专利摘要

本发明公开了一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮(AD)的方法。将分枝杆菌Mycobacteriumsp.NRRLB‑3683菌种进行种子液培养，再将种子液接种到发酵培养基中培养以制备静息细胞，所得静息细胞在含葡萄糖的Tris‑HCl缓冲液中活化培养7h，然后投入底物植物甾醇和0.1vol.％的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备AD。本发明所用的脂肪酸季鏻盐离子液体对底物植物甾醇的溶解度高达483～616gL‑1，并随着离子液体阴离子烷基侧链的延长而增大，相比于普通商业化离子液体提高了100倍以上，能有效解决底物水溶性差的问题，结合离子液体对产物的原位萃取，提高过程转化效率，且离子液体用料极少，有利于节约生产成本。

权利要求

1.一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于包括以下步骤：

(a) 以菌种编号ATCC 29472的分枝杆菌Mycobacterium sp. NRRL B-3683为菌种，进行种子液培养；

(b) 将步骤(a)所得种子液接种到发酵培养基中培养，制备静息细胞，冷冻保存备用；步骤(b)中发酵培养基中添加1~2 g·L-1用tween 80水溶液预分散的植物甾醇作为诱导剂；

(c) 将步骤(b)所得静息细胞在含葡萄糖的Tris-HCl缓冲液中活化培养2~12 h，然后投入1~30 g·L-1底物植物甾醇和0.1~1 vol.%的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备雄烯二酮；步骤(c)中疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体为[P6,6,6,14][C11H23COO]、[P6,6,6,14][C13H27COO]或[P6,6,6,14][C15H31COO]。

2.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(a)中种子培养基中添加玻璃珠以分散细胞。

3.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(a)中种子液培养温度为28 ℃，摇床转速为180 rpm，培养时间为24~48 h。

4.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(b) 中的发酵培养和步骤(c)中生物转化反应在底部加工有2个大小15× 8×2 mm挡板的500 mL锥形瓶中进行。

5.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(b)中种子液接种量为8~12 vol.%，发酵培养温度为30℃，摇床转速为200 rpm，培养时间为48~60 h。

6.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(b)中发酵培养完成后，离心收集菌体，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，即得所述静息细胞。

7.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(c)中静息细胞浓度为50 g·L-1，葡萄糖浓度为2 g·L-1，Tris-HCl缓冲液为pH7.5、0.1 M。

8.如权利要求1所述两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法，其特征在于步骤(c)中生物转化反应温度为30℃，摇床转速为200 rpm。

说明书

技术领域

本发明涉及一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备雄烯二酮的方法。

背景技术

雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)是重要的甾体药物中间体，可用于合成上百种甾体激素类药物。以自然界中丰富的植物甾醇为底物，通过生物转化法制备AD具有广阔的应用前景。然而，分枝杆菌降解植物甾醇侧链得到AD需经过11种功能酶系协同催化的16步反应历程，迄今为止只能在全细胞中完成。存在着两个主要问题：(1)甾醇底物的低水溶性；(2)疏水性产物AD在胞内对细胞活性的抑制甚至毒性，以及析出后对底物颗粒和细胞的包结。通常，基于溶剂工程策略构建非水/水两相生物转化体系，能够促进底物溶解和实现产物的原位萃取，提高过程转化效率。

随着人们对绿色过程开发的要求越来越迫切，一种新型的绿色溶剂——离子液体以其独特的理化性质逐渐进入人们的视野。离子液体(ionic liquid,IL)是由阳离子和阴离子构成的在临界温度(一般为100℃)下呈液态的有机盐。目前常用的离子液体主要是由9类阳离子(烷基咪唑类、烷基吡啶类、季铵、季鏻、吡咯烷、哌啶、吗啉、胍类等)和28类阴离子(卤素类、六氟磷酸型、四氟硼酸型、硝酸型、磺酸型、羧酸型、亚胺型等)构成，主要用于有机合成和催化、萃取分离、电化学、功能材料等领域，将生物相容性差的离子液体直接用作生物催化反应介质会带来催化效率低、资源浪费、生态毒性等问题。因此，针对生物催化反应过程筛选和合成特定结构的离子液体是提高过程效率、实现绿色催化的途径之一。

离子液体/水两相体系用于全细胞生物催化过程的历史可以追溯到2000年(Biotechnology and Bioengineering.2000,69:227-233)。但是，离子液体在甾体药物生物转化中的应用还较少。2011年Wu等(Bioresource Technology.2011,102:9368-9373)在[BMIM][PF6]/水两相体系中进行黑根霉催化16α,17-黄体酮的11α羟化反应，转化率提高到90％以上。随后，Mao等(Biotechnology Letters.2012,34:2113-2117；Journal ofChemical Technology and Biotechnology.2013,88:287-292)也报道了在含离子液体体系中甾体药物羟化和脱氢反应。近期，Yuan等(Journal of Chemical Technology andBiotechnology.2016,91:2631-2637；ACS Sustainable Chemistry&Engineering.2017,5:10702-10709)选用13种常用商业化离子液体，系统评价了含离子液体体系中分枝杆菌降解植物甾醇侧链的反应，有效提高了转化效率。但是，商业化离子液体对甾醇溶解度依然不够高，而且对细胞的生物相容性也不理想。本发明结合甾醇的疏水性和氢键酸性及全细胞作为催化剂这两大特点，考虑以生物相容性好、氢键碱性强的生物分子脂肪酸为阴离子供体，生物相容性和溶解性能均较好的季鏻盐为阳离子供体合成离子液体，构建两相体系，进一步提高植物甾醇全细胞生物转化过程效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇全细胞生物转化制备AD的方法。

提供了一种离子液体/水两相体系中分枝杆菌静息细胞降解植物甾醇侧链制备AD的方法，包括如下步骤：

(a)以分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683(菌种编号ATCC 29472)为菌种，进行种子液培养；其中菌种可购买自https://www.atcc.org/Search_Results.aspx？dsNav＝Ntk:PrimarySearch％7c29472％7c3％7c,Ny:True,Ro:0,N:1000552&searchTerms＝29472&redir＝1。该菌种在CN1507489A中也有公开报导。

(b)将步骤(a)所得种子液接种到发酵培养基中培养，制备静息细胞，冷冻保存备用；

(c)将步骤(b)所得静息细胞在含葡萄糖的Tris-HCl缓冲液中活化培养2～12h，然后投入1～30g L-1底物植物甾醇和0.1～1vol.％的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体，进行离子液体/缓冲液两相生物转化反应，制备AD。

优选地，所述种子培养基中添加玻璃珠以分散细胞，种子液培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，培养时间为24～48h。

优选地，所述发酵培养在底部加工有2个大小约15×8×2mm挡板的500mL锥形瓶中进行，发酵培养基中添加1～2g L-1用tween 80水溶液预分散的植物甾醇作为诱导剂，接种量为8～12vol.％，发酵培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养时间为48～60h。发酵培养完成后，离心收集菌体，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，即得所述静息细胞。

优选地，所述静息细胞浓度为50g L-1，葡萄糖浓度为2g L-1，Tris-HCl缓冲液为pH7.5，0.1M，所述植物甾醇为白色粉末，主要成分为β-谷甾醇(45％)、豆甾醇(26.2％)、菜油甾醇(23.5％)和菜籽甾醇(3.2％)，纯度≥95％。

优选地，所述疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体的阳离子为三己基十四烷基鏻(P6,6,6,14+)，阴离子为含8～18个碳的脂肪酸根。合成步骤为：将三己基十四烷基溴化鏻通过强碱性阴离子交换层析柱得到三己基十四烷基氢氧化鏻，再与等摩尔量的脂肪酸混合，在圆底烧瓶中45℃下搅拌反应至完全中和，然后通过加热搅拌并伴随空气吹扫直至恒重，以除去溶剂，得到离子液体。

优选地，所述生物转化反应在底部加工有2个挡板的锥形瓶中进行，反应温度为30℃，摇床转速为200rpm。

本发明的优势在于：用于构建两相生物转化体系的疏水性脂肪酸季鏻盐离子液体对底物植物甾醇的溶解度达483～616g L-1，并随着离子液体阴离子烷基侧链的延长而增大，相比于普通商业化离子液体提高了100倍以上，能有效解决底物水溶性差的问题，结合离子液体对产物的原位萃取，提高过程转化效率，且离子液体用料极少，有利于节约生产成本。

附图说明

图1为合成的离子液体三己基十四烷基鏻辛酸盐([P6,6,6,14][C7H15COO])的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)谱图；

图2为合成的离子液体三己基十四烷基鏻辛酸盐([P6,6,6,14][C7H15COO])的13C NMR(500MHz,DMSO-d6)谱图；

图3为离子液体/水两相体系中植物甾醇生物转化过程机理示意图(a：单水相体系，b：离子液体/水两相体系，MB:分枝杆菌细胞，S：底物，P：产物，l：液态，s：固态，Eq：平衡状态)。

具体实施方式

以下的具体实施例对本发明展开了详细的描述，但本发明并不限制于以下实施例。

实施例1：三己基十四烷基鏻辛酸盐离子液体([P6,6,6,14][C7H15COO])/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD，具体如下：

步骤一：制备离子液体[P6,6,6,14][C7H15COO]。具体地，将[P6,6,6,14][Br]的乙醇溶液以流速1mL min-1通过填充有Dowex Monosphere 550A UPW(OH)强碱性阴离子交换树脂的层析柱，得到相应碱[P6,6,6,14][OH]的乙醇溶液。将其与等摩尔量的辛酸混合，在圆底烧瓶中45℃下搅拌反应12h至完全中和，然后通过加热搅拌并伴随空气吹扫直至恒重，以除去溶剂，得到室温下呈透明液体的离子液体[P6,6,6,14][C7H15COO]。

用核磁氢谱1H NMR和碳谱13C NMR表征合成的[P6,6,6,14][C7H15COO]。1H NMRδ/ppm(500MHz,DMSO-d6):0.84-0.89(15H,m；COO-C6-CH3and P-Cn-CH3),1.15-1.50(58H,m；COO-C2-(CH2)4,P-C-(CH2)n and COO-C-CH2),1.72-1.75(2H,t；COO-CH2),2.15-2.21(8H,m；P-CH2).13C NMRδ/ppm(500MHz,DMSO-d6):13.24(s；P-C4),13.94(s；COO-C8),17.09-17.47(d；P-C1),22.14(s；COO-C7),22.65-22.68(d；P-C3),23.30-23.43(d；P-C2),26.83(s；COO-C6),28.91(s；COO-C5),29.59(s；COO-C4),31.42(s；COO-C3),39.21(s；COO-C2),174.68(s；COO-C1)。谱图如图1和2所示。分析表明合成的离子液体结构无误且具有较高的纯度。

步骤二：种子液培养。在无菌条件下，将试管斜面分枝杆菌Mycobacteriumsp.NRRL B-3683菌株接种到装有50mL种子培养基和15颗玻璃珠的250mL锥形瓶中，在恒温振荡培养箱中28℃，180rpm条件下培养48h。

该种子培养基配方为：葡萄糖5g L-1，牛肉浸膏3g L-1，胰蛋白胨5g L-1，NaCl 15gL-1，甘油1.5vol.％，pH 7.0；115℃下高压蒸汽灭菌30min。

步骤三：发酵培养制备静息细胞。将培养2天的种子液以12vol.％的接种量转接到装有100mL发酵培养基的500mL具挡板锥形瓶中。其中，发酵培养基在灭菌前添加1g L-1用tween 80水溶液预分散的植物甾醇以诱导分枝杆菌产酶(控制最终培养基中tween 80浓度为0.05％)，置于恒温振荡培养箱中，在30℃，200rpm条件下培养至分枝杆菌细胞对数生长末期(60h)，此时细胞浓度和活性均较高且胞内酶量丰富。离心(4℃,8000rpm,2min)收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到湿细胞(即静息细胞，每克湿细胞约含干细胞重0.2g)，于-20℃冷冻储存备用。

该发酵培养基配方为：葡萄糖8g L-1，柠檬酸2g L-1，柠檬酸铁铵0.05g L-1，MgSO40.5g L-1，K2HPO4 0.5g L-1，(NH4)2HPO4 6g L-1，pH 7.0；115℃下高压蒸汽灭菌30min。

步骤四：离子液体/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD。有氧环境的分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解过程在100mL具挡板锥形瓶中进行。取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行两相体系生物转化反应前，先将50g L-1湿细胞和2g L-1葡萄糖添加到pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3g L-1植物甾醇和0.1vol.％的离子液体[P6,6,6,14][C7H15COO]，进行两相生物转化，以不添加离子液体的单水相体系作为对照。间隔2h取样用HPLC测定AD浓度，计算出AD时空产率(转化速率)为52mg L-1h-1，接近单水相体系中的AD产率(54mg L-1h-1)。

实施例2：三己基十四烷基鏻癸酸盐离子液体([P6,6,6,14][C9H19COO])/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD，具体如下：按实施例1的方法制备离子液体[P6,6,6,14][C9H19COO]，并进行核磁氢谱1H NMR和碳谱13C NMR的表征。

按实施例1的方法进行种子液培养和发酵培养制备静息细胞。

有氧环境的分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解过程在100mL具挡板锥形瓶中进行。取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行两相体系生物转化反应前，先将50g L-1湿细胞和2g L-1葡萄糖添加到pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3g L-1植物甾醇和0.1vol.％的离子液体[P6,6,6,14][C9H19COO]，进行两相生物转化，以不添加离子液体的单水相体系作为对照。间隔2h取样用HPLC测定AD浓度，计算出AD时空产率(转化速率)为54mg L-1h-1，与单水相体系中的AD产率(54mg L-1h-1)接近。

实施例3：三己基十四烷基鏻月桂酸盐离子液体([P6,6,6,14][C11H23COO])/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD，具体如下：

按实施例1的方法制备离子液体[P6,6,6,14][C11H23COO]，并进行核磁氢谱1H NMR和碳谱13C NMR的表征。

按实施例1的方法进行种子液培养和发酵培养制备静息细胞。

有氧环境的分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解过程在100mL具挡板锥形瓶中进行。取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行两相体系生物转化反应前，先将50g L-1湿细胞和2g L-1葡萄糖添加到pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3g L-1植物甾醇和0.1vol.％的离子液体[P6,6,6,14][C11H23COO]，进行两相生物转化，以不添加离子液体的单水相体系作为对照。间隔2h取样用HPLC测定AD浓度，计算出AD时空产率(转化速率)为78mg L-1h-1，远高于单水相体系中的AD产率(54mg L-1h-1)。图3展示了离子液体/水两相体系(b)和单水相体系(a)中的转化机理示意图，反映了两相体系对疏水性底物溶解和产物原位萃取所发挥的作用。

实施例4：三己基十四烷基鏻肉豆蔻酸盐离子液体([P6,6,6,14][C13H27COO])/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD，具体如下：

按实施例1的方法制备离子液体[P6,6,6,14][C13H27COO]，并进行核磁氢谱1H NMR和碳谱13C NMR的表征。

按实施例1的方法进行种子液培养和发酵培养制备静息细胞。

有氧环境的分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解过程在100mL具挡板锥形瓶中进行。取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行两相体系生物转化反应前，先将50g L-1湿细胞和2g L-1葡萄糖添加到pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3g L-1植物甾醇和0.1vol.％的离子液体[P6,6,6,14][C13H27COO]，进行两相生物转化，以不添加离子液体的单水相体系作为对照。间隔2h取样用HPLC测定AD浓度，计算出AD时空产率(转化速率)为60mg L-1h-1，高于单水相体系中的AD产率(54mg L-1h-1)。

实施例5：三己基十四烷基鏻软脂酸盐离子液体([P6,6,6,14][C15H31COO])/缓冲液两相体系中植物甾醇生物转化制备AD，具体如下：

按实施例1的方法制备离子液体[P6,6,6,14][C15H31COO]，并进行核磁氢谱1H NMR和碳谱13C NMR的表征。

按实施例1的方法进行种子液培养和发酵培养制备静息细胞。

有氧环境的分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解过程在100mL具挡板锥形瓶中进行。取出预先培养并在-20℃冷冻储存的分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683静息细胞作为生物催化剂。为提高催化速率，在进行两相体系生物转化反应前，先将50g L-1湿细胞和2g L-1葡萄糖添加到pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，在30℃和200rpm条件下活化7h。向体系中添加3g L-1植物甾醇和0.1vol.％的离子液体[P6,6,6,14][C15H31COO]，进行两相生物转化，以不添加离子液体的单水相体系作为对照。间隔2h取样用HPLC测定AD浓度，计算出AD时空产率(转化速率)为60mg L-1h-1，高于单水相体系中的AD产率(54mg L-1h-1)。

一种季鏻盐离子液体/水两相体系中植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。