专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过降低重组毕赤酵母菌株在诱导阶段的诱导温度，解决了原重组菌株产量较低的问题，实现了重组透明质酸酶在毕赤酵母中产量的显著提高，为进一步降低水蛭透明质酸酶的生产成本和扩大应用范围奠定了一定的基础，适合于工业化生产。

权利要求

1.一种提高透明质酸酶表达量的方法，其特征在于，是在发酵产透明质酸酶的重组毕赤酵母的诱导产酶阶段，采用梯度变温诱导，分阶段调节培养温度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分阶段调节培养温度，是指分阶段降低培养温度，后一阶段的培养温度低于前一阶段的温度，最后阶段的最低温度不低于20℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分阶段调节培养温度，是在诱导开始的1-30h温度在25-30℃之间，30-60h时的温度在23-28℃之间且比1-30h时的温度低，60-108h时的温度在20-25℃之间且比30-60h温度低。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分阶段调节培养温度，是1-66h温度在23-28℃之间，66-108h温度在20-25℃之间，且66-108h时的温度低于1-66h时的温度。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母为P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his；所述重组毕赤酵母表达核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列的透明质酸酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导产酶阶段是指当OD₆₀₀为220-240时开始加入甲醇诱导。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤是：将重组毕赤酵母种子液接种至发酵培养基中，在温度28-32℃、pH5.0-6.5培养至OD₆₀₀为220-240，开始诱导培养，在诱导开始的1-60h内为调整培养温度为25-30℃，60-108h内为20-25℃，且60-108h的温度低于1-60h内的温度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养至OD₆₀₀为220-240，包括在培养至OD₆₀₀为70-80时开始甘油补料，补料结束后继续培养至OD600220-240。

9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述诱导，是添加甲醇诱导，并控制甲醇的浓度在15-20g/L。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述控制甲醇的浓度为18g/L。

说明书

技术领域

本发本发明涉及一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

温度是影响细胞生长和目的蛋白产率及稳定性的一个重要因素。温度对毕赤酵母生长的影响主要是对细胞生长速率的影响，在菌体生长阶段，生长温度通常为28～30℃，但是对于表达外源蛋白而言，温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的。Li等摇瓶实验说明，表达阶段温度降低(23℃)与细胞生长和细胞活性呈正相关。Jahic等通过分析，P.pastoris表达融合蛋白的降解，发现低温对减轻目的蛋白降解有利。而Curvers等说明低温能减少目的蛋白降解是由于减少发酵液中蛋白酶的比活引起的。Jahic等进一步说明降低诱导温度可减少细胞的死亡率，从而减少了宿主细胞蛋白酶的释放。温度还能影响AOX酶活性，降低温度可提高AOX基因转录水平3～5倍。

目前，水蛭来源的透明质酸酶基因已实现在毕赤酵母中的表达，而透明质质酸酶的表达有通过分子操作手段来实现其高效表达，其实在表达载体与表达宿主已经确定的情况下，菌株的培养条件就显得至关重要了。

本发明采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，通过改变诱导温度，实现透明质酸酶的高效表达，进一步推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。

发明内容

本发明提供一种提高透明质酸酶表达量的方法，是在发酵产透明质酸酶的重组毕赤酵母的诱导产酶阶段，采用梯度变温诱导，分阶段调节培养温度。

所述分阶段调节培养温度，是指分阶段降低培养温度，后一阶段的培养温度低于前一阶段的温度，最后阶段的最低温度不低于20℃。

所述分阶段调节培养温度，可以是1-30h温度在25-30℃之间，30-60h温度在23-28℃之间且比1-30h时的温度低，60-108h温度在20-25℃之间且比30-60h温度低。

所述分阶段调节培养温度，还可以是1-66h温度在23-28℃之间，66-108h温度在20-25℃之间，且66-108h时的温度低于1-66h时的温度。

所述分阶段调节培养温度，在本发明的一种实施方式中是1-60h为25℃，60-108h为22℃。

所述重组毕赤酵母菌株是表达透明质酸酶的重组菌。

所述透明质酸酶在本发明的一种实施方式中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述重组毕赤酵母在本发明的一种实施方式中是以GS115为出发菌株，表达SEQ ID NO.1所示基因序列的透明质酸酶，且在基因上添加了组氨酸标签和核苷酸序列SEQ ID NO.2所示的信号肽的重组P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his。

所述诱导产酶是采用毕赤酵母表达外源基因时的常规诱导表达方式进行。

所述诱导产酶在本发明的一种实施方式中是在菌株生长的对数期进行诱导。

所述发酵，在本发明的一种实施方式中是将种子液接种至发酵培养基中，在温度28-32℃、pH5.0-6.5培养至OD₆₀₀220-240，开始诱导产酶，在诱导开始的1-60h范围内为调整培养温度为23-28℃，60-108h范围内调整为20-25℃。

所述种子液的接种量为1-20％

所述发酵培养基为以下任意一种：BSM培养基、BMGY培养基、BMMY培养基。

所述发酵培养基的装液容器可以是发酵罐或者摇瓶。

所述培养基体积与装液容器的体积比为10％-60％。

所述培养至OD₆₀₀220-240，包括在OD₆₀₀为70-80时开始补料培养，补料结束后继续培养至OD₆₀₀220-240。

所述补料培养的具体方法是：向发酵液中补加甘油，补料体积(mL)如下表：

所述补料培养的甘油中，还可以添加微量金属溶液PTM1，使甘油中PTM1浓度为8-20mL/L。

所述补料培养，甘油添加方式在本发明的一种实施方式中是指数流加方式。

所述开始诱导培养，是通过添加甲醇，控制甲醇的浓度在15-20g/L。

所述控制甲醇的浓度，在本发明的一种实施方式是18g/L。

所述添加的甲醇中，还可以添加有PTM1，使甲醇中PTM1的浓度为流加含有8-12mL/L。

所述PTM1的配方(g/L)：CuSO₄ 5H₂O6、KI 0.09、MnSO₄ H₂O3、H₃BO₃ 0.02、MoNa₂O₄2H₂O0.2、CoCl₂0.5、ZnCl₂20、FeSO₄ 7H₂O65、biotin 0.2、H₂SO₄ 5.0mL。

所述甲醇的浓度在本发明的一种实施方式中是通过甲醇在线检测器控制流加。

所述方法，在本发明的一种实施方式中的具体步骤是：将种子培养液按10％的接种量接种到含有800mLBSM培养基的3L发酵罐中，种子培养温度为30℃、pH为5.5培养OD600为220，进行诱导表达，1-60h诱导温度为25℃，60-96h诱导温度为22℃，甲醇在线检测器控制流加甲醇，使甲醇浓度控制在18g/L,诱导表达96h。

本发明方法进行诱导表达透明质酸酶，其发酵液酶比活高达1320580U/ml，分别是诱导温度30℃、25℃、22℃的2.93倍、1.29倍、1.16倍。利用本发明获得透明质酸酶产量提高的方法，透明质酸酶可以直接从菌株培养条件上进一步挖掘重组菌株产透明质酸酶的潜能，在工业上具潜在的应用价值。

附图说明

图1为细胞活力在不同诱导温度下随诱导时间的变化；

图2为醇氧化酶AOX在不同诱导温度下随诱导时间的变化；

图3为菌体浓度与透明质酸酶活力在诱导温度30℃下随诱导时间的变化；

图4为菌体浓度与透明质酸酶活力在诱导温度25℃下随诱导时间的变化；

图5为菌体浓度与透明质酸酶活力在诱导温度22℃下随诱导时间的变化；

图6为菌体浓度与透明质酸酶活力在变温诱导温度下随诱导时间的变化。

具体实施方式

实施例1酵母细胞活力和菌体浓度测定方法

细胞活力表征方法：细胞活力＝(细胞总数-染色的细胞数)/(mL发酵液)/细胞总数(mL发酵液)。使用亚甲基兰染色法：将稀释好的发酵液以1:1加入0.4％亚甲基兰，染色2～3min。显微镜下，采用血球计数板对细胞进行计数。

菌体浓度：取10mL发酵液放置于50mL离心管中，放入4℃冷冻离心机中在8000r/min下离心10min，去掉上清液，用pH6.0的磷酸缓冲液重悬，重复离心一遍，再将菌体放置于105℃的烘箱内，烘干至恒重，称量并计算菌体干重(g/L)。

实施例2醇氧化酶AOX酶活力测定方法

酶活定义：每分钟产生1μmol的过氧化氢所需要的酶量。

酶活力测定方法参见文献：Suye S,Ogawa A,Yokoyama S,Obayashi A.Screening and identification of Candida methanosorbosa as alcohol oxidase producing methanol using yeast.Agric Biol Chem1990；54:1297–8.

实施例3透明质酸酶活力测定方法

酶活定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

采用3，5—二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖当量。反应体系为1mL，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/mL透明质酸(HA),分子量为2.45x10⁶Da反应体系加入800μL的HA溶液、10μL(稀释10倍)发酵上清液酶液，缓冲液补足至1mL；对照组采用pPIC9K-GS115发酵上清液。在38℃反应15min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算发酵液产生的酶活单位数。

实施例4DNS还原糖法测定酶比活力

水蛭透明质酸酶水解HA，通过降解β-1，3-糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解HA产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的产生量，来计算酶比活力。具体方法参见文献Ghose,T.Measurement of cellulase activities.Pure.Appl.Chem.59,257–268(1987)。

实施例5变温诱导策略提高透明质酸酶表达量

以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his为生产菌株，发酵条件为：将种子培养液按10％的接种量接种到含800mL BSM培养基的3L发酵罐中，温度为30℃、pH为5.5，培养至OD₆₀₀为80，开始补料培养，按指数流加方式向罐内流加含有12mL/LPTM1的甘油,补料体积(mL)如下表：

补料结束后，继续培养至OD₆₀₀至220，开始诱导培养，流加含有12mL/L PTM1的甲醇，甲醇的浓度控制在18g/L,甲醇浓度用甲醇在线检测器控制流加，诱导96h，采用本发明方案中的变温诱导策略，1-60h诱导温度为25℃，60-96h诱导温度为22℃。

BSM培养基配方：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄·H₂O 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L

PTM1配方：CuSO₄ 5H₂O,6g/L；KI,0.09g/L；MnSO₄ H₂O,3g/L；H₃BO₃,0.02g/L；MoNa₂O₄2H₂O,0.2g/L；CoCl₂,0.5g/L；ZnCl₂,20g/L；FeSO₄ 7H₂O,65g/L；biotin,0.2g/L；H₂SO₄,5.0mL/L

定时取样，测定诱导温度分别为30℃、25℃、22℃以及采用变温诱导策略的重组毕赤酵母发酵液的细胞活力、醇氧化酶AOX酶活力、菌体浓度、透明质酸酶比活力，结果如下：

(1)细胞活力：结果如附图1，采用本方案的变温诱导策略后，细胞活力一直维持在93％左右；而诱导温度为30℃时，发酵后期细胞活力下降至40％以下；在诱导温度为25℃与22℃时，细胞活力分别维持在85％左右和90％左右。

(2)醇氧化酶AOX酶活力：结果如附图2,采用本方案发明的变温诱导策略后醇氧化酶AOX酶活力在诱导后期维持在1790U/mL左右；当诱导温度为30℃时，诱导36h醇氧化酶AOX酶活力最高1351U/mL之后逐渐下降；在诱导温度25℃与22℃时，诱导60h时醇氧化酶AOX酶活力分别达到最高，而在60-96h阶段AOX酶活力有所下降。可以看出在低温下，醇氧化酶AOX酶活力提高，也就是AOX1启动子的活性加强，进而提高了下游基因(透明质酸酶)的表达。

(3)菌体浓度：结果如附图3至附图6，所示，菌体在不同诱导温度下的菌体浓度相差不大，在180g/L左右。

(4)透明质酸酶比活力：结果如附图3至附图6所示，采用变温诱导培养90h，发酵液酶比活力高达1320580U/mL，比诱导温度为30℃,25℃,22℃的酶比活453028U/mL、1026630U/mL、1145559U/mL分别提高到了2.93倍、1.29倍、1.16倍。

实施例6P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his菌株构建方法

在核苷酸序列如SEQ ID NO.1的水蛭透明质酸酶上游融合6XHis-tag标签得到透明质酸酶基因HaseA3887HF后，再将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的信号肽nsB通过融合PCR的方法添加到HaseA3887的N端，将融合后的片段连接到表达载体上pPIC9K上，转化至E.coil JM109中，得到重组表达质粒nsB-HaseA3887HF-pPIC9K/NT-his，并测序验证正确。重组表达质粒经SalI线性化后电转入表达宿主P.pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证。验证正确的克隆子即为重组毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-nsB-HaseA3887HF/NT-his。

实施例7

将重组毕赤酵母种子培养液按20％的接种量接种到含1800mL BSM培养基的3L发酵罐中，温度为32℃、pH为5，培养至OD₆₀₀为240时开始加入甲醇诱导，培养过程中保持甲醇浓度在15g/L。在开始诱导后的1-25h保持培养温度为30℃，25-60h为28℃，60-80h为26℃，80-108h为25℃。培养结束后，测定细胞活力为93％，透明质酸酶比活力为诱导温度为25℃时的1.31倍。

实施例8

将重组毕赤酵母种子培养液按2％的接种量接种到含300mLBSM培养基的3L发酵罐中，温度为28℃、pH为6.5，培养至OD₆₀₀为70，开始甘油补料培养，至OD₆₀₀为228时开始加入甲醇诱导，培养过程中保持甲醇浓度在20g/L。在开始诱导后的1-30h保持培养温度为28℃，30-66h为23℃，66-108h为20℃。培养结束后，测定细胞活力为94％，透明质酸酶比活力为诱导温度为20℃时的1.23倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一种梯度变温诱导提高透明质酸酶表达量的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。