专利摘要

本发明提供了一种球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用，属于微菌核制剂制备技术领域，所述球孢白僵菌微菌核制剂的制备包括以下步骤：1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；2)取制备得到的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；3)取制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；4)将获得的干制微菌核与助剂混合后得到微菌核制剂。该方法生产的球孢白僵菌微菌核制剂生产成本低、产品耐受性强，且该制剂复水后能够迅速萌发长出菌丝并产生分生孢子侵染害虫，具有良好杀虫活性。

权利要求

1.一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，包括以下步骤：

1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；

2)取步骤1)中的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；

步骤1)中所述吐温20水溶液中吐温20的体积百分含量为0.03％～0.1％；

步骤2)中所述的液体诱导培养基以水为溶剂，每升由以下组分组成：

KH2PO42～6g、MgSO4·7H2O 0.3～0.9g、NaNO30.4～1.2g、CuSO40.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g和吐温20 2.5mL，pH 6.0～7.5；

所述球孢白僵菌菌株为CQBb119，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为：CGMCC NO:15987；

步骤1)中所述孢子悬浮液的孢子含量为2.8×106～3.2×106个孢子/mL；

步骤2)中所述接种的孢子悬液与液体诱导培养基的体积比为1:(10～20)；

步骤2)中所述诱导培养的温度为23～31℃；所述诱导培养的时间为5～6d；所述诱导培养的振荡或搅拌频率50～250rpm。

2.一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，包括以下步骤：

A)取权利要求1所述方法制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；

B)将步骤A)中的干制微菌核与助剂混合后得到微菌核制剂。

3.根据权利要求2所述的球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，其特征在于，所述球孢白僵菌微菌核制剂的剂型为颗粒剂。

4.根据权利要求2所述的球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，其特征在于，步骤A)中所述填料为硅藻土、淀粉和环糊精中的一种或几种；所述微菌核与填料的体积比为1：(2～4)。

5.根据权利要求2所述的球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，其特征在于，步骤B)中所述助剂为蔗糖酯；所述干制微菌核与蔗糖酯的质量比为1000:1～200:1。

6.权利要求2～5任意一项的制备方法制备得到的球孢白僵菌微菌核制剂在防治多种害虫中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及微菌核制剂制备技术领域，尤其涉及一种球孢白僵菌微菌核的制备方法及应用。

背景技术

随着我国生态文明建设的推进，减少化学农药的使用已成必然趋势，环境友好的生物防治技术更受人青睐。球孢白僵菌是一种广谱型病原真菌，对多种鳞翅目、鞘翅目、半翅目害虫均有良好杀虫活性，被广泛应用于国内外多种害虫如小地老虎、松毛虫等的生物防治。

目前实际应用的球孢白僵菌制剂含有的有效成分通常是球孢白僵菌分生孢子，而分生孢子是利用液固两相发酵获得，该方式的弊端是发酵周期长，生产效率低，生产成本高，且产品对不良环境的耐受力有限，货架期短，因此在实际生产和应用中受到很大的限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用，该方法生产的球孢白僵菌微菌核制剂生产成本低、产品耐受性强，并且该制剂复水后能够迅速萌发长出菌丝并产生孢子侵染害虫，具有良好杀虫活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，包括以下步骤：

1)将球孢白僵菌的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；

2)取步骤1)中的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；

步骤1)中所述吐温20水溶液中吐温20的体积百分含量为0.03％～0.1％；

步骤2)中所述的液体诱导培养基以水为溶剂，每升包括以下组分：KH2PO4 2～6g、MgSO4·7H2O 0.3～0.9g、NaNO3 0.4～1.2g、CuSO4 0.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g和吐温20 2.5mL～7.5mL，pH 6.0～7.5。

优选的，所述球孢白僵菌菌株为CQBb119，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号为：CGMCC NO:15987。

优选的，步骤1)中所述孢子悬浮液的孢子含量为2.8×106～3.2×106个孢子/mL。

优选的，步骤2)中所述接种的孢子悬液与液体诱导培养基的体积比为1:(10～20)。

优选的，步骤2)中所述诱导培养的温度为23～31℃；所述诱导培养的时间为5～6d；所述诱导培养的振荡或搅拌频率50～250rpm。

本发明提供了一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，包括以下步骤：

A)取权利要求1～5任意一项所述方法制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；

B)将步骤A)中的干制微菌核与助剂混合后得到微菌核制剂。

优选的，所述球孢白僵菌微菌核制剂的剂型为颗粒剂。

优选的，步骤A)中所述填料为硅藻土、淀粉和环糊精中的一种或几种；所述液体微菌核与填料的体积比为1：(2～4)。

优选的，步骤B)中所述助剂为蔗糖酯；所述干制微菌核与蔗糖酯的质量比为1000:1～200:1。

本发明提供了上述方案制备得到的球孢白僵菌微菌核制剂在防治多种害虫中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明采用生物保藏编号为CGMCC NO:15987的球孢白僵菌，其本身具有杀虫活性高，杀虫谱广的优良特性，尤其对于普通杀虫剂难于防治的刺吸式口器的同翅目昆虫、鳞翅目的小地老虎及双翅目害虫幼虫具有很强的杀虫活性。并且本申请首次使用液体发酵大量诱导产生球孢白僵菌微菌核。

2、利用本申请的方法制备的球孢白僵菌微菌核制剂能适应35～40℃的温度及强紫外线等外界不良环境，产品抗逆性好，货架期为1～2年。

3、本发明生产的球孢白僵菌微菌核制剂复水后能够迅速萌发长出菌丝并产生孢子侵染害虫，具有良好杀虫活性，LT50(半致死时间：接种后50％害虫死亡所经历的时间)为5.3d～7.2d，可以替代分生孢子作为杀虫真菌的有效成分。

4、本发明的发酵工艺简单，原料常规，所用培养液和发酵工艺可操作性强，重复性好，可以实现全自动化生产；并且本发明的发酵周期短，仅需5～6d，而传统的液固两相发酵则需要耗时20～25d。

5、本发明的生产成本较分生孢子发酵生产成本降低1/2以上，而且生产过程无废料产生。

生物保藏说明

球孢白僵菌(Beauveria bassiana(Bals.)Vuill)，于2018年6月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为：CGMCC NO:15987。

具体实施方式

本发明提供了一种球孢白僵菌微菌核的制备方法，所述球孢白僵菌菌株为CQBb119，保藏编号为：CGMCC NO:15987。

在本发明中，将球孢白僵菌菌种接种于PDA固体培养基中进行菌种培养，收集获得分生孢子；所述PDA平板的直径优选为90mm；所述菌种培养时间优选为10～12d；所述菌种培养温度优选为23～25℃；所述收集方法优选为待菌丝长满平板并产孢后刮取平板表面的分生孢子。

在本发明中，将收集到的分生孢子与吐温20水溶液混合得到孢子悬液；所述吐温20水溶液中吐温20的含量为0.03％～0.1％，优选为0.05％；所述吐温20水溶液中的水为无菌水；所述孢子悬液的终浓度为2.8×106～3.2×106个孢子/mL，优选为3.0×106个孢子/mL；所述混合过程在无菌环境中进行。

在本发明中，将获得的孢子悬液接种至液体诱导培养基中进行诱导培养获得微菌核；所述液体诱导培养基包括以下组份：以1L计，KH2PO4 2～6g、MgSO4·7H2O 0.3～0.9g、NaNO3 0.4～1.2g、CuSO4 0.2～0.6g；酵母粉1.5～4.5g、蛋白胨1～3g、蔗糖10～30g、吐温200.25～0.75mL和1000mL水，pH 6.0～7.5；优选的，以1L计，KH2PO4 3～5g、MgSO4·7H2O 0.5～0.7g、NaNO3 0.8～1.0g、CuSO4 0.3～0.5g；酵母粉2.5～3.5g、蛋白胨1.5～2.5g、蔗糖15～25g、吐温20 0.35～0.65mL和1000mL水，pH 6.5～7.2；更优选的以1L计，KH2PO4 4g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaNO3 0.9g、CuSO4 0.4g；酵母粉3g、蛋白胨2g、蔗糖20g、吐温20 0.5mL和1000mL水，pH 7.0。在本发明中，所述接种的孢子悬液与液体诱导培养基的体积比为1:(10～20)，优选为1：(12～18)，更优选为1：15；所述接种后的孢子终含量优选为≧1.25×105个孢子/L。本发明中，所述诱导培养的温度为23～31℃，优选为25～29℃，更优选为28℃；所述诱导培养的时间为5～6d，优选为5.5d；所述诱导培养的振荡频率为50～250rpm，在本发明具体实施过程中，优选的在接种后24h内振荡频率优选为50～100rpm，更优选为100rpm；接种后24h之后振荡频率优选为110～200rpm，更优选为180rpm。

本发明提供了一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法，所述球孢白僵菌微菌核由上述方案制备获得。

在本发明中，取上述方案中制备得到的微菌核与填料混合后进行干燥处理，得到干制微菌核；本发明中，所述填料为硅藻土、淀粉和环糊精中的一种或几种；所述微菌核与填料的质量比为1：(2～4)，优选为1:3；所述干燥处理的方式优选为干热风干燥；所述干燥处理的温度优选为30～40℃，更优选为32℃；所述干燥处理的时间优选为24～48h，更优选为36h。本发明中，所述干制微菌核的含水量优选的≦8％。

在本发明中，将制备得到的干制微菌核与助剂混合后得到微菌核制剂；所述助剂为蔗糖酯；所述干制微菌核与蔗糖酯的质量比为1000:1～200:1，优选为800:1～400:1，更优选为600:1；所述混合的方式优选为搅拌混合；所述搅拌的转速为15～25rpm，优选为20rpm；所述搅拌的时间优选为20～40min，更优选为30min。本发明中，所述球孢白僵菌微菌核制剂的剂型为颗粒剂。

本发明提供了上述方案制备得到的球孢白僵菌微菌核制剂在防治多种害虫中的应用。球孢白僵菌是一种广谱型病原真菌，对多种鳞翅目、鞘翅目、半翅目害虫均有良好杀虫活性，被广泛应用于国内外的多种害虫，如小地老虎、松毛虫等的生物防治。在本申请中，所述防治的害虫优选为蛴螬、吉丁虫、地老虎、双翅目幼虫。

在本发明中，所述球孢白僵菌微菌核制剂的施用方法为土壤撒施、拌种或兑水灌根施用，优选为兑水灌根施用，所述球孢白僵菌微菌核制剂与水的混合比例优选为1：(200～1000)，更优选为1:500。在本发明的具体实施过程中，所述球孢白僵菌微菌核制剂与水的混合比例根据害虫发生量及虫龄而定。

下面结合实施例对本发明提供的一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1一种球孢白僵菌微菌核的制备方法

1)将菌种保藏编号为：CGMCC NO 15987的球孢白僵菌菌种接种于直径为90mm PDA培养基平板上，在培养温度为23℃的条件下培养12天，待菌丝长满平板并产孢后刮取平板表面的分生孢子作为初始接种体。

2)将收集得到的初始接种体加入到体积百分含量为0.03％的吐温20的无菌水中，无菌操作、分散混匀，配制成孢子含量为3.0×106个孢子/mL的孢子悬浮液备用。

3)将制备的孢子悬浮液按1:20的体积比接入到液体诱导培养基中，使孢子终浓度达到1.5×105个孢子/mL，放置于恒温摇床中培养。培养温度为23℃的条件下，培养6d，并且，接种后24h内摇床转速为50rpm，接种24h之后摇床转速调整为150rpm，经上述培养即可获得球孢白僵菌微菌核。

其中，液体诱导培养基由下列成分组成：以1L计，基础盐：KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O0.3g、NaNO3 0.4g，微量元素：CuSO4 0.2g，氮源：酵母粉1.5g、蛋白胨1g；碳源：蔗糖10g，吐温20 0.25mL和1000mL水，pH 6.0。

实施例2一种球孢白僵菌微菌核的制备方法

1)将菌种保藏编号为：CGMCC NO 15987的球孢白僵菌菌种接种于直径为90mm PDA固体培养基平板上，在培养温度为27℃的条件下培养10天，待菌丝长满平板并产孢后刮取平板表面的分生孢子作为初始接种体。

2)将收集得到的初始接种体加入到含体积百分含量为0.1％的吐温20的无菌水中，无菌操作、分散混匀，配制成终浓度为3.0×106个孢子/mL的孢子悬浮液备用。

3)将制备的孢子悬浮液按1:20的体积比接入到液体诱导培养基中，使孢子终浓度达到1.5×105个孢子/mL，放置于恒温摇床中培养。培养温度为31℃的条件下，培养5.5d，并且，接种后24h内摇床转速为100rpm，接种后24h之后摇床转速为调整为200rpm，经上述培养即可获得液体球孢白僵菌微菌核。

其中，液体诱导培养基由下列成分组成：以1L计，基础盐：KH2PO4 6g、MgSO4·7H2O0.9g、NaNO3 1.2g，微量元素：CuSO4 0.6g，氮源：酵母粉4.5g、蛋白胨3g；碳源：蔗糖30g，吐温20 0.75mL和1000mL水，pH 7.0。

实施例3一种球孢白僵菌微菌核的制备方法

1)将菌种保藏编号为：CGMCC NO 15987的球孢白僵菌菌种接种于直径为90mm PDA固体培养基平板上，在培养温度为25℃的条件下培养11天，待菌丝长满平板并产孢后刮取平板表面的分生孢子作为初始接种体。

2)将收集得到的初始接种体加入到体积百分含量为0.05％的吐温20的无菌水中，无菌操作、分散混匀，配制成终浓度为3.0×106个孢子/mL的孢子悬浮液备用。

3)将制备的孢子悬浮液按1:15的体积比接入到液体诱导培养基中，使孢子终浓度达到2.0×105个孢子/mL，放置于恒温摇床中培养。培养温度为28℃的条件下，培养5.5d，并且，接种后24h内摇床转速为50rpm，接种后24h之后摇床转速为调整为140rpm，经上述培养即可获得球孢白僵菌微菌核。

其中，液体诱导培养基由下列成分组成：以1L计，基础盐：KH2PO4 6g、MgSO4·7H2O0.9g、NaNO3 1.2g，微量元素：CuSO4 0.6g，氮源：酵母粉4.5g、蛋白胨3g；碳源：蔗糖30g，吐温20 0.75mL和1000mL水，pH 7.2。

实施例4一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法

1)将实施例3中的球孢白僵菌微菌核发酵液放入50L塑料桶，加入球孢白僵菌微菌核3倍质量比的玉米淀粉，搅拌混匀，加入流化床，在32℃条件下热风干燥至含水量≦8％，获得干制微菌核。

2)将干制微菌核按1000:1的质量比加入蔗糖酯，搅拌30min混匀后制备微菌核颗粒剂。

实施例5一种球孢白僵菌微菌核制剂的制备方法

1)将实施例3中的球孢白僵菌微菌核发酵液放入50L塑料桶，加入球孢白僵菌微菌核4倍质量的硅藻土，搅拌混匀，加入流化床，在35℃条件下热风干燥至含水量≦8％，获得干制微菌核。

2)将干制微菌核按800:1的质量比加入蔗糖酯，搅拌30min混匀后制备微菌核颗粒剂。

实施例6实施例5中获得的球孢白僵菌微菌核制剂的耐贮存测定

将实施例5所获得的微菌核制剂干燥存放于室温(≦30℃)条件下，每个月取0.05g制剂接种于水琼脂平板上，检测微菌核萌发率，结果可以看出，菌剂干燥后复水萌发率≥99％，室温条件下存放12个月后微菌核复水萌发率≥95％。

表1球孢白僵菌微菌核制剂贮存后萌发率

实施例7实施例5中获得的球孢白僵菌微菌核制剂耐高温试验

将0.02g实施例5中所获得的干燥球孢白僵菌微菌核置于塑料离心管内，以35℃、40℃、45℃、50℃高温分别处理0min、10min、20min、30min后，取出分别接种于水琼脂平板培养基中，25℃培养24h后，在光学显微镜下测定微菌核萌发率。同时以1×107个孢子/mL球孢白僵菌新鲜分生孢子悬浮液做同样处理作为对照，所有处理均设置3次重复。

从表2中可以看出，高于40℃处理，同样温度和处理时间，球孢白僵菌微菌核萌发率显著高于分生孢子萌发率。

表2.微菌核和分生孢子热处理后萌发率比较

表中数据均为3次重复平均数，一列数据后的不同字母表示具有显著差异(P<0.05)。

实施例8实施例5中所获得的干燥球孢白僵菌微菌核耐紫外线试验

将0.02g实施例5中所获得的干燥球孢白僵菌微菌核均匀涂撒在9cm直径水琼脂平板上，放于60cm见方的照射室，以一个40W的紫外灯泡照射处理(UV-B波长308)，紫外辐射量以紫外分光照度仪测量。经0、1、2、3、4小时照射，各处理紫外线接收量分别为0,4.86,9.72,14.58和19.44kJ m-2。微菌核从照射室中取出，置于25℃培养箱中培育24h，在光学显微镜下检查测定微菌核萌发率。同时以1×107球孢白僵菌新鲜分生孢子悬浮液做同样处理作为对照。所有处理均设置3次重复。结果如下表，从表中可以看出，同样紫外剂量照射下，球孢白僵局微菌核萌发率显著高于分生孢子萌发率。

表3微菌核紫外线耐受试验结果

表中数据均为3次重复平均数，同一行中萌发率后相同的字母表示萌发率差异不显著，不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。

实施例9实施例5中获得的球孢白僵菌微菌核制剂防治葱蝇试验

将葱蝇(Delia antiqua)成虫放入30×30×30cm纱笼内，饲以无菌水、白砂糖及酵母粉，置于23±1.0℃，LD16:8，50～70％相对湿度的光温自动控制培养箱内。将放有潮湿的石子和几片洋葱的8cm×5cm直径的塑料碟同时放入纱笼供成虫补充营养及产卵。产下的卵在同样条件的培养箱中孵化为幼虫，饲以切片的洋葱头备用。

将市场上买回的小个洋葱头种植在直径40cm的塑料花盆中，每盆种植3个，待洋葱叶子长出10cm高以上时，接种孵化后3日龄的葱蝇幼虫20头。接虫后的花盆置放于光照培养箱中常规培养(23±1.0℃，LD16:8，50～70％相对湿度)3天后，将步骤5所得微菌核制剂按1:20比例加水混匀成为接种体，以每盆100mL的液量灌根；对照仅以清水灌根。分别于5天、10天时检查土壤中葱蝇幼虫存活数，按照公式：校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％计算校正死亡率。所有处理均设置10次重复。实验结果显示，5天后虫口校正死亡率39.13％，10天后葱蝇幼虫校正死亡率达到81.99％，将处理死虫放于保湿的培养皿中，15天后可以见到葱蝇幼虫变得僵硬，大多数虫体体表长出白色菌丝并产生分生孢子，说明其为球孢白僵菌侵染致死。对照仅少量死虫且不形成僵虫。

表4球孢白僵菌微菌核防治葱蝇盆栽试验

由以上实施例可知，本发明提供了一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法，该方法制备得到的球孢白僵菌微菌核制剂室温条件下产品保存时间长，复水萌发率高，并且在防治害虫上具有良好的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种球孢白僵菌微菌核及其制剂的制备方法和制剂的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。