专利摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用海洋低温(+)γ‑内酰胺酶高立体选择性水解外消旋体(±)γ‑内酰胺制备(‑)γ‑内酰胺的方法。本发明利用海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL‑6)，保藏号为CGMCCNo.8580发酵产低温(+)γ‑内酰胺酶；在水相体系中立体选择性水解(±)γ‑内酰胺，制备光学纯(‑)内酰胺，在150g/L底物浓度条件下，产物(‑)内酰胺经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到产物(‑)内酰胺的光学纯度97％‑99.9％，化学纯度为96％‑99％。该海洋低温(+)(+)γ‑内酰胺酶法不对称水解(±)γ‑内酰胺制备(‑)γ‑内酰胺的方法，具有高立体选择性、高效率、高产率、高纯度、条件温和、环境友好等特点，且易于规模化生产，具有广泛应用前景。

权利要求

1.一种制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，采用具有立体选择性的海洋低温(+)γ-内酰胺酶，在水相体系，以(±)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺，步骤如下：(1)微生物菌株：假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)CGMCCNo.8580；(2)将步骤(1)的菌株接种于种子培养基中摇床培养，培养温度15～20℃；摇床转速160～220rpm；培养时间1～2天，得到种子液；其中，种子培养基为：酵母膏15.0～20.0g，蛋白胨5.0～10g，NaCl5.0～10.0g，MgSO40.05～0.2g，ZnSO4·7H2O1.0～5.0mg，自来水1.0L，pH为8.0～9.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；(3)将步骤(2)得到的种子液接入产酶培养基中培养，在摇床转速160～220rpm，15～20℃，培养2～5天，即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束；其中，产酶培养基为：牛肉膏10.0～15.0g，蛋白胨5.0～10.0g，乙酰胺10～20g，Tween80 0.2～0.6g，(NH4)2SO42.0～2.5g，KH2PO41.5～2.0g，MgSO40.1～0.3g，CaCl20.1～0.6g，ZnSO4·7H2O1.4～5.0mg，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；(4)将步骤(3)的培养物离心，取上清液，得到含有海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，冷冻干燥，保存备用；(5)反应体系的配制：以(±)γ-内酰胺为底物，用pH4～10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为5g/L～500g/L；(6)酶催化反应：在步骤(5)的单一水相反应体系中，加入步骤(4)的粗酶液100～500U/mL进行反应，反应温度为15～30℃，反应时间为5～24小时，摇床转速为100～220rmp；(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液，加入氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)混合，震荡后离心除去蛋白，上清液采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，在30～100℃下蒸发浓缩，-20～-4℃下冷却结晶，得到高纯度的(-)内酰胺，光学纯度97％-99.9％，化学纯度为96％～99％。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中假交替单胞菌的菌液涂布于平板筛选培养基，20℃下培养3～5天，挑取单菌落，进行活性测定；其中，平板筛选培养基为：酵母膏10.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g，NH4Cl 10.0g，Na2HPO4 1.2g，NaH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用海洋低温(+)γ-内酰胺酶高立体选择性水解外消旋体(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法。

背景技术

(+)γ-内酰胺酶(EC 3.5.2.-)属于酰胺酶，其中的(+)γ-内酰胺酶能够高效率的动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。(-)γ-内酰胺，即(-)-文斯内酯，是(1R,4S)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的简称，它是合成抗病毒药物碳环核苷化合物的一种重要手性中间体，是抗艾滋病药物(-)阿巴卡韦、抗流感药物帕拉米韦的合成原料。

抗艾滋病药物是一个巨大的市场，抗艾滋病药物的消耗，包括阿巴卡韦的需求量和销售量目前都在逐年递增；帕拉米韦是一种目前正在进行三期临床试验的治疗流感的药物。大家有目共睹的是，近几年来流感疫情发生了数次全球性的爆发，在这种形式下，迫切需要开发利用高效，低副作用的抗流感药物。而研究证明，帕拉米韦在治疗禽流感方面比“达菲”的效果更明显。综上所述，我们可以预见的是，由于阿巴卡韦和帕拉米韦的需求量的不断增加，作为重要手性原料的光学纯的(-)γ-内酰胺的产量需求今后也会不断的提高。目前阿巴卡韦在国内的研发尚处于起步阶段，未见产业化报道，一方面是专利的限制，更主要的原因是“(-)γ-内酰胺”的生产问题没有得到解决。传统化学方法合成的“γ-内酰胺”中，“(-)γ-内酰胺”和“(+)γ-内酰胺”各占50％，不能直接用来合成阿巴卡韦，而化学合成所采用不对称合成方法的缺点在于，原料昂贵，步骤烦琐，成本较高，不利于工业化生产。而通过(+)γ-内酰胺酶进行催化合成光学纯的(-)γ-内酰胺具有效率高，产物纯度高及对环境友好的特点。

海洋中微生物资源十分丰富，许多海洋微生物酶在低温条件下仍具有相对较高的活性，且代谢易于调控。在工业生产中应用低温微生物和低温酶具有以下优势：可以防止微生物污染的0～20℃范围内，低温微生物具有高生长速率、高酶活力及高催化效率，缩短处理过程，降低生产成本，节约能源；低温酶经温和的热处理即可丧失活力，而不会影响产品品质并易于规模化生产，使其研究与开发受到重视。

如果可以工业化大规模生产(-)γ-内酰胺，则可以解决目前以及今后国内医药企业在阿巴卡韦国产化过程中，关键手性中间体短缺的问题，填补国内(-)γ-内酰胺生产技术方法的空白，使阿巴卡韦的国产化变为可能。抗艾滋病药物的国产化可以极大地降低艾滋病治疗成本，减轻社会负担，具有极高的经济价值和社会价值，对于国家的疾病防治工作具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用海洋低温(+)γ-内酰胺酶高立体选择性水解外消旋体(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一株产高立体选择性海洋低温(+)γ-内酰胺酶酶活的菌株，其分类命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8580。

一种利用权利要求1所述菌株生产海洋低温(+)γ-内酰胺酶高立体选择性水解外消旋(±)γ-内酰胺，制备(-)内酰胺的方法，采用具有立体选择性的海洋低温(+)γ-内酰胺酶，在水相体系，以(±)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备(-)内酰胺，步骤如下：

(1)微生物菌株：假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCC No.8580；

(2)将步骤(1)的菌株接种于种子培养基中摇床培养，培养温度15～20℃；摇床转速160～220rpm；培养时间1～2天，得到种子液；其中，种子培养基为：酵母膏15.0～20.0g，蛋白胨5.0～10g，NaCl 5.0～10.0g，MgSO4 0.05～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.0～5.0mg，自来水1.0L，pH为8.0～9.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；

(3)将步骤(2)得到的种子液接入产酶培养基中培养，在摇床转速160～220rpm，15～20℃，培养2～5天，即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束；其中，产酶培养基为：牛肉膏10.0～15.0g，蛋白胨5.0～10.0g，乙酰胺10～20g，Tween80 0.2～0.6g，(NH4)2SO4 2.0～2.5g，KH2PO4 1.5～2.0g，MgSO4 0.1～0.3g，CaCl2 0.1～0.6g，ZnSO4·7H2O 1.4～5.0mg，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；

(4)将步骤(3)的培养物离心，取上清液，得到含有海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，冷冻干燥，保存备用；

(5)反应体系的配制：以(±)γ-内酰胺为底物，用pH4～10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为5g/L～500g/L；

(6)酶催化反应：在步骤(5)的单一水相反应体系中，加入步骤(4)的粗酶液100～500U/mL进行反应，反应温度为15～30℃，反应时间为5～24小时，摇床转速为100～220rmp；

(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液，加入氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)混合，震荡后离心除去蛋白，上清液采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，在30～100℃下蒸发浓缩，-20～-4℃下冷却结晶，得到高纯度的(-)内酰胺，光学纯度97％-99.9％，化学纯度为96％～99％。

具体地，步骤(1)中假交替单胞菌的菌液涂布于平板筛选培养基，20℃下培养3～5天，挑取单菌落，进行活性测定；其中，平板筛选培养基为：酵母膏10.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g，NH4Cl 10.0g，Na2HPO4 1.2g，NaH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明利用筛选获得的海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCC No.8580，生产具有高立体选择性的低温(+)γ-内酰胺酶，在水相体系中，水解外消旋体(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺。在300g/L底物浓度下，产物(-)γ-内酰胺的光学纯度(ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶的达到光学纯的(-)γ-内酰胺，产物的光学纯度97％～99.9％，化学纯度为96％～99％。该生物酶法不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高效率、高产率、高纯度、条件温和、环境友好等特点，本发明在自然温度下应用、无需加热和冷却系统，易于规模化生产，产品性能稳定，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

图2为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶最适作用温度结果；

图3为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶最适作用pH及其稳定性结果；

图4为本发明海洋低温(+)γ-内酰胺酶制备高纯度的(-)γ-内酰胺的HPLC结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对说明书做进一步说明。

实施例1

所述的一种海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCCNo.8580生产海洋低温(+)γ-内酰胺酶的方法，包括以下步骤：

(1)利用保藏的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)CGMCC No.8580的菌液涂布于平板筛选培养基，20℃下培养3～5天，挑取单菌落，进行活性测定。

(2)将筛选的菌株接种于种子培养基，培养温度20℃，摇床转速2020rpm下培养2天，得到种子液；

(3)将种子液接入产酶培养基中培养，在摇床转速220rpm，20℃，培养3天，即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束，将培养物高速离心后获得上清液，即得到海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液(见图1)。

(4)将粗酶液低温透析浓缩得到浓缩酶液，冷冻干燥，保存备用；

(5)反应体系的配制：以(±)γ-内酰胺为底物，用pH4～10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为5g/L～500g/L；

(6)酶催化反应：在步骤(5)的单一水相反应体系中，加入步骤(4)的粗酶液100～500U/mL进行反应，反应温度为15～30℃，反应时间为5～24小时，摇床转速为100～220rmp；

(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液，加入氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)混合，震荡后离心除去蛋白，上清液采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥后进行手性HPLC检测(结果见图4)；

检测方法：采用日本岛津LC-20A，色谱柱型号为日本大赛璐手性色谱柱型号：CHIRALPAK AS-H 250×4.6mm；流动相：异丙醇/乙腈＝20/80(v/v)；流速：0.6ml/min；内标：0.1g/L苯甲酰胺；波长230nm；进样量：10μL。

(8)产物的分离提取：采用乙酸乙酯萃取步骤(7)中上清液，无水硫酸镁干燥，在30～100℃下蒸发浓缩，-20～-4℃下冷却结晶，得到高纯度的(-)γ-内酰胺，光学纯度97％～99.9％，化学纯度为96％-99％。

平板筛选培养基：酵母膏10.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g，NH4Cl 10.0g，Na2HPO41.2g，NaH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。

种子培养基为：酵母膏20.0g，蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，MgSO4 0.2g，ZnSO4.7H2O5.0mg，自来水1.0L，pH为8.00，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。

产酶培养基为：牛肉膏10.0g，蛋白胨5.0g，乙酰胺10g，Tween80 0.6g，(NH4)2SO42.5g，KH2PO4 1.5g，MgSO4 0.1g，CaCl2 0.1g，ZnSO4·7H2O 1.4mg，自来水1.0L，pH7.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。

实施例2温度对酶不对称水解制备(-)γ-内酰胺的影响

温度是影响酶作用的一个至关重要的因素，以(±)γ-内酰胺为底物，用pH8、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为150g/L。加入200U/mL粗酶液，反应时间为24小时，摇床转速为220rmp。将反应体系分别置于10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、70.0℃等环境考察酶的温度稳定性。从图2可见，(+)γ-内酰胺酶在不同温度下孵育30min后，在4℃下酶活力为100％，60℃时保持在80％以上，在70℃仍有50％活性，显示出该酶对温度的广泛适应性。(+)γ-内酰胺酶在低于20℃情况下仍能保持稳定的酶催化活力，这符合低温酶的生理特性，且在中低温环境下酶活保持较高水平，这对于药物的合成具有重要意义。

实施例3

以(±)γ-内酰胺为底物，底物浓度为150g/L。加入200U/mL粗酶液，反应时间为24小时，摇床转速为220rmp，温度20℃。用pH4.0～10.0、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，考察pH对该(+)γ-内酰胺酶活力的影响。如图3所示，该酶的最适作用pH为8.0。在pH为8.0时,酶活为最适pH时的90％左右，表明该酶在弱碱性环境下具有较好作用效果。该(+)γ-内酰胺酶的pH稳定性曲线表明pH范围在4.0～10.0、20.0℃保温2h，酶活力波动较大，pH稳定性一般。

实施例4

以(±)γ-内酰胺为底物，用pH8、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为150g/L。加入200U/mL粗酶液，反应时间为24小时，反应温度20℃，摇床转速为220rmp。反应体系中加入1mM不同的金属离子，考察其对酶活性的影响。主要表现在，金属离子不作为酶结构的一部分，但酶需要通过加入金属离子才能发挥其催化作用。早期研究表明K+、Na+、Mg2+和Ca2+是海洋环境中含量最丰富四种金属离子，可显著促进海洋低温酶活性。本研究中K+、Na+、Mg2+和Ca2+表现出一定提高(+)γ-内酰胺酶酶活效果(见表1)，证明其海洋来源酶的特性。

表1金属离子对海洋低温(+)γ-内酰胺酶活性的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

海洋低温(+)γ-内酰胺酶不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。