专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种家禽原始生殖细胞的尼罗红染色方法，步骤为：将尼罗红/甲醇溶液用不含钙镁离子的PBS稀释后，加入PGCs细胞中，吹打形成悬浮的单个细胞，室温避光染色5‑10 min；然后离心取沉淀以不含钙镁的PBS清洗；最后加入稀释后的Hoechst 33342溶液，室温避光染色2 min，即完成对原始生殖细胞的染色；本发明首次将尼罗红染料用于鉴定原始生殖细胞，弥补了现有鉴定方法试剂价格昂贵、操作时间长、实验结果不稳定等缺陷，适用于固定的原始生殖细胞和活的原始生殖细胞，染色步骤简单、快速，染色效果稳定，可重复性高，宜广泛推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种家禽原始生殖细胞的尼罗红染色方法。

背景技术

禽类原始生殖细胞（PrimordialGermCells，PGCs）是一类具有独特的迁移路线的细胞，其起源于X期的胚盘上胚层，经下胚层移动到原条期的生殖新月部位，后进入胚胎血管系统，随血液循环迁移至生殖原基附近定居，同时分化成精子或卵子。

研究表明，发育不同时期的与冷冻保存的PGCs均具有迁移、分化的能力，基于此，可以利用PGCs制备种系嵌合体，使供体PGCs能分化成有功能的配子，进而获得纯合的PGCs供体后代，实现家禽遗传资源的长期保存与保护，此外，科研人员还利用体外分离培养的PGCs，通过制作嵌合体为手段进行动物发育、分化及转基因动物等多方面的研究，因此，PGCs在禽类遗传资源保存、禽类发育分化等方面都有广泛的研究和应用价值。

目前，PGCs的鉴定方法主要有以下三种：一是形态学观察，即利用PGCs比一般体细胞较大、含有脂肪滴颗粒的特点进行鉴定；二是利用组织化学方法PAS染色，该法又称过碘酸雪夫染色或糖原染色；三是抗原抗体染色，常用的抗体有antiSSEA-1、antiEMA-1和antiCVH。但是这三种方法在实践中都存在各种弊端，形态学观察只是一种辅助观察，不能作为细胞鉴定的方法，PAS只能鉴定发育到4期以后的PGCs（4期前的PGCs不含有糖原），而抗原抗体染色存在反应非特异性，即阳性反应的有一部分并非是PGCs，而且染色方法耗时长，可重复性亦不理想。

尼罗红染料是检测细胞内脂肪滴的经典染料，常用于脂肪细胞的特异染色，利用尼罗红染料进行脂肪细胞染色时，一般在染色前将脂肪细胞用1.5%戊二醛进行固定，然后再利用0.1-0.01mg/mL的尼罗红染色5分钟；若以这种方法直接对PGCs进行染色，则可能会因为原始生殖细胞与脂肪细胞存在细胞种类上的差异，而导致染色效果达不到要求，因此目前尚未见利用尼罗红染料对家禽原始生殖细胞进行染色的相关报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种利用尼罗红染料对家禽PGCs进行染色鉴定的方法，具有快速、简便、稳定的特定，本发明是这样实现的：

一种家禽原始生殖细胞的尼罗红染色方法，其具体步骤如下：

（1）将1mg/mL的尼罗红/甲醇溶液用不含钙镁离子的PBS稀释100倍后，加入PGCs细胞中，吹打形成悬浮的单个细胞，接着室温避光染色5-10min；

（2）1500rpm离心5分钟，取沉淀以不含钙镁的PBS清洗；

（3）将Hoechst33342溶液用不含钙镁的PBS稀释至10μg/ml，加入沉淀中，室温避光染色2min，即完成对原始生殖细胞的染色。

进一步，本发明所述家禽原始生殖细胞的尼罗红染色方法中，所述PGCs细胞是这样获得的：取发育至55-60h的鸡胚或发育至3.5-4d的鹅胚，从卵黄静脉中采集血液；然后放入含有10%FCS的TCM199离心管中，3000rpm，离心5min，取沉淀加入0.1mL的TCM199，再加入0.9mL16%Ficoll，混匀后加入0.2mL6.3%的Ficoll，800×g离心30min；移走离心管表面100μL液体，接着取离心管表面200μL液体溶于300μL的TCM199中，1500rpm离心5min；取沉淀再溶于300μL的TCM199中，如此重复三次，第四次离心获得的沉淀即为纯度为50-70%的PGCs；

进一步，本发明所述家禽原始生殖细胞的尼罗红染色方法中，所述PGCs细胞是这样获得的：取发育至6-7d的鸡胚或发育至8-9d的鹅胚，采集胚胎的两侧生殖腺；用不含钙镁离子的PBS将0.25%胰蛋白酶-EDTA稀释3倍，然后将采集到的生殖腺置于稀释后的胰蛋白酶-EDTA中，37℃消化5min，最后加入DMEM终止消化，于1500rpm离心5分钟，取沉淀加入KnockOutDMEM，置于37℃、5%CO₂环境中培养3-4h，最后收集培养液，1500rpm离心5min，即获得纯度为60-80%的PGCs。

与现有技术相比，本发明提供的尼罗红染色方法，适用于固定的原始生殖细胞和活的原始生殖细胞，染色步骤简单、快速，染色效果稳定，可重复性高的优点；本发明首次将尼罗红染料用于鉴定原始生殖细胞，弥补了现有鉴定方法试剂价格昂贵、操作时间长、实验结果不稳定等缺陷，适宜广泛推广应用。

附图说明

图1为鸡胚与鹅胚的血管分布显微镜图；

其中图1A为发育至55-60h的鸡胚血管分布图，图1B为发育至3.5-4d的鹅胚血管分布图，图中箭头所示为鸡胚与鹅胚的卵黄静脉。

图2为血液中分离的PGCs显微镜图；

其中，图2A为鸡胚血液中分离的PGCs，图2B为鹅胚血液中分离的PGCs，图片右上角为放大的单个原始生殖细胞。

图3为鸡胚与鹅胚的生殖腺显微镜图；

其中，图3A为鸡胚生殖腺显微镜图，图3B为鹅胚生殖腺显微镜图。

图4为生殖腺中分离的PGCs显微镜图；

其中，图4A为鸡胚生殖腺中分离的PGCs显微镜图，图4B为鹅胚生殖腺中分离的PGCs显微镜图。

图5为鸡血液PGCs的尼罗红染色结果示意图；

其中,图5A为明场下PGCs，图5B为尼罗红染色后PGCs呈绿色荧光，图5C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，图5D为图5B与图5C的叠加图。

图6为鸡生殖腺PGCs的尼罗红染色结果示意图；

其中,图6A为明场下PGCs，图6B为尼罗红染色后PGCs呈绿色荧光，图6C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，图6D为图6B与图6C的叠加图。

图7为鹅血液PGCs的尼罗红染色结果示意图；

其中,图7A为明场下PGCs，图7B为尼罗红染色后PGCs呈绿色荧光，图7C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，图7D为图7B与图7C的叠加图。

图8为鹅生殖腺PGCs的尼罗红染色结果示意图；

其中,图8A为明场下PGCs，图8B为尼罗红染色后PGCs呈绿色荧光，图8C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，图8D为图8B与图8C的叠加图。

图9为鸡生殖腺PGCs特异抗体染色结果示意图；

其中，图9A为明场下PGCs示意图，图9B为特异免疫荧光染色后PGCs呈红色荧光示意图，图9C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，图9D为B与C的叠加图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。

种蛋来源：

实施例中使用的鸡种蛋购于扬州翔龙禽业发展有限公司，品种为苏禽绿壳蛋鸡；鹅种蛋购于常州阳湖鹅业专业合作社，品种为扬州白鹅。

试剂、培养基来源：

实施例涉及的DMEM培养液、TCM199、KnockOutDMEM均购自Invitrogen公司；

Ficoll400、Hoechst33342、多聚甲醛、BSA、TritonX-100、尼罗红染料均购于Sigma公司；

兔多克隆抗体anti-DDX4（MVHantibody）、Cy3标记的山羊抗兔IgG均购于abcam公司；

合成小鼠SCF与合成人FGF购于R&D生物公司；

定性滤纸购于GE公司；

微针购于Origio公司；

24孔培养板购于Corning公司；

除非特殊说明，所涉及试剂均是由商业途径购买；

Ficoll400的配制：将0.63gFicoll400溶于10mL含有10%FCS（V/V）的TCM199中，即配成6.3%（W/V）的Ficoll400；将1.60gFicoll400溶于10mL含有10%FCS（V/V）的TCM199中，即配成16%（W/V）的Ficoll400；

KnockOutDMEM：40%BRL条件化KnockOutDMEM，7.5%FCS，2.5%鸡血清，2mMGlutaMax，1×非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，0.1mMβ-巯基乙醇，1%青链霉素，6ng/mL合成小鼠SCF，4ng/mL合成人FGF，抽滤除菌4℃保存备用；

自配Ca²⁺/Mg²⁺freePBS(1L)：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，HCl调pH值至7.2，高压灭菌，4℃保存；

尼罗红/甲醇溶液配制：将购买的尼罗红染料溶解于甲醇中，终浓度为1mg/mL，4℃避光保存；

Hoechst33342溶液：将购买的Hoechst33342溶解于三蒸水中，终浓度为10mg/mL，4℃避光保存；

4%多聚甲醛配制：4g多聚甲醛加入到100mL不含钙镁离子的PBS中，60℃加热溶解，4℃保存；

含有1%BSA的PBS液：1gBSA加入到100mL不含钙镁离子的PBS中，溶解后过滤除菌，4℃保存；

0.1%TritonX-100：将0.1mLTritonX-100加入到100mL不含钙镁离子的PBS中，过滤除菌，4℃保存；

PBS-T溶液：将0.05mLTween20加入到100mL不含钙镁离子的PBS中，过滤除菌，4℃保存；

滤纸环制作：用打孔器将定性滤纸做成内径为1.5cm、外径为2.3cm的环形滤纸片，用于鸡胚从蛋内转移到平皿中；以相同方法做内径为1.8cm、外径为2.6cm的环形滤纸片，用于鹅胚从蛋内转移到平皿中；

此外，下述实施例中涉及的试剂和培养基，若无特殊说明，均以重蒸水为溶剂，高压灭菌条件为102.9kPa蒸气灭菌30分钟。

实施例1家禽血液中获得原始生殖细胞

（1）血液中采集原始生殖细胞

将发育至55-60h的鸡种蛋与发育至3.5-4d的鹅种蛋，钝端开口，暴露胚胎，利用滤纸环将胚胎转移至不含钙镁离子PBS液中轻轻清洗，放置于平皿中，置于（放大40倍）显微镜下，如图1所示，图1A为发育至55-60h的鸡胚血管分布图，图1B为发育至3.5-4d的鹅胚血管分布图，图中箭头所示为鸡胚与鹅胚的卵黄静脉；使用微针在两侧卵黄静脉中吸取血液，最后放入盛有10%FCS的TCM199离心管中备用。

（2）Ficoll400密度梯度离心纯化原始生殖细胞

将步骤（1）收集于离心管中的血液于离心机下3000rpm，离心5min，然后弃上清，向收集的细胞沉淀中加入0.1mL不含FCS的TCM199，再加入0.9mL16%Ficoll，充分混匀后，在其上缓缓覆盖0.2mL6.3%的Ficoll，800×g离心30min；富含PGCs的部分位于6.3%与16%Ficoll界面处，利用移液器缓缓移走位于离心管表面的100μL液体后，再缓慢吸取200μL溶液，将该200μL溶液溶解于300μL的TCM199中，于1500rpm，离心5min，弃上清液，取细胞沉淀，再溶于300μL的TCM199中，如此反复重复三次，将第四次离心获得的细胞沉淀于倒置显微镜下观察计数。

显微镜（放大倍数200倍）检测结果如图2所示，其中图2A为鸡胚血液中分离的PGCs，图2B为鹅胚血液中分离的PGCs，图片右上角为放大的单个原始生殖细胞；由图2可见分离的细胞中有50-70%具有典型的原始生殖细胞特征，即呈圆形，直径约12-15μm，比红细胞大2倍左右，细胞核为圆形，分布在稍偏心位置，细胞另一侧有颜色较浅呈滴状分布的脂滴。

实施例2家禽生殖腺中获得原始生殖细胞

（1）生殖腺的分离

鸡胚发育至6-7d，鹅胚发育至8-9d，将胚胎从种蛋中取出，生殖腺位于肾上方，呈条状，仔细剥离其他组织，在不含钙镁离子的PBS中清洗三次，即获得左右两条生殖腺，如图3所示，其中图3A为鸡胚生殖腺显微镜图，图3B为鹅胚生殖腺显微镜图。

（2）生殖腺的消化

用不含钙镁离子的PBS将0.25%胰蛋白酶-EDTA稀释3倍，然后将左右生殖腺放在已经稀释好的胰蛋白酶-EDTA中，于37℃消化5min，形成单个细胞，最后加入DMEM终止消化，于1500rpm离心5分钟，弃上清，取沉淀；

（3）PGCs的获得

将离心获得的细胞沉淀中加入400μLKnockOutDMEM，于24孔培养板在培养箱中37℃、5%CO₂条件下培养3-4h，最后收集培养液1500rpm离心5min然后置于显微镜（放大倍数200倍）下检测；

检测结果如图4所示，其中，图4A为鸡胚生殖腺中分离的PGCs显微镜图，图4B为鹅胚生殖腺中分离的PGCs显微镜图；从显微镜下可以看出分离的细胞中有60-80%具有典型的原始生殖细胞特征，即呈圆形，直径约12-15μm，比红细胞大2倍左右，细胞核为圆形，分布在稍偏心位置，细胞另一侧有颜色较浅呈滴状分布的脂滴。

实施例3PGCs尼罗红染色试验

（1）将1mg/mL的尼罗红/甲醇溶液以不含钙镁的PBS稀释100倍，分别加入到实施例1和实施例2获得的PGCs细胞中，吹打形成悬浮的单个细胞，室温避光染色5-10min；

（2）溶液以1500rpm离心5分钟，取细胞沉淀加入不含钙镁的PBS清洗；

（3）将Hoechst33342溶液用不含钙镁的PBS稀释至10μg/ml，加入到PGCs中，避光染色2min；

（4）倒置荧光显微镜下观察细胞。

显微镜（放大倍数200倍）检测结果如图5-8所示，分别为鸡血液PGCs、鸡生殖腺PGCs、鹅血液PGCs与鹅生殖腺PGCs。图5-8中的A均为明场下PGCs，B均为尼罗红染色后PGCs呈绿色荧光，C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，D为B与C的叠加图。

可见，所有细胞的细胞核均呈蓝色，通过实施例1和2中采集的4种PGCs呈现统一的特点：除细胞核着蓝色外，细胞的一端还呈绿色荧光，在明场下观察可见为多个脂滴聚集，大小比一般体细胞大，呈典型的PGCs形态特点。因此确定尼罗红染色能够快速鉴定出原始生殖细胞。

实施例4家禽原始生殖细胞的免疫荧光染色

1.染色步骤参照Yamamoto等（BiologyofReproduction2007,77:115-119）公开的方法，略有改动：

（1）4%多聚甲醛固定PGCs细胞，4℃过夜；

（2）放于粘附载玻片（表面带正电荷）上，自然风干；

（3）PBS-T清洗3次，每次30min；

（4）含有1%BSA的PBS液处理6h，以阻断非特异性蛋白；

（5）0.1%TritonX-100处理10-20min；

（6）PBS-T清洗后，anti-DDX4一抗1:100稀释，4℃过夜孵育；

（7）PBS-T清洗后，二抗1:1000稀释，37℃避光孵育1h；

（8）将Hoechst33342用PBS稀释1000倍至10μg/ml，加入到PGCs中，避光染色2min；

（9）倒置荧光显微镜下观察细胞。

2.结果

本实施例对实施例1、2中获得的4种PGCs均进行了免疫荧光染色，结果具有一致性，故仅以鸡生殖腺PGCs为例，见图9。其中，图9A为明场下PGCs示意图，图9B为特异免疫荧光染色后PGCs呈红色荧光示意图，图9C为Hoechst33342染色后PGCs呈蓝色荧光，图9D为B与C的叠加图。所有细胞的细胞核均呈蓝色，而PGCs细胞除了细胞核着蓝色外，细胞膜表面还呈红色荧光。

该实施例与实施例3对比结果表明，采用免疫荧光染色法鉴定原始生殖细胞操作繁琐、抗体费用高，细胞前处理步骤多，必须对细胞进行固定操作；而尼罗红染色法操作简单、花费低廉，细胞不需要前期处理，直接可以进行活体染色。因此，尼罗红染色法鉴定家禽原始生殖细胞具有新颖性、简便性和稳定性。

一种家禽原始生殖细胞的尼罗红染色方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。