：1：0.1的石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

3. 一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法，其特征在于：取干燥的蒺藜茎叶5Kg并粉碎，用85％丙酮水溶液回流提取 三次，丙酮水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、 2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂；浓缩液加水稀释，稀释液过 D4020大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的 25％的丙酮溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用体积比为8：4：0.9的氯仿-甲醇-水 为展开剂进行薄层层析检验，用50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml 的A试剂和体积比为4：1的1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液和浓盐酸的E试剂显色，结果表明此时洗脱的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用85％丙酮溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷；取螺甾总皂苷30g，以体积比为5：3：1的乙酸乙酯：乙醇：水为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B 9.5g；将组分B以体积比为6：1：1：0.1的石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

4. 一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法，其特征在于：取干燥的蒺藜茎叶5Kg并粉碎，用90％乙醇水溶液回流提取 三次，乙醇水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、 2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂至无乙醇味；浓缩液加水稀释， 稀释液过HP20大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的40％的乙醇溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用体积比为8：4： 0.9的氯仿-甲醇-水为展开剂进行薄层层析检验，用50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml 的A试剂和体积比为4：1的1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液和浓盐酸的E试剂显色，结果表明此时洗脱的成分是呋甾型甾体皂苷， 将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用95％乙醇溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷；取螺甾总皂苷30g，以体积比为5：3：1的乙酸乙酯：乙醇：水为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B 8.5g；将组分B以体积比为6：1：1：0.1的石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法，属于天然药物化学研究领域。

背景技术

蒺藜(Tribulus terretris L.)为蒺藜科蒺藜属植物，是一年生或多年生草本植物。茎由基部分枝，平铺在地面上、枝长可达30-60cm，叶为羽状复叶、形小且尖，果实由5个分果瓣组成，呈放射状排列，直径7-12mm。其为传统中药，又名白蒺藜、刺蒺藜、蒺藜子、硬蒺藜。性味辛、苦、微温、有小毒、入肝、肺经，具有平肝解郁、活血、明目、止痒等功效，主要用于头疼眩晕、乳闭乳痛、风疹瘙痒等症。药理研究表明，蒺藜具有抗菌、抗癌、利尿等作用，尤其在防治心脑血管疾病方面有较突出的疗效。

到目前为止人们从蒺藜中分得多种甾体皂苷，包括呋甾型甾体皂苷和螺甾型甾体皂苷，这些皂苷是蒺藜的主要有效成分。现代研究发现蒺藜茎叶中甾体皂苷的含量及种类与果实相似，蒺藜茎叶提取物也具有改善心脑血管、降血脂、抗真菌等作用。海柯酮(Hecogenone)是蒺藜茎叶中含有的一种螺甾型甾体皂苷，具有清除羟基自由基、抑制酪氨酸酶以及抗真菌的作用。

发明内容

本发明提供了一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

以蒺藜茎叶为原料用有机溶剂的水溶液进行提取、过滤、浓缩、浓缩液用水稀释后过大孔吸附树脂柱吸附，先用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱后再用高浓度有机溶剂的水溶液进行洗脱，TLC跟踪监测，得到螺甾总皂苷，取螺甾总皂苷进行硅胶柱层析分离，最终得到海柯酮单体。

所述蒺藜茎叶的提取方法为：取将干燥的蒺藜茎叶粉碎，用有机溶剂水溶液回流提取三次，合并三次提取液，回收溶剂。有机溶剂的水溶液为丙酮水、甲醇水或者乙醇水，优选70％-85％的丙酮水、甲醇水或者乙醇水。

所述的大孔吸附树脂选自AB-8、D103、D101、HP20的一种或它们的两种或两种以上的混合树脂。

所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮或它们的两种或两种以上混合溶剂。

所述的低浓度有机溶剂的水溶液是体积百分比浓度小于等于40％的水溶液。

所述的高浓度有机溶剂的水溶液是体积百分比浓度大于40％的水溶液。

所述的将蒺藜茎叶提取物用大孔吸附树脂吸附后，是先用体积百分比浓度小于15％有机溶剂的水溶液洗脱，然后用大于15％至小于40％的有机溶剂的水溶液洗脱得到呋甾型甾体皂苷，最后用体积百分比浓度大于40％的有机溶剂的水溶液洗脱，得到含有海柯酮单体的螺甾总皂苷。

螺甾总皂苷柱层析是以乙酸乙酯：乙醇：水为洗脱剂，优选体积比为5：3：1的乙酸乙酯：乙醇：水为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B后；将组分B以石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体，优选体积比为6：1：1：0.1。本发明制备方法工艺合理、提取效率高，操作简单，海柯酮纯度高，适合工业化生产。

本发明获得的海柯酮单体可用于制备药物组合物及其他产品。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取干燥的蒺藜茎叶5Kg粉碎，用70％乙醇水溶液回流提取三次，乙醇水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂至无乙醇味。浓缩液加水稀释，稀释液过AB-8大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的35％的乙醇溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用氯仿-甲醇-水(8：4：0.9)为展开剂进行薄层层析检验，用A试剂(50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和E试剂(1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液：浓盐酸(4；1))显色，结果显示此时洗脱的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用80％乙醇溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷。

取螺甾总皂苷30g，以乙酸乙酯：乙醇：水＝5：3：1(体积比)为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B 10.1g；将组分B以石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水(6：1：1：0.1，体积比)为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

得到的海柯酮单体用NMR确定了结构，HPLC-ELSD检测其纯度为99.5％。

海柯酮的核磁数据如下

13C NMR(C5D5N，150MHz)δc：38.12(C-1)，38.02(C-2)，209.72(C-3)，44.7(C-4)，46.37(C-5)，28.75(C-6)，31.43(C-7)，34.31(C-8)，54.96(C-9)，36.37(C-10)，38.12(C-11)，212.44(C-12)，55.47(C-13)，55.77(C-14)，31.53(C-15)，79.75(C-16)，54.42(C-17)，16.19(C-18)，10.88(C-19)，42.74(C-20)，14.01(C-21)，109.41(C-22)，31.89(C-23)，29.31(C-24)，30.63(C-25)，67.04(C-26)，17.40(C-27)。

1H NMR(C5D5N，600MHz)δH：4.37(1H，m H-16)，3.48(1H，dd J＝10.7Hz H-26)，3.35(1H，t J＝10.8Hz H-26)，2.66-1.06(25H，m)，0.82(3H，s H-18)，1.00(3H，s H-19)，1.24(3H，d J＝6.1Hz H-21)，0.57(3H，d J＝6.3Hz H-27)。

HPLC-ELSD色谱条件如下

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(ODS，4.6×250nm，5μm)

流动相：乙睛-水(45：55)；流速：1L/min；柱温：30℃

进样量：20μL；ELSD检测器漂移管温度98℃；撞击器状态：关闭。

载气压力：0.45Mpa雾化器流速：2.6L/min放大倍数：1.0倍

实施例2

取干燥的蒺藜茎叶5Kg粉碎，用70％甲醇水溶液回流提取三次，甲醇水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂至无醇味。浓缩液加水稀释，稀释液过D101大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的30％的甲醇溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用氯仿-甲醇-水(8：4：0.9)为展开剂进行薄层层析检验，用A试剂(50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和E试剂(1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液：浓盐酸(4；1))显色，结果表明此时洗脱下来的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用80％甲醇溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷。

取螺甾总皂苷30g，以乙酸乙酯：乙醇：水(5：3：1，体积比)为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B9.2g；将组分B以石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水(6：1：1：0.1，体积比)为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

HPLC-ELSD检测，其纯度为99.2％。

实施例3

取干燥的蒺藜茎叶5Kg并粉碎，用85％丙酮水溶液回流提取三次，丙酮水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂。浓缩液加水稀释，稀释液过D4020大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的25％的丙酮溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用氯仿-甲醇-水(8：4：0.9)为展开剂进行薄层层析检验，用A试剂(50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和E试剂(1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液：浓盐酸(4；1))显色，结果表明此时洗脱的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用85％丙酮溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷。

取螺甾总皂苷30g，以乙酸乙酯：乙醇：水(5：3：1，体积比)为流动相进行硅胶柱层析分离，得到含有海柯酮单体的组分B9.5g；将组分B以石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水(6：1：1：0.1，体积比)为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

HPLC-ELSD检测，其纯度为98.0％。

实施例4

取干燥的蒺藜茎叶5Kg并粉碎，用90％乙醇水溶液回流提取三次，乙醇水溶液用量分别为10、8、6倍(W/V)，回流时间为3h、2h、1h，合并三次提取液，回收溶剂至无乙醇味。浓缩液加水稀释，稀释液过HP20大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗至无色，用8倍柱体积的40％的乙醇溶液洗脱，将洗脱液浓缩后用氯仿-甲醇-水(8：4：0.9)为展开剂进行薄层层析检验，用A试剂(50ml醋酸使0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和E试剂(1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液：浓盐酸(4；1))显色，结果表明此时洗脱的成分是呋甾型甾体皂苷，将呋甾型甾体皂苷洗脱完全后再用95％乙醇溶液将螺甾皂苷洗脱，减压回收溶剂，干燥，获得螺甾总皂苷。

取螺甾总皂苷30g，以乙酸乙酯：乙醇：水(5：3：1，体积比)为流动相进行硅胶柱层析分离，，得到含有海柯酮单体的组分B8.5g；将组分B以石油醚：乙酸乙酯：乙醇：水(6：1：1：0.1，体积比)为流动相再次进行硅胶柱层析分离，得到海柯酮单体。

HPLC-ELSD检测，其纯度为97.5％。

上述实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种从蒺藜茎叶中提取分离海柯酮单体的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。