专利摘要
本发明提供了结合朊病毒蛋白的配基以及使用该配基检测或除去样品、如生物学流体或环境样品中朊病毒蛋白的方法。配基能够结合一种或多种形式的朊病毒蛋白，包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)，感染性朊病毒蛋白(PrPsc)，和重组朊病毒蛋白(PrPr)。配基结合各种物种、包括人和仓鼠的朊病毒。也提供了一种治疗受试者中朊病毒相关病理或延缓其进展的方法。
说明书
本分案申请是基于申请号为200380109043.3，申请日为2003年12月03日，发明名称为“朊病毒蛋白配基和使用方法”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2002年12月3日申请的，序列号为No.60/430,423的美国临时专利申请的利益。
发明领域
该发明涉及蛋白配基相互作用领域，更具体地涉及结合朊病毒蛋白的配基的鉴定和使用该配基检测或除去生物学样品中朊病毒的方法。
发明背景
天然或细胞朊病毒蛋白“PrPc”在整个哺乳类中广泛分布，并具有格外高度保守的氨基酸序列和蛋白结构。感染性朊病毒被认为是由正常细胞朊病毒蛋白(PrPc)的修饰型组成，被称做“PrPsc”。朊病毒与其它感染性病原体有一些共同的性质，但似乎不合有核酸。相反，推测非感染性PrPc向感染性PrPsc的转变涉及翻译后的构象变化，在这期间α螺旋被转换为β-折叠片。PrPc含有3个α螺旋，少有β-折叠片结构；相反，PrPsc富含β-折叠片。据认为PrPc转变为PrPsc会导致产生感染性海绵状脑病(TSEs)，其间PrPsc积聚在中枢神经系统(CNS)中，并伴有神经病理性改变和神经学功能障碍。PrPsc，通常称作朊病毒蛋白的“瘙瘁病(scrapie)”型，被认为对动物和人的这些感染性神经变性疾病的传播和发病机理是必须的并且可能是足够的。
TSEs的具体实例包括瘙痒病，其影响绵羊和山羊；牛海绵状脑病(BES)，其影响牛；感染性水貂脑病，猫海绵状脑病和长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和麋鹿的慢性萎缩病(CWD)。在人类，TSE疾病可自我表现为库鲁病(kuru)、克-雅综合症(CJD)、格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征(GSS)、致死性失眠症和变异克-雅综合症(vCJD)。vCJD最近在人类出现是BSE在英国流行的结果，很有可能是由于消费了来源于感染了BSE或“疯牛病”的牛的食物产品所致。在上世纪从80年代中期到90年代早期，在英国有未知数目的人摄入了被BSE感染的牛的神经组织潜在性污染的食物。因为这种经口感染的疾病的潜伏期在人类可能超过二十年，因此vCJD的准确发病率可能许多年都不明显。迄今为止，已知超过130个人已经感染这种疾病，主要在英国；然而，加拿大、法国、香港、爱尔兰、意大利和美国也有病例报道。被污染的牛饲料产品从英国向全世界的出口表明BSE有可能全球存在，因此有发生cVJD的可能性。与这些观察一致的是在大多数欧洲国家、日本和以色列检测到BSE。所以，从包括食物产品的各种材料中检测和除去感染性朊病毒蛋白的能力是极其重要的。
在历史上，TSEs的诊断是基于该疾病临床症状的出现，而且只有通过对死后脑组织的组织学检查才能够确认。所有TSEs的特征是缺乏对病因的可测量的宿主免疫应答。因此，没有抗体产生，不能使用常规的血清学试验鉴定被感染的动物。最近，对脑中异常朊病毒蛋白的鉴定已经提高了做出疾病诊断的能力。
除了摄入牛来源的被感染产品，输血和器官移植代表了另一种在人类中传播vCJD的潜在方式。人类通过输血传播vCJD的可能性目前尚不知道，但是基于从实验动物模型、包括从经口实验性感染BSE的绵羊和天然感染搔痒病的绵羊传播的数据，这似乎非常有可能。和其它人类TSEs不同，PrPsc存在于vCJD病人的淋巴网状系统中，因此增加了传染原存在于血液中以及其通过输血传播的可能性。提高对通过输血传播的风险关注的其它因素包括未知数目、但是推测有大量的人暴露于BSE并且缺乏vCJD临床前诊断性试验。而且，在灵长类和小鼠中的物种适应后，vCJD的毒力似乎增强，提示人和人之间的传播可能比从牛到人的传播更有效。因此，急需用于防止vCJD通过输血传播的方法。这样的措施可能包括感染供体的早期鉴定以及动物来源食品和旨在用于动物或人类消费或应用的健康产品、人和牛来源的血源性产品、以及器官移植中TSE病原的延迟，除去和灭活。不幸的是，PrPsc显著耐受化学和物理灭活方法，选择性的灭活方法很难找。
通过与配基的特异性相互作用除去朊病毒似乎更有希望。已经鉴定出许多结合朊病毒蛋白的配基。如在PCT/US01/11150中所描述的，已经尝试了从组合肽文库中筛选出能和在所有已知哺乳动物朊病毒蛋白中发现的八肽重复序列(PHGGGWGQ(SEQ ID NO：220))结合的配基，而且发现了一系列的配基。其它材料包括各种聚合物，例如，TosoBioSep的氨基聚丙烯酸甲酯、常用的离子交换树脂(见美国专利No.5,808,011，Gawryl等)、与淀粉样斑块相互作用的配基，例如刚果红(Ingrosso，L.，等，Congo red prolongs the incubation periodin scrapie-infected hamsters.J.Virology 69：506-508(1995))、4-碘，4-脱氧阿霉素(Tagliavini，F.，等，Effectiveness ofanthracycline against experimental prion disease in Syrianhamster.Science 276：1119-1122(1997))、两性霉素B、卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等，Porphyrin and Phthalocyainine antiscrapiecompounds，Science 287：1503-1506(2000))、金属(Stockel等，Biochemistry，37，7185-7193(1998))、以及与PrP相互作用形成复合体的肽(见美国专利5,750,361，Prusiner等，和Soto，C.等，Reversion of prion protein conformational changes insynthetic β-sheet breakerpeptides，Lancet，355：192-197(2000))、肝素和其它多硫酸化聚阴离子(Caughey，B.，等，Binding of the Protease-sensitive form ofprion protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and CongoRed，J.Virology 68：2135-2141(1994))、抗体(Kascsak，R.J.，等，Immunodiagnosis of prion disease，Immunological Inyest.26：259-268(1997))，以及其它蛋白，例如纤溶酶原(Fischer，M.B.等，Binding of disease-associated prion protein to plasminogen.，Nature 408：479-483(2000))。目前，尽管一些配基在特定的环境中可能有用，但是还没有完全表征一个配基或者发现它能结合来自多种介质的朊病毒(见美国专利No.5,808,011，Gawryl等)。
到目前为止，人类TSE疾病100％是致命的。不幸的是，尽管已经报道有许多化合物可能是有前景的治疗剂，包括两性霉素，硫酸化聚阴离子、刚果红染料以及蒽环抗生素，但所有化合物均显示较微弱的阻碍朊病毒增殖的潜能，没有一个显示对从感染宿主中除去预先存在的朊病毒有任何影响。因此，仍急需新的治疗试剂。
在许多其它疾病中，其中许多疾病是神经性疾病，正常可溶蛋白的装配和分解形成构象改变和不溶形式被认为是致病过程。疾病的发生和从正常形式转变到构象改变蛋白之间的关系还很不清楚。除了朊病毒外，这种不溶蛋白的实例还包括：阿尔茨海默氏(Alzheimer′s)病和脑淀粉样血管病(CAA)的淀粉样蛋白斑中的β-淀粉状蛋白肽；帕金森氏(Parkinson′s)病的Lewy小体中的α突触核蛋白(α-synuclein)沉积物、在额颞叶痴呆(frontal temporal dementia)和皮克(Pick’s)病中神经原纤维缠结中的tau、肌萎缩性脊髓侧索硬化中的超氧化物歧化酶；以及亨廷顿(Huntington′s)病中的亨廷顿蛋白(huntingtin)。
一般这些高度不溶的蛋白形成由具有β-片层构象共有特征的无分支原纤维构成的聚集物。在中枢神经系统中，淀粉状蛋白可存在于脑和脑脊膜血管中(脑血管沉积)以及脑实质(斑块)中。在人和动物模型中神经病理学的研究表明邻近淀粉样沉积物的细胞的正常功能受到扰乱。
神经炎斑块形成的确切机制以及斑块形成与疾病相关性神经变性过程的相互关系在很大程度上还不清楚。为理解其转变的过程以及发现将与疾病相关形式特异性相互作用的结构，都需要有可容易地分离或可区别蛋白的两个或多个构象型(例如PrPc和PrPsc)的方法学。当前分离或区别同种型的方法学包括：在存在离液剂如尿素的聚丙烯酰胺凝胶即横向尿素梯度胶中的不同迁移率；对蛋白酶，例如蛋白酶K(PK)处理的不同敏感性，称作PrPres的PrPsc的PK耐受性消化产物的检测；不同的温度稳定性；在非离子型去污剂中的相对溶解度；以及纤维结构结合某些化学物质(例如刚果红和异黄酮S)的能力。然而，仍迫切需要鉴定对构象发生改变的蛋白、尤其是疾病相关型蛋白特异的高亲合力试剂。这种试剂将可用于开发可能的诊断性试剂盒，分离和纯化不同形式的蛋白，用于从治疗剂、生物产品、疫苗、和食品中除去所述疾病的感染型，以及用于治疗。
发明概述
本发明提供了结合朊病毒蛋白的配基及其应用。所述配基是与朊病毒分析物以选择性和特异性相结合的肽。它们能够结合朊病毒蛋白中的一种或多种形式，包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)、感染性朊病毒蛋白(PrPsc)以及重组朊病毒蛋白(PrPr)。该配基可结合来自各种物种，包括人和仓鼠的朊病毒。也提供了包含在支持物如树脂或膜上的朊病毒蛋白结合配基的组合物。
配基可用于从样品中检测或除去朊病毒蛋白，所述样品例如是生物学流体或环境样品。配基可用于检测或除去样品中所有的朊病毒蛋白，或可选择性地挑选以检测或除去朊病毒蛋白的单一型，因此配基可用于在来自患人TSEs的病人和患瘙瘁病、BSE和CWD的动物的样品中区分感染性和非感染性朊病毒蛋白。
也提供了一种治疗受试者中朊病毒相关病理或延缓其进展的方法。例如，本发明的配基可用于治疗病变，如CJD、vCJD、GSS、致死性失眠症、瘙痒病、BSE和CWD。这种配基可能是通过抑制PrPsc的聚合或通过抑制PrPsc和PrPc的相互作用、从而延缓PrPsc的进一步进展而起作用的。
本发明的另一方面提供了用于鉴定额外配基，特别是对蛋白的构象改变形式特异的配基的方法，其中的一些形式参与疾病的发展。所描述的方法学也适合开发、评价或筛选直接结合PrPsc的大量潜在的药物候选物。
从下面详细的描述和优选的实施例中明显可知本发明的其它特征和优势。
附图的简要描述
图1来自结合脑匀浆物的haPrPc和haPrPsc的组合文库的珠中的化学发光信号。通过特异性单克隆抗体(3F4)与缀合了对3F4特异的二抗的碱性磷酸酶的结合检测PrPc和PrPsc。在放射自显影胶片上检测对碱性磷酸酶特异性的化学发光底物所产生的光。对组合文库的珠所产生的信号的位置编号。随后对珠上的配基测序。这些珠在转移和变性之前不产生信号，但是在结合蛋白的转移和变性以及用缀合3F4抗体的酶标记之后，发射出强信号。
图2显示了正常人脑提取物中的huPrPc与柱样形式的亲和树脂的结合。制备脑匀浆物和珠，并在磷酸盐(PBS)或柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)缓冲液中平衡。蛋白印迹上信号的强度是结合到树脂上的PrPc的强度的函数。泳道1包含分子量标准(MW)；泳道2 20ul 0.1％正常人脑匀浆物。泳道3-8，从珠中洗脱的PrPc。
图3显示了CJD感染的人脑的提取物中huPrPsc以分批形式与亲和树脂的结合。该图是蛋白印迹，其中显示与含有散发性CJD病人的huPrPsc的组织匀浆物相接触后从珠中洗脱的朊病毒量。在与已用PK处理以显示PrPres的存在或者保持未处理的组织匀浆物接触后，冲洗珠。将它们在含有SDS的缓冲液中煮沸以释放结合蛋白，在蛋白印迹之后通过SDS-PAGE拆分样品。用单克隆抗体3F4探针探测后，由PrP特异性条带的出现证明huPrPsc和PrPc与树脂的结合。在凝胶的顶端显示了肽序列。PK消化的样品表示为(+)，未消化的为(-)。
图4CJD感染人脑的提取物中的huPrPsc与柱形式的亲和性树脂的结合。在凝胶的顶端显示肽序列。事先用PK消化过的样品以+表示，未消化的以-表示。对照包括20ul 1％脑匀浆。使用单克隆抗体3F4特异性检测PrPc和PrPsc，并通过化学发光信号的检测使其可见。
图5“珠印迹”转移方案的图示。在与起始材料孵育之后在凝胶中排列珠。结合蛋白从珠上转移并如所示通过缓冲液的毛细管转移捕获在膜上。
图6通过各种亲和树脂从感染的RBCCs中除去PrPres。用患瘙痒病的仓鼠的脑匀浆使红细胞浓缩物(RBCCs)致敏，并顺序通过具有不同亲和配基的树脂柱。通过凝胶电泳分析树脂结合型蛋白。凝胶上样的方式显示于表11中。
发明详述
这里描述了结合朊病毒蛋白的配基及其应用。所述配基是能够以特异性和亲和性结合朊病毒蛋白的蛋白、肽或多肽。优选地，配基具有6kDa或更低的分子量。
配基可用于检测样品、如人或动物来源的生物学流体或环境样品中朊病毒蛋白的方法，以及诊断和治疗朊病毒疾病的方法。例如，本发明的配基可用于使用全血、血液成分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、泪液、扁桃体、阑尾和其它样品治疗诊断病变如CJD、vCJD、GSS、致死性失眠症、瘙痒病、BSE和CWD以及其它TSEs。配基也可用于从样品中除去朊病毒蛋白，所述样品例如是血液样品、血液成分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、泪液、扁桃体、阑尾和其它样品。配基用于在样品中检测或从中除去所有朊病毒蛋白，或者可选择性的选取以检测或除去朊病毒蛋白的单一形式，因此可用来区分样品中的感染性和非感染性朊病毒蛋白。
所描述的方法可用于从聚合物、合成化合物以及合成化合物文库中筛选朊病毒的额外配基。
这里也提供了鉴定额外配基，特别是对蛋白的构象改变形式特异的配基的方法，其中的一些改变形式与是疾病的进展有关。
也提供了适于发现、评价或筛选大量潜在药物候选物的方法学。
定义
这里使用的术语“一个”、“一种”、“这个”和“这种”定义为“一个或多个”或“一种或多种”，还包含多个(种)的情形，除非上下文显示不适当。
术语“3F4”指对PrPc的天然型，但不对天然PrPsc或PrPres特异的单克隆抗体。抗体对仓鼠和人类PrPc，PrPsc和PrPres的变性形式有特异性。
如这里使用的，术语“血源性组合物”和血液组合物可交换地使用，意思是包括全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、富含血小板和缺乏血小板的成分、血小板浓缩物、白细胞、血浆沉淀物、血浆分级分离沉淀物和上清液，包括IgA、IgE、IgG和IgM的免疫球蛋白制品、纯化的凝血因子浓缩物、纤维蛋白原浓缩物，或来源于人类或动物的各种其它组合物。其也包括通过现有技术中的各种常用方法中的任何一种方法，包括离子交换、亲和、凝胶渗透、和/或疏水层析或通过示差沉淀所制备的纯化的血源性蛋白。
术语“组合文库”指通过固相组合化学技术合成的化学制剂的集合。这个定义包括使用产生数百万有明确长度的随机肽或可设计成包括明确结构的分离-偶联-重组方法。构件可以是天然氨基酸、合成分子、氨基酸类似物、分枝类似物、三嗪染料等。
术语特定序列的“保守性变异”或“保守性修饰变异”指氨基酸或其它具有实质性化学相似性的密切相关的结构。此外，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小比例氨基酸的各取代、缺失或添加是保守性修饰变异，其中所述变异导致用化学上相似的氨基酸取代另一种氨基酸。提供功能相似性氨基酸的保守取代表是本领域公知的。在下面的六组中，每一组都含有可相互进行保守性取代的天然氨基酸：
1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
许多非天然氨基酸也被视为是天然存在的氨基酸的保守取代。如果当序列排列以达到最大对应时，两个序列中的氨基酸残基序列相同，那么这两个多肽可以说成是“同一的”。可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性排列算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(US.AJ 85：2444(1988)的相似性搜索方法、通过电脑完成这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过检查，进行序列的最佳排列以便比较。
术语“配基”指与蛋白、肽或多肽结合的分子。本发明的配基可以是抗体制剂、蛋白、肽、多肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、糖、脂类、有机分子、聚合物、和/或推定的治疗剂等。
术语“蛋白”、“肽”、“多肽”、和“寡肽”可交换使用，这里被定义为氨基酸链，其中碳通过由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间的缩合反应所形成的肽键相连接。在链一端的末端氨基酸(即氨基末端)有游离氨基，而在链的另一端的末端氨基酸(即羧基末端)有游离羧基。这样，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)指肽的氨基末端处氨基酸上的游离氨基，或者指肽内任何其它部位处的氨基酸的氨基(当参与肽键时指亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”(缩写为C-末端)指肽的羧基末端处氨基酸上的游离羧基，或者指肽内任何其它部位处氨基酸的羧基。当在树脂上通过Merrifield合成法合成时，通常通过与固定化氨基的肽键将C-末端羧基偶联到树脂上。
典型地，按顺序对组成肽的氨基酸编号，从氨基末端开始，并且向肽的羧基末端的方向增加。因此，当提及一个氨基酸“跟随”另一个时，则后一氨基酸比“前面的”氨基酸更靠近肽的羧基末端。
术语“PrPc”指在哺乳动物体内自然而广泛表达的天然朊病毒蛋白分子。其结构高度保守，而且与疾病状态不相关。
术语“PrPsc”指PrPc分子的构象改变型，其被认为是有感染性的，而且与TSE/朊病毒疾病有关，包括vCJD、CJD、库鲁病(kuru)、致命性失眠症、GSS、瘙瘁病、BSE、CWD，以及俘获和实验动物的其它罕见TSEs。它和正常的细胞PrPc有相同的氨基酸序列，但已经将其中一些α-螺旋转换成了β-片层，并且与疾病状态有关。
术语″PrPres″指在用PK部分消化PrPsc后仍然存在的PrPsc蛋白的27-30kDa蛋白酶耐受性衍生物。
术语″PrPr″指通过重组技术表达的朊病毒蛋白。
术语″PrP″指一般的朊病毒蛋白。
这里使用的术语“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入到寡肽中的氨基酸(D或L)或氨基酸模拟物。这样，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限制，还可包括以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物(即氨基酸模拟物)。此外，酰胺键模拟物包括本领域技术人员公知的肽骨架修饰。
术语“基本相同”意思是多肽包含至少66％或更多相同氨基酸的序列。多肽序列基本相同的另一个指征是一种肽是否与针对所公开的肽产生的抗体有免疫学反应性。因此，本发明的肽包括与针对所公开的免疫原性肽所产生的抗体有免疫学反应性的肽和其它化学物质。
这里使用的术语“能够结合”指两个或多个分子在其中所述两个或多个分子能够形成复合体、例如蛋白质-配基复合体的条件下相互结合而形成复合体，例如，配基与蛋白或肽的结合。
结合PrP的特定氨基酸序列的配基
这里所描述的朊病毒结合配基都是小分子，优选肽。配基结合来源于朊病毒蛋白的肽、多肽，或者整个朊病毒分子。如在这里使用的，术语“肽”没有暗示特定的长度。优选地，这里所描述的配基结合具有下列氨基酸序列中的一个或多个的朊病毒蛋白：
RYPxQ(SEQ ID NO：221)，其中x是G，P或N
XxYYux(SEQ ID NO：222)，其中x是任何氨基酸，u是R或Q
更优选地，配基结合具有下列氨基酸序列中的一个或多个的朊病毒蛋白：
RYPGQ(SEQ ID NO：1)
DRYYRD(SEQ ID NO：2)
QAYYQR(SEQ ID NO：3)
QVYYRP(SEQ ID NO：4)
当用于探测组合文库以筛选结合朊病毒的配基时，具有上面提供的一个或多个氨基酸序列的标记肽是有用的。优选地，当用于筛选文库以寻找朊病毒配基时，将肽在氨基末端放射标记和乙酰化，在羧基末端酰胺化。
这里所描述的配基的氨基酸序列缺少在WO01/77687中公开的氨基酸序列，其结合朊病毒蛋白的八肽重复序列。
在第一个优选的实施方案中，配基是具有可结合SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白或肽。在下面表1中所示的氨基酸序列(SEQ IDNO：5-13)是可结合SEQ ID NO：1的氨基酸序列的实例。因此，在第一个优选的实施方案的配基中包括了具有下表1所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO：1的6聚体，鉴定出了表1中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库，在表1包括的序列中表示为最后的A。本领域技术人员将会理解这里提供的配基不限于具有表1所示示范性序列的那些配基。
表1
结合SEQ ID NO：1的6氨基酸序列
在第二个优选的实施方案中，配基是具有可结合SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表2中所示的氨基酸序列(SEQ IDNOS：14-22)是结合SEQ ID NOS：2的氨基酸序列的实例。因此，在第二个优选的实施方案的配基中包括了具有在表2所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO：2的6聚体，鉴定出了表2所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库，在序列中表示为最后的A。赖氨酸(K)出现11次，组氨酸(H)出现7次，二者都高于分布平均值-3。因此，优选含有赖氨酸(K)或组氨酸(H)的6聚体。本领域的技术人员将会理解这里所提供的配基不限于具有表2所示示范性序列的那些配基。
表2
可结合SEQ ID NO：2的6-氨基酸序列
在第三个优选的实施方案中，配基是具有可结合SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表3中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：23-31)是可结合SEQ ID NO：3的氨基酸序列的实例。因此，在第三个优选实施方案的配基中包括了具有表3所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO：3的6聚体，鉴定出了在表3中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库，在序列中表示为最后的A。若在鉴定中序列并不明确，在表中则针对单个位置给出一个或多个氨基酸，例如，如在SEQ ID NO：29中所示的(A/G)。这些序列中组氨酸(H)出现10次，在8种肽中的6种中均存在，明显高于平均分布值-3。除了SEQ ID NO：23之外的所有肽在pH 7时有净正电荷。因此，优选含有组氨酸(H)的6聚体和在pH 7时带有净正电荷的肽。本领域技术人员将会理解这里所提供的配基不限于具有在表3中所示示范性序列的那些配基。
表3
结合SEQ ID NO：3的6-氨基酸序列
在第四个优选的实施方案中，配基是具有可结合SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：31-47)是可结合SEQ ID NO：4的氨基酸序列的实例。因此，在第四个优选实施方案的配基中包括了具有表4中所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO：4的6聚体，鉴定出了表4中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库，在序列中表示为最后的A。本领域的技术人员将会理解这里所提供的配基不限于具有表4中所示示范性序列的那些配基。若在鉴定中序列不明确，则在单个位置给出一个或多个氨基酸，例如SEQ ID NO：33中所示的(W/G)。不能明确鉴定出SEQ ID NO：37中第二位的氨基酸。序列“LL”(两个亮氨酸)出现在SEQ ID NOS：31，32，41，43和45中，其密切的类似物LI，VL，II(异亮氨酸或缬氨酸)出现在SEQ ID NOS：33，36，38，40和44中。LL不出现在朊病毒衍生肽或蛋白的任何其它筛选中。此外，17种肽中的15种含有芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸(F，W或Y)。7种肽序列呈电荷中性，但具有带正电的末端氨基。因此，优选在序列中含有一个或多个亮氨酸(L)或亮氨酸类似物、如异亮氨酸或缬氨酸(I或V)(优选LL，LI，VL或II)的6聚体；含有芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸(F，W或Y)的6聚体；以及呈电荷中性、但具有带正电的末端氨基的六聚体。
表4
可结合SEQ ID NO：4的6-氨基酸序列
结合仓鼠PrPc的配基
在另一个实施方案中，配基是以特异性和选择性结合在特定物种、例如人类或其它哺乳动物(如仓鼠)中发现的一种或多种形式的朊病毒蛋白的肽。下面提供了结合朊病毒蛋白(PrPc)的示范性配基，所述配基具有不同的氨基酸序列长度，2聚体，3聚体，4聚体，5聚体和6聚体，优选具有6kDa或更低的分子量。
在SEQ ID NOS：48-50中显示了可结合仓鼠天然朊病毒(haPrPc)的示范性二聚体配基，其列于表5A中。配基优选含有色氨酸(W)。优选的配基是电荷中性的，但在pH 7时具有带正电荷的末端氨基。优选的配基是含有色氨酸(W)的2聚体。萘基-丙氨酸(na)取代色氨酸也导致这些序列中PrP的结合。将文库直接合成在树脂(Toyopearl氨基树脂Tosoh Bioscience LLC，Monctgomerville，PA)上，没有间隔子。在筛选中2次(2x)发现SEQ ID NO：50。
表5A
结合haPrPc的2-氨基酸序列
2x表示筛选中发现2次的序列
在SEQ ID NOS：51-61中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示例性3聚体配基，其列于表5B中。芳香族氨基酸F，W或Y出现在除了SEQ ID NO：60之外的所有选择出的肽中。氨基酸A在最靠近树脂的位置出现3次，并在一些文库中用作树脂和肽文库之间的间隔子。R和K都不存在，但是E出现3次，为8种序列中的3种提供负电荷。
图5B
可结合haPrPc的3-氨基酸序列
在SEQ ID NOS：62-64中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性4聚体配基，其列于表5C中。用在树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建文库，该丙氨酸出现在下面序列中的最后位置。芳香族氨基酸出现在所有所选肽的第一个位置处。另外，所有选择的肽在第3或第4位置上含有酸性氨基酸(D或E)。WXD出现1次，其中X是任何氨基酸。
表5C
可结合haPrPc的4-氨基酸序列
在SEQ ID NOS：65-68中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性5聚体配基，其列于表5D中。芳香族氨基酸和酸性氨基酸出现在所有选择的肽中。D或E出现在所有配基的第4或5位上。序列WXD出现在SEQ ID NO：65，67和68中。
表5D
可结合haprPc的5-氨基酸序列
在SEQ ID NOS：69-100中显示了结合仓鼠朊病毒(haprPc)的示范性6聚体配基，其列于表5E中。构建在树脂和组合肽之间有丙氨酸间隔子的文库，该丙氨酸在下面序列中存在于最后位置处。芳香族氨基酸F，W或Y出现在几乎全部(32个中的29个)所选的肽中，D或E也一样(32个中的29个)。另外，20个肽在其序列中有2个芳香族氨基酸。共有序列“WXD”出现在SEQ ID NOS：75，79，83，86和89中。含有(F/W/Y)X(D/E)(F/W/Y)SEQ ID NO：))的序列出现在SEQ IDNOS：71，73，77，78，91和95中，(F/W/Y)(D/E)X(F/W/Y)SEQ ID NO：))出现在SEQ ID NOS：70，72，82，91和95中。32个肽中的24个肽在1-3位上有芳香族氨基酸，外加酸性基团；23个在4-6位上有净负电荷。20个肽既在1-3位上有芳香族氨基酸外加酸性氨基酸，又在4-6位上有净负电荷。
表5E
结合haprPc的6-氨基酸序列
结合仓鼠PrPc和仓鼠PrPsc的配基
在另一个实施方案中，配基是以特异性和选择性结合两种或多种形式的朊病毒的肽。下面提供了可结合(PrPc)和/或构象改变的(PrPsc)朊病毒蛋白的配基。在SEQ ID NOS：101-115中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性3聚体配基，其列于表6中。芳香族氨基酸出现在几乎全部(18个中的15个)所选的肽中，D或E也一样(18个中的15个)。另外，7个肽有两个芳香族结构和一个酸性氨基酸。序列WXD出现在SEQ ID NOS：105和115中。所选的结合PrPsc比结合PrPc优先的结构是SEQ ID NOS：111和SEQ ID NO：114，两者在位置3处都有R。在3聚体文库中鉴定了SEQ ID NO：101-115可结合来自感染瘙痒病的脑的匀浆物本身(*)或其与正常仓鼠脑的混合物中的haPrPc和/或PrPsc。
表6
结合haPrPc和haPrPsc的3-氨基酸序列
结合人PrPc的配基
下面提供了可结合(huPrPc)朊病毒蛋白的配基。在SEQ ID NOS：116-139中显示了可结合人朊病毒(haPrPc)的示范性3聚体配基，其列于表7A和B中。在三聚体序列(表7A)中，W/YXD在6个三聚体序列中的4个中出现，且6个序列中的5个有疏水性和酸性氨基酸残基。
表7A
结合huPrPc的3-氨基酸序列
用树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建6聚体文库，该间隔子在下面序列中处于最后位置(表7B)处。氨基酸F，W或Y出现在18个6聚体肽中的13个，D或E出现在18个肽中的17个内。6个肽在1-3位上有芳香族和酸性氨基酸，而且在4-6位上也是净负电荷。另外，5个肽有2个芳香族结构和一个酸性氨基酸。WxD存在于SEQ ID NO：124中，(F/W/Y)x(D/E)(F/W/Y)(SEQ ID NO：223)存在于SEQ ID NOS：124和133中。除N-末端氨基电荷外，大多数序列具有负电荷，仅SEQ ID NO：139在中性pH携带部分净正电荷。在3聚体文库中鉴定了SEQ ID NOS：116-121可结合正常人脑匀浆物中的huPrPc。在6聚体文库中鉴定了SEQ ID NOS：122-139可结合缺乏血小板的人血浆或富含血小板的人血浆(*)来源的huPrPc。
表7B
结合huPrPc的6-氨基酸序列
*结合富含血小板的血浆来源的huPrPc
结合人重组PrP的配基
下面提供了可结合重组朊病毒蛋白(PrPr)的配基。在SEQ ID NOS：54，105，140-153中显示了可结合重组人朊病毒(huPrPr)的示范性3聚体配基，其列于表8中。氨基酸W，F或Y出现在所有选取的16个肽中，D或E出现在16个肽的13个中。共有序列WXD出现在SEQ ID NOS：105，143和145中。一些肽以前被鉴定出可结合PrPc，SEQ ID NOS：149和153在本次筛选中两次被鉴定出来。在3聚体文库中鉴定了SEQ IDNOS：54 105，140-153可结合用(*)0.5％十二烷基肌氨酸钠或(**)PBS稀释的huPrPr(Prionics AG，Switzerland，Cat.#03-040)。在表8中，每柱中将2.5mg干重的组合文库的树脂接触稀释在0.5％十二烷基肌氨酸钠(*)或含有1％BSA的磷酸缓冲盐水(**)稀释的0.5μg/mlPrPr。在筛选中2次发现的序列表示为2x。
表8
与huPrPr结合的3-氨基酸序列
(*)用0.5％十二烷基肌氨酸钠稀释的人PrPr
(**)用PBS稀释的人PrPr
2x表示在筛选中发现2次的序列
结合人PrPc，人PrPsc或二者的6聚体配基
表9A中提供了结合朊病毒蛋白(PrPc)、构象改变的朊病毒蛋白(PrPsc)或二者的6聚体配基。用树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建6聚体文库，该间隔子在下面序列中处于最后位置处。该配基可优先结合huPrPsc。在SEQ ID NOS：154-173中显示了示范性配基，其列于表9A中。除了SEQ ID NO：156外，所有配基都含有芳香族氨基酸，20个肽中的15个含有酸性氨基酸。那些对huPrPsc的特异性比PrPc的特异性更高的是SEQ ID NO：154，155和156。通过在将蛋白从珠转移到膜上之前对PrPc的选择性蛋白水解可检测对散发CJD患者来源的脑匀浆物中PrPsc的特异性增高的配基。这种文库包括非天然芳香族氨基酸2-萘基-丙氨酸(na)。
表9A
结合huPrPc，huPrPsc或二者的6-氨基酸序列
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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