专利摘要

本发明公开了具有神经保护作用的绞股蓝提取物式(I)、(II)、(III)化合物及其制备方法和在医药中的应用，属于植物化学领域。式(I)、(II)、(III)化合物的制备方法如下：用极性较大的有机溶剂提取绞股蓝全草，得到绞股蓝总提物；对绞股蓝总提物进行初步划段处理，得到不同部位；LCMS反复跟踪检测，对m/z977.5[M‑H]‑及m/z1107.6[M‑H]‑成分较集中的部位，用柱色谱进一步富集；对富集部位进行纯化，得到m/z977.5[M‑H]‑的化合物I和II，m/z1107.6[M‑H]‑的化合物III。药效学试验表明，式(I)、(II)、(III)化合物有较明显的神经保护作用。

权利要求

1.式(I)、(II)所示的化合物：

。

2.权利要求1所述的化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的神经退行性疾病源于氧化应激。

说明书

技术领域

本发明涉及皂苷类化合物，尤其涉及从植物绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)中提取、分离得到的达玛烷型皂苷类化合物；本发明还涉及该皂苷类化合物的制备方法以及该化合物在医药中的应用，属于植物化学领域。

背景技术

神经退行性疾病，如阿兹海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病等，是一类由脑中特定区域神经元发生退变而引起的慢性进行性神经系统疾病，是全球老年人中发病率较高的疾病之一，严重危害人类健康。氧化应激参与神经退行性疾病的发生和发展，被认为是导致神经退行性疾病的主要原因之一。SY-SY5Y细胞一种分化程度较低的肿瘤细胞，显示中等水平的多巴胺-β-羟基酶活性，细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似；过氧化氢(H2O2)作为体内氧化代谢的中间产物，能穿透细胞膜，对多种细胞(特别是脑组织神经元细胞)造成毒性，引起细胞死亡。H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤模型是经典的氧化应激导致的神经损伤模型，用于神经保护方面的研究。

有证据表明，天然产物中存在着大量的抗氧化成分，如维生素、矿物质和酚类化合物，能有效清除自由基，预防神经退化。绞股蓝为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的全草，在山谷密林、丘陵、山坡和石山地区均有分布，很容易实现机械化大规模种植，资源极其丰富，有“优于人参的功效，劣于茶叶的价格”一说。皂苷类成分是绞股蓝中主要的药效成分，药理研究表明，绞股蓝皂苷具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化的活性。因此，从绞股蓝中开发出具有神经保护作用的皂苷类成分，对预防神经退行性疾病的发生具有潜在的意义。

发明内容

本发明人从绞股蓝干燥全草中分离得到具有结构式(I)、(II)、(III)的新化合物，并对其神经保护作用进行了探究，从而完成了本发明。

本发明目的之一是提供下述式(I)、(II)、(III)的化合物：

本发明的另外一个目的是提供制备上述式(I)、(II)、(III)化合物的方法。

一种制备上述式(I)、(II)、(III)化合物的方法，包括：

(1)用极性较大的有机溶剂提取绞股蓝全草，得到绞股蓝总提物；

(2)对绞股蓝总提物进行初步划段处理，得到不同部位；

(3)LCMS反复跟踪检测，对m/z 977.5[M-H]-及m/z 1107.6[M-H]-成分较集中的部位用柱色谱进一步富集；

(4)对富集部位进行纯化得到m/z 977.5[M-H]-的化合物I和II，m/z 1107.6[M-H]-的化合物III。

上述制备方法中，步骤(1)中极性较大的有机溶剂，优选甲醇溶液或乙醇溶液；

步骤(2)中对绞股蓝进行初步划段，优选的划段方法为大孔树脂或硅胶柱色谱或中压快速制备柱色谱；其相应的流动洗脱液依次为0-100％甲醇或乙醇，不同配比的二氯甲烷/甲醇，20-100％甲醇。

步骤(4)中进一步纯化的方法，优选HPLC系统C18柱，流动相为色谱乙腈-水。

本发明式(I)、(II)、(III)化合物具有神经保护作用，具体来说其对H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有较强的保护作用。

附图说明

图1绞股蓝皂苷J1的MS(A)及MS/MS(B)图谱

图2绞股蓝皂苷J2的MS(C)及MS/MS(D)图谱

图3绞股蓝皂苷J3的MS(E)及MS/MS(F)图谱

图4绞股蓝皂苷J1-J3的神经保护作用条形图，各处理组vs空白对照组：“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01；各处理组vs模型组：“#”表示p＜0.05，“##”表示p＜0.01；各实验组vs阳性对照组：“&”表示p＜0.05，“&&”表示p＜0.01。

具体实施方式

实施例1 化合物(I)、(II)、(III)的制备过程如下：

(1)按投料比1∶8(w/v)将绞股蓝干燥全草用80％甲醇浸泡30min后，进行超声提取，30min/次，超声3次；合并超声提取液减压浓缩得到绞股蓝甲醇提取物浸膏。

(2)绞股蓝甲醇提取物浸膏用适量水混悬，用大孔树脂HP20充分吸附后，依次用0％，20％，50％，70％，95％乙醇溶液进行洗脱，得到不同的洗脱部位。

(3)LCMS对不同洗脱部位进行检测，m/z 977.5[M-H]-及m/z 1107.6[M-H]-成分在70％乙醇洗脱部位较集中，将70％乙醇洗脱物浓缩后按1∶1拌样后上硅胶柱色谱，用10∶1～1∶1体积比的二氯甲烷/甲醇洗脱，分段收集洗脱液得到10个组分GPF70A-J。LCMS跟踪检测，m/z 977.5[M-H]-及m/z 1107.6[M-H]-集中分布GPF70H部位，用Biotage快速分离制备色谱仪经340g的C18柱进行分离，流速为50ml/min，40-95％甲醇梯度洗脱12CV，收集56-57％甲醇洗脱液减压浓缩得GPF70H56-57部位。

(4)将GPF70H56-57部位用岛津LC-20AT半制备HPLC系统，BDS HYPERSIL C18柱(250mm×10mm，5μm)，27％乙腈-水为流动相进行二元等度浓度洗脱，流速为3ml/min，收集m/z 977.5[M-H]-及m/z 1107.6[M-H]-所在峰的尖端部分，得到白色粉末状固体化合物(I)、(II)和(III)[分别命名为绞股蓝皂苷J1(gypenoside J1)、绞股蓝皂苷J2(gypenosideJ2)、绞股蓝皂苷J3(gypenoside J3)]。绞股蓝皂苷J1-J3的结构鉴定数据见下表1。

表1绞股蓝皂苷J1-J3的核磁共振数据

试验例1 本发明化合物绞股蓝皂苷J1-J3的神经保护作用实验

1)实验材料

细胞：人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞；阳性对照化合物：维生素C；

2)实验方法

将对数生长期的SH-SY5Y细胞，按5×103/孔的密度接种于96孔板，37℃，5％CO2湿度饱和的条件下孵育生长24h，剔除原有培养基；加入800μmol/L H2O2刺激SH-SY5Y细胞4h，加入浓度梯度(5，10，20，40μmol/L)的绞股蓝皂苷J1-J3和维生素C，继续孵育36h后，MTT或CCK8法检测吸光值OD，计算细胞存活率。

3)供试化合物：实施例1所制备的化合物(绞股蓝皂苷J1-J3)。

4)实验结果 见附图4

结果表明，化合物(I)、(II)、(III)具有明显的神经保护作用。

具有神经保护作用的化合物、其制备方法及应用专利购买费用说明

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