IPC分类号 : C07D493/04I,A61P35/00I,C12P17/18I,C12N1/14I,C12P39/00I,C12R1/68N,C12R1/77N
专利摘要
本发明公开了一种ɑ‑吡喃酮化合物、制备方法，菌株及应用，本发明提供一种两株真菌在大米培养基上进行共培养的方法；本发明发酵大量产生的一种ɑ‑吡喃酮化合物(I)，产率达到4％，在抗肿瘤方面有一定的活性，后期可以进行结构修饰，制备其衍生物来大幅度提高其抗肿瘤活性，从而制备抗肿瘤药物；化合物I对A549人肺癌细胞株的抑制率为23.54％。本发明的ɑ‑吡喃酮化合物采用微生物发酵生产，操作工艺简单，周期短，成本低，对环境无污染。
权利要求
1.一种式(I)所示ɑ-吡喃酮化合物在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株Bel-7402或人结肠癌细胞株HCT-8；
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述ɑ-吡喃酮化合物按如下方法制备：(1)发酵培养：将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)D和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ZZP-R1分别接种至大米培养基的两侧，中间预留2-3cm宽度的培养基不接种菌株，在28℃恒温静置培养40-50天，在无菌操作下将两种菌的发酵混合物搅拌混合均匀，28℃下静置培养5天，获得发酵产物；所述大米培养基终浓度组成为：大米400-500g/L，溶剂为蒸馏水；所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)D保藏编号为CGMCC No.17762；所述尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)ZZP-R1保藏编号为CGMCC No.17763；(2)ɑ-吡喃酮化合物的分离纯化：①将步骤(1)制备的发酵产物，用等体积乙酸乙酯在超声辅助下萃取，过滤，有机层浓缩至无液体流出，得到浓缩物；②用甲醇溶解步骤①浓缩物得到悬浮液，再用两倍悬浮液体积的正己烷萃取，得到正己烷萃取层和甲醇层，将甲醇层用两倍体积的二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷萃取层；将二氯甲烷萃取层浓缩至无液体流出，获得浸膏；③将步骤②浸膏用正己烷溶解后上硅胶层析柱，以体积比99:1或98:2的二氯甲烷和甲醇为洗脱液，分别收集第15min或第12.5min出峰的流出液，真空去除流动相，得到式(I)所示ɑ-吡喃酮类化合物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于步骤(2)所述超声辅助条件为：40KHz超声15-20min。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于步骤③中硅胶柱规格为50cm*5cm，填充5倍浸膏量的200目硅胶。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述烟曲霉D和尖孢镰刀菌ZZP-R1接种至大米培养基前，先进行活化和种子扩大培养，再分别以体积浓度5％的接种量将种子液接种至大米培养基中，所述活化和种子扩大培养方法为：
(1)活化培养：将菌株D和菌株ZZP-R1接种至PDA斜面培养基，28℃培养箱保湿培养3-4天，活化菌种；PDA斜面培养基终浓度组成为：蔗糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15-18g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值；
(2)种子培养：从活化菌落中挑取一接种环菌体接种至PDB种子培养基，在200rpm、28℃条件下摇床培养3天，分别获得菌株D种子液和菌株ZZP-R1种子液；PDB种子培养基终浓度组成为：土豆200g/L，蔗糖20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
说明书
(一)技术领域
本发明涉及一种ɑ-吡喃酮化合物、制备方法，菌株及应用。
(二)背景技术
新型活性药物先导化合物的发现一直是药物化学家关注的热点。在从动植物资源寻找潜在药物远不能满足人类对疾病的治疗需求的情况下，微生物(主要是真菌和细菌)由于其繁殖快、易于培养等特点使其成为寻找新活性天然产物的重要选择。
研究表明，植物内生菌是微生物中丰富的功能性产物的重要组成。而滨海地区作为海洋和陆地的过渡带，其植物的生存环境非常特殊，既具有与海洋和陆地植物共同的一面，又有着不同于它们的独特一面，如沼泽化、盐渍化等。因此滨海植物的内生真菌作为海洋来源的真菌的一种，也有着更加不一样的生存和代谢机制，更易产生结构新颖活性较高的药物先导化合物。
目前ɑ-吡喃酮类化合物制备方法主要有化学合成和生物转化两种，其中化学合成目的性强、生产方便、生产条件可控、投资小、见效快，缺点是大多对环境有污染，产生三废治理花费高。而生物合成主要通过生物体的代谢来合成特定药物，是现代发酵工程、基因工程的扩展，该法对环境污染较小，适用于大规模生产药物。简而言之就是利用微生物将药物前体合成药物的过程。生物合成是现代药学发展的一个未来趋势，本专利提供的ɑ-吡喃酮化合物是通过微生物发酵产生的。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种ɑ-吡喃酮化合物、制备方法，菌株及应用，解决了这种ɑ-吡喃酮化合物大规模生产的问题，该方法为生物合成方法，对环境无污染，且此化合物具有一定的抗肿瘤活性，对活性药物先导化合物的发现起到促进作用。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种式(I)所示ɑ-吡喃酮化合物，具有如下化学结构：
第二方面，本发明提供一种所述式(I)所示ɑ-吡喃酮化合物的制备方法，所述方法为：(1)发酵培养：将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)D和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)ZZP-R1分别接种至大米培养基的两侧，中间预留2-3cm宽度的培养基不接种菌株，在28℃恒温静置培养40-50天，在无菌操作下将两种菌的发酵混合物搅拌混合均匀，28℃下静置培养5天，获得发酵产物；所述大米培养基终浓度组成为：大米400-500g/L，溶剂为蒸馏水；(2)ɑ-吡喃酮化合物的分离纯化：①将步骤(1)制备的发酵产物，用等体积乙酸乙酯在超声辅助下萃取，过滤，有机层(优选40℃低温真空浓缩)浓缩至无液体流出，得到浓缩物；②用甲醇溶解步骤①浓缩物得到悬浮液，再用两倍悬浮液体积的正己烷萃取(优选3次)，得到正己烷萃取层和甲醇层，将甲醇层用两倍体积的二氯甲烷萃取(优选3次)，得到二氯甲烷萃取层；将二氯甲烷萃取层浓缩至无液体流出(优选45℃低温真空浓缩)，获得浸膏；③将步骤②浸膏用正己烷(优选正己烷体积用量以浸膏重量计为5ml/g)溶解后上硅胶层析柱，以体积比99:1或98:2的二氯甲烷和甲醇为洗脱液，分别收集第15min或第12.5min出峰的流出液，真空去除流动相(优选50℃低温)，得到式(I)所示ɑ-吡喃酮类化合物。
所示液相仪器：UV-VIS，检测器：岛津SPD-16；高效液相输液泵：岛津LC-16P；色谱条件：C18色谱柱250×9.4mm，流速3.0mL/min，柱温30℃，检测波长210nm；流动相组成体积比分别为40:60的双蒸水:乙腈和35:65的双蒸水:甲醇。
步骤(2)所述超声辅助条件为：40KHz超声15-20min。所述萃取优选为3次，萃取后采用4层纱布过滤，合并有机层进行浓缩。
步骤③中硅胶柱规格为50cm*5cm，填充5倍浸膏量的200目硅胶。
所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)D和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ZZP-R1接种至大米培养基前，先进行活化和种子扩大培养，再分别以体积浓度5％的接种量将种子液接种至大米培养基中，所述活化和种子扩大培养方法为：
(1)活化培养：将菌株D和菌株ZZP-R1接种至PDA斜面培养基，28℃培养箱保湿培养3-4天，活化菌种；PDA斜面培养基终浓度组成为：蔗糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15-18g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值；
(2)种子培养：从活化菌落中挑取一接种环菌体接种至PDB种子培养基，在200rpm、28℃条件下摇床培养3天，分别获得菌株D种子液和菌株ZZP-R1种子液；PDB种子培养基终浓度组成为：土豆200g/L，蔗糖20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
第三方面，本发明提供一种式(I)所示ɑ-吡喃酮化合物在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞包括人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株Bel-7402，人结肠癌细胞株HCT-8，优选所述肿瘤抑制剂为A549人肺癌细胞株抑制剂，化合物I对A549人肺癌细胞株的抑制率为23.54％。
第四方面，本发明还提供一种用于制备式(I)所示ɑ-吡喃酮化合物的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)D，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年05月29日，保藏编号为CGMCC No.17762，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
第五方面，本发明提供一种用于制备式(I)所示ɑ-吡喃酮化合物的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ZZP-R1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年05月29日，保藏编号为CGMCC No.17763，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)本发明筛选到两株新菌株，并提供一种两株真菌在大米培养基上进行共培养的方法；
(2)本发明的发酵方法可制备生产ɑ-吡喃酮化合物(I)，在抗肿瘤方面有一定的活性，后期可以进行化学结构修饰，制备其衍生物来提高其抗肿瘤活性，从而制备抗肿瘤药物；化合物I对A549人肺癌细胞株的抑制率达23.54％。
(3)本发明的ɑ-吡喃酮化合物采用微生物固态发酵生产，操作工艺简单，周期短，成本低，对环境无污染。
(四)附图说明
图1为步骤2.1中初筛菌株抑菌实验照片，A为大肠杆菌、B为金黄色葡萄球菌、C为白色念珠菌。
图2为步骤2.3复筛中菌株58，3-11，F，5-19，D，BZ，3-8，4-12，B和28的发酵情况。
图3为菌株D的菌落形态。
图4为菌株D系统发育树。
图5为步骤3.2中ZZP-R1、R2、L1、L6、L9、L10、L16的发酵情况。
图6为菌株D的菌落形态。
图7为菌株ZZP-R1系统发育树。
图8共培养状态图，A为未搅拌图，B为搅拌图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株D和菌株ZZP-R1的分离、鉴定与保藏
1、培养基
PDB种子培养基终浓度组成为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
PDA培养基是在PDB培养基中加入20g/L琼脂。
WA培养基：琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.4。
LB固体培养基是在LB培养基中加入20g/L琼脂。
沙式液体培养基：胰蛋白胨10g/L、葡萄糖40g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。
沙式固体培养基是在沙式液体培养基中加入20g/L琼脂。
2、菌株D筛选及鉴定
菌株D来源于中国杭州湾沿岸地区滨海植物结香叶片中分离得到，菌株D初筛主要是由植物内生真菌菌体拮抗病原指示菌(细菌、真菌)及发酵液的抑菌活性来筛选。
2.1菌株D的采集
从中国杭州湾沿岸地区采集新鲜的结香(Edgeworthia chrysantha.，瑞香科、结香属植物，灌木)叶片，采样后立即用保鲜袋包好，置于保温盒中带回实验室，24h内进行内生真菌的分离。
首先用自来水冲洗新鲜的结香表面的污物，待自然晾干后，转移至超净工作台，无菌水冲洗3次，75％乙醇浸泡1min，1％次氯酸钠消毒浸泡1min，无菌水冲洗3次以上。吸取0.2mL最后一次处理的结香叶片的冲洗液，涂布于PDA培养基上，28℃恒温箱中培养3d。
再将消毒后的结香叶片样品用灭菌的解剖刀截成1cm左右的小段，呈45°角斜插入WA培养基表面，每个平皿放置3段，28℃恒温培养4～9d。待菌丝从切口处长出后，挑取菌丝转接至PDA培养基，进行内生真菌的划线分离，重复划线直至培养基中长出单一菌落为止。
最终分离得到十株单一内生真菌，分别记为菌株58、3-11、F、5-19、D、BZ、3-8、4-12、B、28。
2.2初筛
对步骤2.1获得的菌株采用抑菌活性实验进行初筛，抑菌活性实验采用琼脂块法，以透明抑菌圈的有无作为考察指标，对内生真菌进行活性初筛实验。先将指示细菌(大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC25923))活化，在无菌环境下，接种少量菌体至LB培养基上，置于37℃条件下恒温培养24h，同样方法将指示病原真菌(白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231))接种到PDA培养基上，28℃条件下培恒温培养48h时。指示菌活化过后，分别接种到液体培养基(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种到LB液体培养基，白色念珠菌接种到沙式液体培养基)中，培养24h制成一定浓度(约5×10
将初筛菌株在无菌条件下接种到新鲜PDA培养基上，置于恒温培养箱中27℃条件下培养5-8d。菌落成熟以后，用直径为6mm的无菌打孔器在菌落上制备菌饼，用无菌环挑取至带指示菌的平板上，细菌置于37℃条件下培养12-24h，真菌置于28℃条件下培养12-24h，观察和记录抑菌圈的有无(图1)。将获得的10株真菌中每株菌株对每种指示菌分别做3次平行试，初筛结果表明，10株结香来源内生真菌平板拮抗3株指示菌的能力不同，其中，菌28对3株指示菌的拮抗效果最佳，分别形成直径约为10、8、12mm的透明抑菌圈，菌5-19和菌3-8对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，菌D和菌B拮抗金黄色葡萄球菌形成透明抑菌圈，菌4-12对白色念珠菌的拮抗作用最显著，形成直径约为30mm抑菌圈，该初筛结果为实验内生真菌的选择提供了依据。
2.3复筛
复筛是对菌株利用发酵萃取技术提取粗提物，进行进一步活性测试，辅以粗提物氢谱特征确定活性菌株。
步骤2.2分离得到的10株菌斜面培养物经活化后接种至200mL PDB培养基中，摇床设定温度为27℃并且以145r/min的转速培养7-15d后，得到10株真菌发酵液。如图2所示，菌58培养13d发酵液呈灰绿色；菌3-11生长速度较快，7d后菌体开始出现自溶现象；菌F生长较缓慢；菌5-19菌体开始生长，菌液呈现奶白色，在发酵6d以后白色菌体逐渐加深，呈粉色，10d以后颜色继续加深，呈现深紫色；菌D生长较为缓慢，培养12-15d后发酵液呈现深绿色，延长发酵时间，菌液呈现黑色；菌BZ在培养过程中产色素；菌3-8生长迅速，发酵液呈深棕色；菌4-12生长速度较快，7d后发酵液呈黄色；菌B生长速度较为缓慢，菌体形状类似于树脂状，呈粉色；菌28在培养过程中菌体呈现絮状物，生长较快，发酵液颜色为淡黄色。发酵结束后用四层纱布过滤(弃菌丝)，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相，减压浓缩至无液体流出、干燥至恒重，获得内生真菌粗提物。
抗真菌活性实验：采用双层平板法，测定内生真菌粗提物的抑菌活性。取约10mL融化的WA培养基倒入直径为9cm的培养皿中，待其冷却后，将五个牛津杯均匀地放置在培养基上。将步骤2.1的白色念珠菌菌悬液与50℃左右的PDA培养基按1:1000的体积比充分混匀后，等量倒入已凝固并放置有牛津杯的WA培养基上，以制成带菌双层平板。待其冷却后，用镊子将牛津杯取出。然后每孔分别加入DMSO配制的粗提物样品100μL，浓度分别为10、1.0、0.1mg/mL。等体积的DMSO作为阴性对照，等体积的两性霉素B(300μg/mL)作为阳性对照，每组实验做3次平行。置于恒温培养箱中，30℃正置培养48h。
抗细菌活性实验：同样采用双层平板打孔法，具体步骤同上所述，只是菌液变成了步骤2.1制备的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液。等体积的DMSO作为阴性对照，等体积的氨苄青霉素钠溶液(溶剂为DMSO，200μg/mL对应大肠杆菌、2mg/mL对应金黄色葡萄球菌)作为阳性对照，每组做3次平行实验。30℃正置于恒温培养箱中，培养24h。
观察结果，如表1，菌D发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌在10mg/mL均存在明显抑制作用，在1mg/mL时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。形成直径大致为10-15mm的抑菌圈，菌5-19发酵液10mg/mL能够显著抑制金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生长，分别形成直径大于20mm，16-20mm的抑菌圈，菌BZ发酵液在在10mg/mL也对金黄色葡萄球菌的生长有较强抑制作用。由于菌D发酵产物对这三株指示菌拮抗作用明显，进一步为实验目标菌株提供筛选依据。
表1结香来源植物内生真菌的发酵液抑菌活性
(抑菌圈直径表示：-，无抑菌效果；+，＜10mm；++，10-15mm；+++，16-20mm；++++，＞20mm.)
2.4鉴定
2.4.1菌株D菌落特征
将菌株D接种于PDA斜面培养基，28℃活化3-4天，用接种环挑取已活化菌落于新的PDA培养基上，28℃恒温培养。菌丝稀疏；菌落深绿色，厚度小于1mm，培养4-5d后呈绒状，中心有突起，部分平板有辐射状皱纹，如图3所示菌D的菌落形态。
2.4.2菌株D总DNA的提取
将菌株D接种至PDA平板上，28℃培养7d后，菌落生长覆盖平板，刮取适量菌落，利用CTAB法提取真菌总DNA，操作步骤如下所示(试剂盒为Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒)：
(1)干燥菌丝，用液氮研磨成粉末，加入1.5mL离心管中；
(2)加入200μL Buffer Digestion，2μLβ-巯基乙醇，20μL Proteinase K；
(3)震荡混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解；
(4)加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min；
(5)室温1000rpm离心5min，将上清液转移到1.5mL离心管中；
(6)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀；
(7)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；
(8)将吸附柱放入收集管；
(9)1000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；
(10)将吸附柱放回收集管；
(11)加入500μL PW Solution，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；
(12)将吸附柱放入收集管；
(13)12000rpm室温离心2min，离去残留的Wash Solution；
(14)取出吸附柱，放入到一个新的离心管中；
(15)加入50μL TE Buffer静置3min，12000rpm室温离心2min；
(16)收集DNA溶液。
2.4.3PCR引物扩增
根据真菌18S rDNA保守区设计引物序列，选用通用引物NS1和NS6进行扩增。引物序列如下所示：
NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC
NS6：GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
表2 18S rDNA PCR扩增体系和条件
将测序样品按照编号顺序在样板上排列好，按照表格所示按顺序将样品加好，室温条件下，850rpm离心，盖好盖子振荡均匀。样品再经离心、变性、冰敷再离心操作后放入仪器中进行PCR序列扩增。PCR扩增流程如表3所示。
表3 PCR流程
2.4.4系统发育树的构建
菌株D的18S rDNA序列(SEQ ID NO.1所示)，提交GenBank(http://ncbi.nm.nih.gov/blast)中，进行BLAST序列比对，确定菌株的归属，然后进行序列对比分析，选择相似率较高的真菌18S rDNA序列进行下载，使用MEGA 6.0软件Clustal X方法系统分析，采用邻接法(Neighbor-Joining)，Boottrap值设置为1000对菌株D构建系统发育树，结果如图所示(图4)。最终结合形态学和分子生物学分析结果，将菌鉴定到种。
PCR产物经序列表明，菌株D18S rDNA序列长度为1339bp，将该序列提交NCBI Gen-Bank(GenBank序列编号为No.KR019681)，与数据库中序列进行BLAST比对，结果表明，菌株D的18S rDNA序列和Aspergillus fumigatus的相应序列的同源性为99％。为了确定菌株D的亲缘关系，选择GenBank中Aspergillus和邻近属代表性菌株的DNA序列，用Clustal X方法匹配排列，菌株D使用MEGA 6邻接法构建系统发育树，分析系统发育树(图4)显示该菌株D与Aspergillus fumigatus(Accession No.HM590663.1)聚在一支，支持率为100。同时结合该菌株的形态学特征，将菌株D归入烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)D，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年05月29日，保藏编号为CGMCC No.17762，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
3、菌株ZZP-R1筛选及鉴定
3.1菌株ZZP-R1的采集
从中国杭州舟山普陀岛沿岸地区采集新鲜的植物金不换(Abrus mollis，植物界被子植物门双子叶植物刚唇形目唇形科相思子属)叶片，采样后立即用保鲜袋包好,置于保温盒中带回实验室,24h内进行内生真菌的分离。
分离过程同上步骤2.1，最终分离得到7株单一内生真菌，编号为ZZP-R1、R2、L1、L6、L9、L10、L16。
3.2筛选
将分离得到的7株内生真菌菌斜面培养物在PDA培养基上28℃培养5d活化后，接种至200mL PDB培养基中，摇床设定温度为27℃并且以145r/min的转速培养15d后，得到7株菌发酵液。如图5所示，菌L1菌株生长缓慢，菌落初为白色，绒毛较粗，后由中间开始逐渐由红色变为黑色；菌L6生长速度较快，7d后发酵液呈黄色；菌L9生长速度也较快，7d后发酵液呈淡黄色；菌L10生长迅速，发酵液呈深红色；菌L16在培养过程中菌体呈现絮状物，生长较快，发酵液颜色为淡黄色；菌R1菌株在PDA培养基上生长快速，菌落肉色、突起絮状，菌丝白色质密，纺锤形的分生孢子；菌R2菌体开始生长，菌液呈现奶白色，在发酵6d以后白色菌体逐渐加深，呈淡黄色，发酵结束后用四层纱布过滤(弃菌丝)，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相，减压浓缩、干燥至恒重。
抑菌实验结果如表4，七株金不换内生真菌的发酵液粗提物在最高浓度10mg/mL下也仅对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。其中ZZP-L1和ZZP-R1对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，在1mg/mL下与阳性药物具有相同的抗菌活性；ZZP-L6、L9、L10、R2仅在最高浓度10mg/mL，与阳性药物具有相同的抗菌活性。
表4金不换来源七株植物内生真菌的发酵液粗提物抑菌评价结果
抑菌圈直径表示：-，无抑菌效果；+，<10mm；++，10-15mm；+++，15-20mm；++++，≥20mm
3.4鉴定
3.4.1菌落特征
菌株ZZP-R1接种于PDA斜面培养基，28℃活化3-4天，用接种环挑取已活化菌落于新的PDA培养基上，28℃恒温培养。生长快速，菌落肉色、突起絮状，菌丝白色质密，纺锤形的分生孢子。菌落形态如图6。
3.4.2菌株ZZP-R1总DNA的提取
实验步骤同2.4.2。
3.4.3PCR引物扩增
实验步骤同2.4.3。
3.4.4系统发育树的构建
菌株的18S rDNA序列(SEQ ID NO.2所示)，通过NCBI数据库(http://ncbi.nm.nih.gov/blast)进行BLAST序列比对，确定归属，选择相似度较高的序列，使用MEGA 6.0软件Clustal X方法进行系统分析，采用邻接(Neighbor-Joining)法构建系统发育树，并向NCBI GenBank提交获得GenBank序列编号。
菌株ZZP-R1的18S rDNA序列长度为1613bp，将序列提交NCBI GenBank数据库(GenBank序列编号为No.MF376147)，并进行BLAST比对，结果表明，菌株ZZP-R1的18S rDNA序列和Fusarium oxysporum相应序列的同源性为99％。选择GenBank数据库中Fusarium属及邻近属的菌株序列，用上述方法构建系统发育树，结果显示，菌株ZZP-R1与尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(Accession No.JF807402.1)聚在一支，支持率为99％(图7)。结合菌株ZZP-R1的平板形态及显微镜观察结果，将该菌鉴定为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)，命名为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)ZZP-R1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年05月29日，保藏编号为CGMCC No.17763，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2：菌株D和菌株ZZP-R1发酵培养液的制备
(1)活化培养：将菌株D和菌株ZZP-R1分别接种至PDA斜面培养基(同实施例1)，28℃培养箱保湿培养3-4天，活化菌种。
(2)种子培养：从活化菌落中挑取一接种环菌体接种至PDB种子培养基(同实施例1)，在200rpm、28℃条件下摇床培养3天，分别获得菌株D种子液和菌株ZZP-R1种子液。
(3)发酵培养：将步骤(2)菌株D种子液和菌株ZZP-R1种子液分别以体积浓度5％的接种量接种至大米培养基两侧，中间留一条宽3cm的培养基未接菌，在28℃恒温静置培养45天，两种菌渗透到底层大米培养基(图8中A)，在无菌操作下将两种菌发酵混合物搅拌混合均匀，继续在28℃下静置培养约4-5天至培养基被菌全部渗透，获得发酵产物(图8中B)。所述大米培养基每个1000mL锥形瓶中终浓度组成为：大米160g，蒸馏水400mL，121℃高压蒸汽灭菌30min。
实施例3：ɑ-吡喃酮化合物(I)的提取、分离与鉴定
1、ɑ-吡喃酮化合物(I)的提取与分离
将实施例2制备的发酵产物在超声辅助下用等体积乙酸乙酯萃取3次，每次40KHz超声15min，通过四层纱布过滤得到有机层，合并有机层并在40℃低温真空浓缩至无液体流出，得到浓缩物90g。浓缩物90g用100ml甲醇溶解得到悬浮液，用两倍悬浮液体积的正己烷萃取3次，得到正己烷萃取层和甲醇层，再将甲醇层用两倍体积的二氯甲烷萃取3次，得到二氯甲烷萃取层，并在45℃低温真空浓缩至无液体流出，获得浸膏20g；将浸膏20g用100ml正己烷溶解，上样硅胶层析柱(硅胶柱规格为50cm*5cm，填充5倍浸膏量的200目硅胶)，以体积比99:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱液，反相高效液相色谱检测，收集第15min出峰的流出液，或者以体积比98:2的二氯甲烷和甲醇为洗脱液，反相高效液相色谱检测，收集第12.5min出峰的流出液，50℃低温真空去除流动相，均得到所述的式(I)所示ɑ-吡喃酮类化合物，质量约3.6g。
所示液相仪器：UV-VIS，检测器：岛津SPD-16；高效液相输液泵：岛津LC-16P；色谱条件：C18色谱柱250×9.4mm，流速3.0mL/min，柱温30℃，检测波长210nm；流动相组成体积比分别为40:60的双蒸水:乙腈和35:65的双蒸水:甲醇。
2、化合物(I)的结构鉴定
将获得的化合物I进行质谱和核磁共振谱测定。
(1)质谱数据为：ESI-MS m/z 331.2[M+Na]
表5：化合物I的
综上所述，目标产物结构式为式(I)所示：
该化合物命名为：(7S，8R)-4,8-二羟基-3,8-二甲基-7-((S，E)-4-甲基己-2-烯-2-基)-7,8-二氢-2H，5H-吡喃并[4,3-b]吡喃-2-酮，英文名为neovasinin。
实施例4：化合物I的抗肿瘤活性评价
所述化合物I活性评价采用SRB法(磺酰罗丹明B比色法)，测试肿瘤细胞包括人肺癌细胞株A549，人肝癌细胞株Bel-7402，人结肠癌细胞株HCT-8，均来自中国医学科学院基础研究所细胞中心。
具体方法如下：
1.选用对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×10
2.按照每孔190μL细胞悬液接种在96孔培养板中，37℃，5％CO2培养24h，分为药物孔、对照孔和空白孔。
3.药物孔加入10μl化合物I样品溶液(生理盐水配制，化合物I加入终浓度5μg/ml)，对照孔加入终浓度为5μg/mL的5-FU(5-氟尿嘧啶)，空白孔加入等体积生理盐水，37℃，5％CO2培养3d。
4.弃去培养基，每孔轻轻加入100μL 4℃预冷的50％TCA用于固定细胞，先静置5min，然后再移至4℃放置1h。
5.倒掉固定液，蒸馏水洗涤5次去除TCA，空气干燥1h，每孔加入0.4％SRB溶液80μL，室温染色30min；
弃染液，1％醋酸洗涤5次充分去除未结合的SRB，空气干燥；每孔加入150uL10mMTrisbase(pH 10.5)溶解，微型振荡器上振荡5min。M5酶标仪测定OD510nm值，并计算肿瘤细胞的生长抑制率，计算公式为：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD药物)/(OD对照-OD空白)×100％。实验结果如表6所示。
6.所需的试剂制备方法为：
0.4％SRB溶液：称取0.8g SRB(磺酰罗丹明B)，溶于200mL 1％乙酸(溶剂为ddH2O)中，室温保存。
50％TCA溶液：称取50g TCA(三氯乙酸)，加水定容至100mL，4℃保存。
10mM Tris-base溶液：称取0.6057g Tris-base，加水定容500mL，pH 10.5，4℃保存。
表6：化合物I对3种癌细胞的抑制作用
体外抗肿瘤细胞活性评价结果表明，化合物I对三种肿瘤细胞均具有一定的生长抑制作用，表明化合物I在制备抗抗肿瘤药物中具有一定应用前景。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种ɑ-吡喃酮化合物、制备方法，菌株及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1024
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 1
gctcttggtg atcataataa cttaacgaat cgcatggcct tgcgccggcg atggttcatt 60
caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg tggcaacggg 120
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cggggaaact caccaggtcc agacaaaata aggattgaca gattgagagc tctttcttga 1020
tctt 1024
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)
<400> 2
aaaagtcgta acaaggtctc cgttggtgaa ccagcggagg gatcattacc gagtttacaa 60
ctcccaaacc cctgtgaaca taccacttgt tgcctcggcg gatcagcccg ctcccggtaa 120
aacgggacgg cccgccagag gacccctaaa ctctgtttct atatgtaact tctgagtaaa 180
accataaata aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac 240
gcagcaaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa 300
cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct 360
caagcacagc ttggtgttgg gactcgcgtt aattcgcgtt cctcaaattg attggcggtc 420
acgtcgagct tccatagcgt agtagtaaaa ccctcgttac tggtaatcgt cgcggccacg 480
ccgttaaacc ccaacttctg aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt 540
aag 543
一种ɑ-吡喃酮化合物、制备方法，菌株及应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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