专利摘要

本发明提供了一种从发酵液中快速分离制备饲用抗菌肽的方法，采用杀菌释放抗菌肽、麸皮吸附、过滤、干燥以及包装的方法，从微生物的发酵液中快速提取抗菌肽，获得饲料级抗菌肽生物防腐剂产品。本发明利用廉价的麸皮作为吸附剂或载体，提取快速，回收率高，且可同时实现高抗菌活性和长保藏期，工艺简单、成本低廉、快速省时，制备出安全、稳定的饲用抗菌肽生物防腐剂。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物抗菌肽的快速分离制备方法，尤其是涉及一种利用麸皮做为吸附剂和饲用载体从微生物的发酵液中提取抗菌肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是生物产生的一种具有生物活性的小分子多肽，多数具有安全性高、抗菌谱广、热稳定性高的特点。近年来，微生物来源的抗菌肽受到人们的极大关注，特别是乳酸菌、芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌产生的抗菌肽对食源性的致病菌和腐败菌有高效的抗菌活性，可以被人体消化道蛋白酶分解，是对人体无毒的天然生物防腐剂，已广泛应用于食品和饲料工业。

低成本的大规模提取方法是实现抗菌肽工业化生产的关键，也是目前制约抗菌肽市场竞争力的主要因素。从发酵液中提取抗菌肽的传统方法有硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀和真空浓缩等手段，如细菌素提取的第一步普遍使用硫酸铵沉淀，但是这些传统方法通常存在回收率低、时间长、污染大等缺点，很难实现大规模制备。因此，自1944年在乳酸乳球菌的发酵液中发现乳酸链菌肽(Nisin)以来，人们一直努力寻找从微生物发酵液中提取抗菌肽的可行方法。

近年来，国内外的研究者们积极探索用吸附剂吸附提取抗菌肽的方法进行抗菌肽的大规模制备。1992年，美国怀俄明大学Yang等人报道了一种简便的细菌素分离纯化方法，该方法先将发酵液pH调至5.5，部分抗菌肽吸附到菌体细胞上，然后降低pH使抗菌肽从菌体细胞上解离。然而，研究者陆续报道仅仅使用菌体本身来进行吸附和解吸，吸附和解吸效率都很低，如乳酸链球菌肽总收率只有10％。1996年，Coventry等人用商品名“Micro-Cel”的硅酸钙抗粘剂从乳酸菌的发酵液中吸附抗菌肽，但是该方法得到的抗菌肽-吸附复合物解吸附非常困难，即使在pH1.0-12.0的范围内都不能将抗菌肽解离下来，只有1％的十二烷基磺酸钠(SDS)可以解吸附。然而，SDS是一种去垢剂，用此法制备的抗菌肽不宜在食品中使用。1998年，Janes等人用硅酸和稻壳灰作为吸附剂从乳酸菌的发酵液中提取并浓缩抗菌肽，同样，使用硅酸作为吸附剂得到的吸附复合物解吸附也非常困难，实际他们采用的技术路线是，浓缩这一步骤是通过冷冻干燥达到的。而冷冻干燥步骤之前是采用了22100g的低温高速离心除菌，其解吸附过程又必须在4℃以下搅拌过夜，该方法的主要缺陷在于：技术要求苛刻，成本较高，不适宜用于大规模的生产。

国内关于抗菌肽的后提取研究工作中，还连栋等人2003年专利报道先将乳酸链球菌肽发酵液高温灭活菌体后用硅藻土等吸附剂进行吸附，然后用聚乙二醇和氯化钠水溶液进行解吸，但该专利没有报道解吸附后如何去除表面活性剂聚乙二醇的方法。庄绪亮等人2006年专利报道了一种解吸并回收乳酸链球菌肽的新方法，它将表面活性剂解吸和纳滤方法相结合，即先调节吸附混合液的pH、装解吸柱、表面活性剂解吸附、然后采用纳滤的方法将溶液中的表面活性剂SDS去除，在去除SDS的同时将含有Nisin的溶液浓缩，浓缩液再采用喷雾干燥方法制成干粉，最终回收生物防腐剂乳酸链球菌肽。

另一方面，采用的策略是将发酵液中的抗菌肽吸附在食品级吸附剂表面，不进行解吸附而直接应用于食品保藏。如1996年曾报道将抗菌肽吸附在食品级表面；2010年曾有报道将细菌素吸附在两种食品级的吸附剂上。然而，食品级吸附剂价格较为昂贵，难以规模化生产，到目前为止国内外还没有报道采用吸附剂将抗菌肽吸附在饲料上。

综上所述，当前使用的吸附-解吸附制备方法没有涉及将抗菌肽吸附在饲用载体上直接发挥抗菌作用并延长保藏期，吸附提取抗菌肽的方法较为繁琐，成本较高，或产品中含有不易去除的化学物质，从而难以大规模推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用麸皮作为载体从微生物发酵液中快速分离提取抗菌肽的方法。

针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明人经过长期的研究和实验，创造出本发明的技术方案。发明人寻找到具有吸附能力的饲用载体，研究了抗菌肽与饲用载体的吸附作用及抗菌活性。

本发明的技术方案为：采用杀菌释放抗菌肽、麸皮吸附、过滤、干燥以及包装的技术路线，从而实现从微生物发酵液中快速提取出抗菌肽。

本发明提供的一种从微生物发酵液中快速提取饲用抗菌肽的方法，包含以下步骤：

1)对发酵液进行处理，杀菌释放抗菌肽；

2)加入麸皮，以麸皮为吸附剂和载体进行麸皮吸附；

3)过滤，收集过滤物即得饲用抗菌肽。

还包括将过滤物干燥，真空包装。

其中步骤1)所述的发酵液处理是将发酵液用酸调pH至3-6，121℃加热15-30min，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

其中步骤2)所述加入麸皮的量为发酵液体积的4％-10％，吸附温度30-50℃，100-200r/min搅拌15-60min，使抗菌肽充分吸附在麸皮表面，制成抗菌肽-麸皮的复合物。

步骤3)所述的过滤为用纱布或滤网过滤，弃去液体，收集抗菌肽-麸皮复合物。

所述滤网为50目。

所述的干燥是将抗菌肽-麸皮复合物平铺后进行干燥，采用自然晾干或40-70℃热风干燥。

本发明提供的一种从微生物发酵液中快速提取饲用抗菌肽的方法由以下步骤组成：

(1)对发酵液进行处理，释放出抗菌肽：将微生物发酵产生的发酵液用酸调pH至3-6，121℃加热15min，杀死产生菌并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中；

(2)麸皮吸附：加入发酵液体积4％-10％的麸皮进行吸附，吸附温度30-50℃，100-200r/min搅拌15-60min，使得抗菌肽充分吸附在麸皮表面，制成抗菌肽-麸皮的复合物；

(3)过滤：用纱布或滤网过滤，弃去液体，收集抗菌肽-麸皮复合物；

(4)干燥：将抗菌肽-麸皮复合物平铺后进行干燥，采用自然晾干或40-70℃热风干燥；

(5)真空包装：将干燥后的麸皮复合物进行真空包装，即得到吸附态的饲料级抗菌肽产品。

本发明的吸附剂为麸皮，类型有大片或小片状。

利用本发明的提取抗菌肽的方法从侧芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)发酵液中提取到饲料级的抗菌肽。

本发明提供的方法所得到的抗菌肽能够用于制备生物防腐剂。

本发明提供的方法所得到的抗菌肽能够用于制备饲料。

本发明提供的方法所得到的抗菌肽能够用于制备饲料添加剂。

本发明提供的从发酵液中快速提取抗菌肽的方法克服了现有技术的弊端，使用低成本的吸附剂麸皮，将抗菌肽直接吸附在麸皮上，其吸附率高达80％-90％，达到利用廉价的吸附剂从微生物发酵液中制备抗菌肽的目的，在获得抗菌肽高回收率的同时实现高抗菌活力和延长了保藏期。本发明方法提取工艺简单、绿色环保、成本低廉、缩短时间，该方法制备出安全、稳定的固态抗菌肽产品，可广泛应用于饲料工业，为抗菌肽的大规模制备提供了一种新方法，具有更广泛及实用的经济效果。

附图说明

图1是本发明工艺流程示意图；

图2是本发明产品的抗菌活性图，图中1为麸皮，2为抗菌肽-麸皮复合物；左图为4℃条件下保藏7天的抗菌活性实验，右图为4℃条件下保藏42天的抗菌活性实验。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入的各原料除特别说明外，均为市售。

实施例1

从侧孢短芽孢杆菌AS1.2738的发酵液中提取抗菌肽，获得饲料级抗菌肽产品，步骤如下：

(1)杀菌释放抗菌肽：将微生物发酵产生的发酵液用酸调pH至3，121℃加热15min，杀死产生菌、灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

(2)麸皮吸附：加入发酵液体积4％的麸皮进行吸附，吸附温度30℃，100r/min搅拌15min，使得抗菌肽充分吸附在麸皮表面，制成抗菌肽-麸皮的复合物。

(3)过滤：50目滤网过滤，弃去液体，收集抗菌肽-麸皮复合物。

(4)干燥：将抗菌肽-麸皮复合物平铺后进行干燥，可采用自然晾干或40℃热风干燥。

(5)真空包装：将干燥后的麸皮复合物进行真空包装，即得到吸附态的饲料级抗菌肽产品。

本发明的方法中，对实施例1流程中麸皮吸附抗菌肽的吸附率进行测定，结果显示吸附率为80％。

实施例2

从侧饱短芽孢杆菌AS1.2739的发酵液中提取抗菌肽，获得饲料级抗菌肽产品，具体步骤如下：

(1)杀菌释放抗菌肽：将微生物发酵产生的发酵液用酸调pH至5，121℃加热30min，杀死产生菌、灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

(2)麸皮吸附：加入发酵液体积7％的麸皮进行吸附，吸附温度40℃，150r/min搅拌30min，使得抗菌肽充分吸附在麸皮表面，制成抗菌肽-麸皮的复合物。

(3)过滤：用纱布或滤布过滤，弃去液体，收集抗菌肽-麸皮复合物。

(4)干燥：将抗菌肽-麸皮复合物平铺后进行干燥，可采用自然晾干或55℃热风干燥。

(5)真空包装：将干燥后的麸皮复合物进行真空包装，即得到吸附态的饲料级抗菌肽产品。

本发明的方法中，对实施例1流程中麸皮吸附抗菌肽的吸附率进行测定，结果显示吸附率为90％。

实施例3

从侧孢短芽孢杆菌AS1.864的发酵液中提取抗菌肽，获得饲料级抗菌肽产品，步骤如下：

(1)杀菌释放抗菌肽：将微生物发酵产生的发酵液用酸调pH至6，121℃加热20min，杀死产生菌、灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。

(2)麸皮吸附：加入发酵液体积10％的麸皮进行吸附，吸附温度50℃，200r/min搅拌60min，使得抗菌肽充分吸附在麸皮表面，制成抗菌肽-麸皮的复合物。

(3)过滤：用纱布或滤布过滤，弃去液体，收集抗菌肽-麸皮复合物。

(4)干燥：将抗菌肽-麸皮复合物平铺后进行干燥，可采用自然晾干或70℃热风干燥。

(5)真空包装：将干燥后的麸皮复合物进行真空包装，即得到吸附态的饲料级抗菌肽产品。

本发明的方法中，对实施例1流程中麸皮吸附抗菌肽的吸附率进行测定，结果显示吸附率为接近97％。

实施例4

抗菌肽的确定采用国际公认的“蛋白酶敏感法”，将实施例1-3获得的发酵液分别进行如下处理：1、10000rpm离心15min去除菌体得到上清液，然后经0.22μm滤膜过滤除确保去除菌体；2、将上清液pH调至6.5以排除有机酸的作用；3、取等量样液，分别与10mg/mL的蛋白酶(胃蛋白酶、蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K)溶液1∶1体积混合，在37℃恒温水浴锅中反应2h，反应结束后100℃沸水浴中煮沸5min灭酶；4、分别取蛋白酶处理前后的样品，用琼脂扩散法测定抑菌圈直径，并进行比较。结果表明：发酵液对蛋白酶E和胃蛋白酶敏感，抑菌圈直径分别减小至8.0和14.0mm，特别是经蛋白酶E处理后抑菌活性完全损失，这表明实施例1-3制得的该物质为抗菌肽。

实施例5保藏期实验

将实施例1-3制得的饲用抗菌肽分别在4℃条件下保藏6周，在保藏第7天和第42天分别取出0.05g麸皮态产品，采用琼脂扩散法检测其抑菌活性，37℃恒温静置培养箱中培养12h，观察抑菌圈变化情况。，结果见附图2所示，保藏42天的产品和保藏第7天相比，抑菌圈直径基本相同，可见麸皮态抗菌肽的抗菌效果未见明显下降。因此，本发明获得的饲用抗菌肽产品不仅有较高的抗菌活性，并且能够保持较长的保藏期。

实施例6抑菌效果实验

将实施例3制得的饲料级抗菌肽进行抑菌实验，采用琼脂扩散法测定抗菌肽产品的抑菌谱，结果发现本发明提供的饲用抗菌肽产品——麸皮吸附态抗菌肽具有较高的抗菌活性，不仅能抑制革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、藤黄微球菌、乳酸乳球菌等，而且对革兰氏阴性菌如沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌其均有较好的抑菌效果。实验结果证明本发明获得的饲用抗菌肽产品具有较高的抗菌活性，对多种食源性腐败菌和致病菌有显著的抑菌效果。

表1麸皮吸附态抗菌肽的抑菌谱

注：“++++”表示抑菌圈直径大于20mm；“+++”表示抑菌圈直径大于15mm小于20mm。

实施例7饲用效果实验

将实施例1-3制得的饲用抗菌肽用于肉鸡的饲养，添加方法见表2所示，结果表明肉鸡饲喂30天后，添加抗菌肽产品的低剂量组和高剂量组和没有添加抗菌肽的对照组相比，存活率分别提高5％、10％；体重普遍增加，并且高剂量组大于低剂量组(和对照相比，低剂量组平均增重69g，增重率为5.24％；高剂量组平均增重210g，增重率为15.95％)。这表明饲用抗菌肽安全性高，并且对肉鸡有促生长的效果。

表2饲用抗菌肽用于肉鸡饲料的添加方法

一种从发酵液中快速提取饲用抗菌肽的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。