专利摘要

本发明提供一种制备博宁霉素(Z－893)的方法，采用化学半合成的方法将博安霉素乙酰化，使博安霉素转变为博宁霉素，收率达到65～80％，具有良好的工业化生产前景。

权利要求

1、一种化学半合成制备博宁霉素的方法，其包括步骤：将博安霉素与酸酐进行乙酰化反应。

2、根据权利要求1所述的博宁霉素的制备方法，其包括步骤：将博安霉素溶于甲醇中，然后向所获得的溶液中每毫升加入13～17μl的吡啶及10～13μl的醋酸酐，室温下反应0.5～2h，反应液中加入丙酮，反应液与丙酮的体积比是1∶3～6，过滤沉淀。

3、根据权利要求1或2所述的博宁霉素的制备方法，其特征在于，所述的博安霉素为含铜的博安霉素。

4、根据权利要求1-3任意一项所述的博宁霉素的制备方法，其特征在于，所述博安霉素乙酰化反应后还经进一步处理：过滤后经凝胶柱层析，并用0.1～0.8N NH₄Cl水溶液进行梯度洗脱，按洗脱峰值为0.3～0.4mol/L收取，然后再经大孔吸附树脂柱吸附，并用含5％NaCl和5％EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜；再用5％NaCl水溶液洗脱，去除EDTA，水洗除盐后，用含有5～30％丙酮0.01N HCl的水溶液洗脱，收集活性流分，浓缩、冷冻干燥得盐酸博宁霉素。

5、根据权利要求1-4任意一项所述的博宁霉素的制备方法，其特征在于，所述的博安霉素由如下方法制备：先将轮枝链霉菌平阳变种菌种(Streptomyces verticillus Var.Pingyangensis n.var)进行发酵培养得培养液，然后对培养液进行提取而成。

6、根据权利要求5所述的博宁霉素的制备方法，其特征在于，所述的菌种为轮枝链霉菌平阳变种Q835(Streptomyces verticillus varPingyangesis n.sp Q835)。

7、根据权利要求5或6所述的博宁霉素的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基中含有如下重量比的组分：葡萄糖0.2～0.8％，淀粉0.5～5.0％，豆饼粉0.5～6.0％，玉米粉0.5～5.0％，玉米浆0.1～2.0％，氯化钠0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.01～0.03％，硫酸锌0.01～0.08％，硫酸铜0.001～0.020％，玉米油0.1～0.5％，其余为水，pH6.0～6.5。

说明书

技术领域

本发明涉及一种博宁霉素的制备方法，属于抗生素的化学半合成领域。

背景技术

博菜霉素族抗生素的分子结构：

博莱霉素A2  R＝-NH(CH₂)S(CH₃)

博莱霉素B2

平阳霉素    -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-NH₂

博安霉素    -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NH₂

博宁霉素    -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NHCOCH₃

其中，博宁霉素(Boningmycin)(专利号为98101253.1，发明名称为一种抗肿瘤抗生素和其微生物发酵生产法)。博宁霉素不但具有抗肿瘤作用，而且对银屑病、脂溢性皮炎和乳头瘤病毒所致的疾病如尖锐湿疣、扁平疣等有良好的作用，毒性低，外用无刺激性，具有良好的应用前景。但其通过发酵培养所产生的活性产物中博宁霉素仅占约5％以下，甚至只有痕迹量。

因此，为了适应工业化生产，并能有效降低成本，本发明的技术人员通过继续研究，发现了一种高产率的博宁霉素生产方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备博宁霉素的方法，该方法采用化学半合成的方法将博安霉素乙酰化处理，使产生的博宁霉素收率达到65～80％。

为了实现本发明目的，本发明所述的博宁霉素(Z-893)的制备方法是采用博安霉素与酸酐进行乙酰化反应生成。

其中，博安霉素乙酰化处理为：将博安霉素溶于甲醇中，然后向所获得的溶液中每毫升加入13～17μl的吡啶及10～13μl的醋酸酐，室温下反应0.5～2h，反应液中加入丙酮，反应液与丙酮的体积比是1∶3～6，过滤沉淀。

所述的博安霉素为含铜的博安霉素。该含铜的博安霉素可以是去铜的博安霉素先转变为含铜的博安霉素再进行乙酰化，也可以直接用博安霉素含铜品。

博安霉素加铜处理可采用：先将博安霉素溶于水中，加入Cu²⁺使充分螯合铜，经大孔吸附树脂柱脱去过量铜，浓缩洗脱液冷冻干燥，得到含铜干燥品。

博安霉素乙酰化反应后得到博宁霉素(Z-893)，还需进一步处理：先将过滤物溶于水中，经凝胶柱层析，并用0.1～0.8N NH₄Cl水溶液进行梯度洗脱，按洗脱峰值为0.3～0.4mol/L收取，然后再经大孔吸附树脂柱吸附，并用含5％NaCl和5％EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜；再用5％NaCl水溶液洗脱，去除EDTA，水洗除盐后，用5～30％的丙酮(含0.01N HCl)溶液洗脱；收集活性流分，经浓缩、冷冻干燥而得博宁霉素冻干品。收率达65～80％。

经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定，分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。

本发明所用的博安霉素可采用发酵方法制成，也可采用现有的其他方法获得。

其中优选的是，博安霉素由如下方法制备：先将轮枝链霉菌平阳变种菌种(Streptomyces verticillus Var.Pingyangensis n.var)进行发酵培养得培养液，然后对培养液进行提取而成。

菌种优选为轮枝链霉菌平阳变种Q835(Streptomyces verticillusvar Pingyangesis n.sp Q835)。

发酵培养基组成按重量比计为：葡萄糖0.2～0.8％，淀粉0.5～5.0％，豆饼粉0.5～6.0％，玉米粉0.5～5.0％，玉米浆0.1～2.0％，氯化钠0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.01～0.03％，硫酸锌0.01～0.08％，硫酸铜0.001～0.020％，玉米油0.1～0.5％，其余为水，pH6.0～6.5。

本发明博宁霉素的制备方法，采用化学半合成的方法将博安霉素乙酰化，使博安霉素转变为博宁霉素，收率达到65～80％，具有良好的工业化生产前景。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

对含铜的博安霉素进行化学半合成处理：称取博安霉素含铜品200mg，溶于10ml甲醇中，加入156μl吡啶，再加入116μl乙酸酐，室温下反应1h，以1N HCl酸化至pH4.0，反应液加入4倍量丙酮，产生蓝色沉淀，过滤后的蓝色固体溶于少量水，上50mlCM-Sephadex-C-25凝胶柱，用0.1～0.8N NH₄Cl水溶液进行梯度洗脱，按峰收取博宁霉素的蓝色色带，上50ml X-5大孔吸附树脂柱，用含5％NaCl和5％EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜，再用5％NaCl水溶液洗脱，去除EDTA。水洗除盐后，用有20％的丙酮(含0.01N HCl)溶液洗脱。收集活性流分，旋转薄膜蒸发浓缩，冷冻干燥，收率达73.6％。

经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定，分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。

实施例2

对博安霉素进行化学半合成处理：称取博安霉素脱铜品191mg，溶于10ml水中，加20mg硫酸铜，上大孔吸附树脂柱去掉多余的Cu²⁺，浓缩洗脱液冷冻干燥，得到含铜干燥品，然后溶于10ml甲醇中，加入160μl吡啶，再加入120μl乙酸酐，室温下反应1h，反应液加入4倍量丙酮，产生蓝色沉淀，过滤后的蓝色固体溶于少量水，上50mlCM-Sephadex-C-25凝胶柱，用0.1～0.8N NH₄Cl水溶液进行梯度洗脱，按峰收取博宁霉素的蓝色色带，上50ml X-5大孔吸附树脂柱，用含5％NaCl和5％EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜。再用5％NaCl水溶液洗脱，去除EDTA。水洗除盐后，用30％的丙酮(含0.01N HCl)溶液洗脱。收集活性流分，旋转薄膜蒸发浓缩，冷冻干燥，收率达76.2％。

经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定，分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。

实施例3

对含铜的博安霉素进行化学半合成处理：称取博安霉素含铜品200mg，溶于10ml甲醇中，加入160μl吡啶，再加入130μl乙酸酐，室温下反应2h，反应液加入5倍量丙酮，产生蓝色沉淀，过滤后的蓝色固体溶于少量水，上50ml CM-Sephadex-C-25凝胶柱，用0.1～0.8N NH₄Cl水溶液进行梯度洗脱，按峰收取博宁霉素的蓝色色带，上50ml X-5大孔吸附树脂柱，用含5％NaCl和5％EDTA二钠盐的水溶液洗脱，去除产物鳌合的铜。再用5％NaCl水溶液洗脱，去除EDTA。水洗除盐后，用有30％的丙酮(含0.01N HCl)溶液洗脱。收集活性流分，旋转薄膜蒸发浓缩，冷冻干燥，收率达75.1％。

经HPLC检测，产物峰保留时间与博宁霉素相同，FAB-MS测定，分子离子峰为1601.6与博宁霉素相同，表明该产物即为博宁霉素。

实施例4

博安霉素的制备：所用的产生博安霉素的菌种为轮枝链霉菌平阳变种Q835(Streptomyces verticillus var Pingyangesis n.sp Q835)，其斜面培养基组成为：葡萄糖1.0％，蛋白胨0.5％，淀粉1.0％，氯化钠0.5％和琼脂2.0％，其余为水。调pH7.2，于120℃灭菌30分钟，将菌种接种于此斜面培养基上，在28℃培养8天，将生长良好的菌种斜面接种于经过120℃灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的组成为：葡萄糖0.5％，淀粉2.5％，豆饼粉3.2％，玉米粉2.0％，玉米浆0.5％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.015％，硫酸锌0.05％，硫酸铜0.01％，玉米油0.3％，其余为水，自然pH，接种后在28℃旋转培养48小时后，做为种子，用于发酵。发酵培养基与种子培养基相同，调pH6.0后，同样于120℃灭菌30分钟，将培养好的种子转种于此发酵培养基中，29℃培养8天后收获培养液。

将培养液用草酸调pH至3.0，再用氢氧化钠调pH至6.5过滤，滤液通过离子交换树脂D151(H⁺型)，无盐水洗后，以0.3N盐酸洗脱，收集活性部分调pH至6.5，再经大孔吸附树脂4006脱盐，以10％丙酮(含0.01N HCl)溶液洗脱，收集活性部分，减压浓缩至小体积，浓缩液用氨水调pH至6.5，进行CM-Sephadex C-25(NH₄⁺型)柱层析，无盐水洗柱后，以0.1～1N氯化铵梯度洗脱，按峰位收集博安霉素，冷冻干燥，可得到蓝色的博安霉素含铜品。

实施例5

基本同实施例4，不同的是发酵培养基的组成为：葡萄糖0.2％，淀粉5.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉5.0％，玉米浆2.0％，氯化钠0.1％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸锌0.01％，硫酸铜0.02％，玉米油0.1％，其余为水，pH6.3。

实施例6

基本同实施例4，不同的是发酵培养基的组成为：葡萄糖0.8％，淀粉0.5％，豆饼粉6.0％，玉米粉0.5％，玉米浆0.1％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.01％，硫酸锌0.08％，硫酸铜0.001％，玉米油0.5％，其余为水，调pH6.5。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

一种化学半合成制备博宁霉素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。