专利摘要

本发明公开了一种提高虎乳灵芝酸灵芝多糖的方法，属于研究提高活性物质方法领域。本发明以虎乳灵芝生物量和活性物质产量为标准，在其液体发酵过程中添加不同柑橘皮水提物用来提高生物量和活性物质的产量，选择最佳柑橘皮和最佳柑橘皮浓度以及最佳柑橘皮组合浓度。本发明通过添加柑橘属果实皮水提物，可使虎乳灵芝的发酵液中三萜类物质提高22.65％～34.55％，虎乳灵芝酸含量提高至少1.13倍，灵芝多糖含量提高55.2～85.9％。

权利要求

1.一种提高虎乳灵芝功能成分产量的方法，其特征在于，向虎乳灵芝发酵过程中添加柑橘属果实的果皮提取物；所述功能成分为胞外多糖；所述柑橘属果实为橙；所述果皮提取物以水提物的形式添加；

水提物的提取方式为：称取10g柑橘皮加50mL水在沸腾状态水浴30min，过滤收集提取液，重复提取1次，滤液合并后，定容至200mL，得到浓度为50g/L的水提物；

果皮提取物的浓度为5-15g/L，或20g/L，或25g/L。

2.权利要求1所述方法在制备含虎乳灵芝胞外多糖的产品方面的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高虎乳灵芝酸灵芝多糖的方法，属于研究提高活性物质方法领域。

背景技术

虎乳灵芝Lignosus rhinoceros(Cooke)Ryvarden，是一种产于热带地区的大型食药用真菌，多孔菌科，距今已有400年历史，传说为母虎乳汁滴于地上而生。主要分布于中国海南省、马来西亚、菲律宾、泰国、印度尼西亚和东非一些国家和地区，价格昂贵，菌核是其药用部分，用于治疗肝癌、慢性肝炎、胃病等。经研究发现虎乳灵芝中至少含有2种或以上亲脂性甾体或萜类成分；其菌核中水溶性和非水溶性膳食纤维含量很高，高的膳食纤维含量和好的物理化学功能特性等，可作为多用途的低热量食物的配料，菌核作为膳食纤维有多个技术上的优势，如天然来源，以菌核为有效部位的食药用菌种类较少，可以充分利用这一特色加强产品开发，满足保健市场需求；菌核水提物有抗肿瘤和免疫调节作用，但具体成分还没有明确。另外，菌类学家认为孔菌多糖是具有开发前景的真菌多糖，其菌核多糖能刺激人体某些免疫细胞的增殖。近年来，虎乳灵芝野生资源过度采挖逐渐枯竭，人工栽培和液体发酵是解决问题的有效途径，由于人工栽培耗时耗力耗材，所以液体发酵将成为最有效的方法。

虎乳灵芝胞外多糖和虎乳灵芝酸是其重要的2种代谢活性产物，但是其本身菌核里的含量很低。

发明内容

为了改善虎乳灵芝菌核中活性物质产量低的问题，本发明提供了一种提高虎乳灵芝酸灵芝多糖的方法，是以生物量、胞外多糖和虎乳灵芝酸的产量为指标，利用柑橘皮的水提物进行发酵，寻求最佳发酵条件，为提高虎乳灵芝发酵合成胞外多糖和虎乳灵芝酸的工业化提供参考。

本发明的目的是提供一种提高虎乳灵芝酸功能成分产量的方法，所述方法是向虎乳灵发酵过程中添加柑橘属果实的果皮提取物。

在本发明的一种实施方式中，所述柑橘属果实包括柑橘、橙、柚、柠檬。

在本发明的一种实施方式中，所述果皮提取物是将1～25g果皮粉碎，加入100～150mL水，在沸腾状态水浴30～60min时间获得的果皮提取液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法以虎乳灵芝液体培养基为基础，向培养基中加入柑橘属果实的果皮提取液。

在本发明的一种实施方式中，所述功能成分包括虎乳灵芝酸和/或胞外多糖。

在本发明的一种实施方式中，所述柑橘属果实的果皮提取物为柑橘皮水提物，按如下步骤制备：称取10g粉碎、过筛后的柑橘皮，加50mL水在沸腾状态水浴30min，过滤收集提取液。重复提取1次，滤液合并后，定容至200mL，得到浓度为50g/L的柑橘皮水提物。

在本发明的一种实施方式中，所述不同浓度柚子皮是添加柚子皮水提物的浓度为0-25g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述水提是在80℃水浴下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述水提是反复提取3次，提取液合并。

本发明还提供所述方法在制备含虎乳灵芝酸或虎乳灵芝胞外多糖的产品方面的应用。

有益效果：本发明通过添加柑橘属果实皮水提物，可使虎乳灵芝的发酵液中三萜类物质提高22.65％～34.55％，虎乳灵芝酸含量提高至少1.13倍，灵芝多糖含量提高55.2～85.9％。

附图说明

图1为不同柑橘皮对虎乳灵芝生物量和活性物质产量的影响；

具体实施方式

虎乳灵芝生物量计算：取发酵液50mL离心，蒸馏水水洗3次，将沉淀烘干至恒重；所述离心是在10000rpm下离心10min；所述水洗，是将溶于水的物质去掉，只留下菌丝体；所述烘干，是将菌丝体放入60℃烘箱；所述恒重是烘干菌体质量不变。

乙醇沉糖是离心取上清、乙醇沉糖、过滤，得多糖。后的上清液，即提取液，加入，混匀、静置，得沉淀物；所述乙醇沉糖是用体积分数为70-80％的乙醇；所述乙醇沉糖是取离心后的上清液，即提取液，加入3-4倍体积的无水乙醇，混匀、静置，得沉淀物；所述离心是在8000rpm下离心10min。

虎乳灵芝酸是取粉碎过的菌丝体1g，根据料液比1:40的量加入85％乙醇依次在80℃下提取40min 3次，将3次的提取液合并浓缩。得到的提取物用30mL乙酸乙酯和30mL水萃取2次，将2次的提取液合并浓缩。用甲醇复溶，定容至10mL，用紫外分光光度计在254nm下测其吸光度。用甲醇溶解灵芝酸A标准品，同样的测量条件下得到标准曲线。所述料液比是菌丝体质量与提取溶剂的体积比；所述85％乙醇是乙醇的体积分数为85％；所述浓缩是50℃温度，减压蒸馏情况下进行；所述浓缩是45℃温度，减压蒸馏情况下进行；所述萃取是将乙酸乙酯和水溶解浓缩物质，去掉水层；所述萃取是反复萃取2次，萃取液合并；所述复溶，是用甲醇溶解浓缩物质。

胞外多糖测定：标准曲线的制作(苯酚-硫酸法)：以葡萄糖标准做标准曲线；以葡萄糖浓度为横坐标，各管的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并拟合线性回归方程：y＝13.627x+0.0274，R2＝0.9972。

虎乳灵芝酸测定：以灵芝酸A标准品(纯度>98％)做标准曲线，在波长为254nm的条件下检测紫外吸收值。以灵芝酸A浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，标准曲线方程：y＝16.001x-0.0148，R2＝0.9991。虎乳灵芝酸产量＝虎乳灵芝酸含量×生物量。所述虎乳灵芝酸含量是单位质量的菌丝体虎乳灵芝酸含量，单位是mg/g。

液体培养基配方(按g/100mL计)：KH2PO4 0.15，蔗糖2，酵母粉0.5。

实施例1：柑橘皮水提物制备

称取10g柑橘皮(已粉碎，过筛)，加50mL水在沸腾状态水浴30min，过滤收集提取液。重复提取1次，滤液合并后，定容至200mL，得到浓度为50g/L。

实施例2：添加不同柑橘属果实皮水提物

分别按照实施例1的方式制备不同柑橘属果实皮水提物，将橘子皮、柚子皮、橙子皮和柠檬皮分别以终浓度5g/L的添加量加入液体发酵液培养基中，研究不同柑橘皮水提物对虎乳灵芝液体发酵的影响，结果如图1。

对于生物量，在加入相同剂量(5g/L)柑橘皮的情况下，与不添加任何柑橘皮水提物的对照实验相比，柠檬皮和柚子皮对虎乳灵芝的生长有抑制作用，柠檬皮的抑制很明显，生物量下降很多，这和牛樟芝的生长情况相反，可能柠檬对不同食用菌的生长作用情况不同；柚子皮对虎乳灵芝的生长有一点抑制。另外两种柑橘皮对虎乳灵芝的生长几乎没有影响，对虎乳灵芝菌丝体的刺激作用较弱，而橘子皮对牛樟芝的生长促进作用很明显，橙子皮也很弱。虎乳灵芝对照组的生物量为24.45g/L，加入柠檬皮、柚子皮、橘子皮和橙子皮水提物的生物量分别为19.69、21.40、24.54和24.49g/L(图1)。

实施例3：柑橘皮水提物对虎乳灵芝多糖的影响

对于胞外多糖，对照实验组产量为3.19g/L，除了橙子皮水提物对胞外多糖的产量有促进作用，其他的柑橘皮水提物都会抑制多糖的合成(表1)。

表1不同柑橘皮对虎乳灵芝多糖的影响

对于虎乳灵芝酸，4种柑橘皮水提物对虎乳灵芝酸的合成都有一定促进作用，其中橙子皮和柠檬皮的水提物对虎乳灵芝酸的刺激作用较弱，橘子皮和柚子皮较其他柑橘皮刺激作用较强，对照实验组虎乳灵芝酸含量为5.21mg/g，添加橘子皮和柚子皮水提物的发酵液中含量分别为6.39mg/g和7.01mg/g，分别提高了22.65％和34.55％，表明这两种柑橘皮水提物对三萜类物质的合成有利(图1)。

实施例4：不同浓度柚子皮水提物对虎乳灵芝酸的影响

按照实施例3的方式分别向发酵培养基中加入不同终浓度的柚子皮水提物，对于生物量，添加不同浓度柚子皮水提物的发酵液中均低于对照实验，说明在实验剂量范围内，柚子皮水提物会抑制虎乳灵芝菌丝体的生长，浓度越高，虎乳灵芝生物量越低。对于虎乳灵芝酸，其含量随柚子皮浓度的升高而增加(表2)。

表2不同浓度柚子皮对虎乳灵芝的影响

实施例5：不同浓度橙子皮水提物对虎乳灵芝多糖的影响

按照实施例3的方式分别向发酵培养基中加入不同终浓度的橙子皮水提物，对于生物量，添加不同橙子皮水提物对虎乳灵芝的菌丝体生长影响不大。对于胞外多糖，橙子皮的浓度在5-15g/L之间时，多糖含量几乎不变，而超过15g/L时，随浓度升高虎乳灵芝多糖的含量越低，说明高浓度的橙子皮会抑制胞外多糖的合成(表3)。

表3不同浓度橙子皮对虎乳灵芝的影响

对比例1：Vc对虎乳灵芝的影响

按照实施例1的方式制备柑橘皮水提物，测定其中含有的Vc含量，测量得到柑橘皮水提物中维生素C含量为28.5mg/L。

向发酵液中添加与柑橘皮水提物同等终浓度的维生素C(以不添加柑橘皮水提物或维生素C的培养基作为对照组)，在相同条件下进行培养、发酵。对发酵液中的产物进行侧键，结果显示，和对照试验差别不大，所以排除了维生素C对虎乳灵芝发酵的影响(表4)。

表4 Vc对虎乳灵芝发酵的影响

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一种提高虎乳灵芝酸灵芝多糖的方法专利购买费用说明

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