一种戴尔福特菌及应用

IPC分类号 : C12N1/20,C12N9/00,A23L5/20,C12R1/01

申请号

CN201910045759.4

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专利摘要

本发明涉及微生物利用的技术领域，尤其涉及一种降解储存粮食中及农产品加工副产品上残留辛硫磷的降解酶制剂及其制备方法，具体为一种戴尔福特菌及应用。该戴尔福特菌，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNO.16844。利用该菌株制备了一种酶制剂，将该酶制剂首次用于降解辛硫磷，而且辛硫磷残留能降解90%～99%以上。

权利要求

1.一种戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，其特征在于，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.16844，该戴尔福特菌用于降解粮仓粮食或农产品加工副产品中辛硫磷的应用。

2.如权利要求1所述的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，其特征在于，将采用戴尔福特菌制备得到的酶制剂，以喷雾或者搅拌的方式加入到待处理的体系中，使体系中酶制剂浓度为0.05～0.30g/kg，在温度为20～37℃的条件下，反应1～24h，即可。

3.如权利要求2所述的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，其特征在于，所述的酶制剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)取戴尔福特菌D39菌株划线于LB固体培养基上，25～30℃倒置活化培养1～2d，制得活化后的菌株；

(2)取步骤(1)活化后的菌株接种于LB液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为150～200rpm的条件下，摇床培养6～8h，制得种子液；

(3)取步骤(2)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于LB液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为150～200rpm的条件下，扩大培养3～5d，制得戴尔福特菌D39菌液；

(4)取步骤(3)制得的戴尔福特菌D39菌液，在5000～10000rpm的条件下，离心5～10min，收集菌体，悬浮于10～30倍体积的pH6.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4～25℃、5000～8000rpm的条件下，离心5～8min，弃掉细胞碎片，收集上清液，制得高效降解酶制剂。

4.如权利要求3所述的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的LB固体培养基，每升组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，水定容至1L，pH自然。

5.如权利要求3所述的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的LB液体培养基，每升组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。

6.如权利要求3所述的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的超声波细胞破碎，条件如下：破碎时间/间隙时间为20sec/10sec，总时间15min，功率为170w。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物利用的技术领域，尤其涉及一种降解储存粮食中及农产品加工副产品上残留辛硫磷的降解酶制剂及其制备方法，具体为一种戴尔福特菌及应用。

背景技术

随着高毒农药的禁用，低毒农药逐渐占领市场。2015～2016在工信部农药审批新发证的辛硫磷药企有455家。2015年农药网报道有机磷杀虫剂年销量在19.4万吨占杀虫剂总用量64%，而其中辛硫磷销量第一。辛硫磷是一种低毒有机磷杀虫剂，在农业、渔业和畜牧业中均有使用。2015在蔬菜、小麦等12种主要农作物中辛硫磷用药量排名第一，被广泛用于鳞翅目幼虫、地下害虫、卫生害虫、仓库害虫等。大量、超量使用导致近年辛硫磷残留超标屡见不鲜，农产品加工、水土、果蔬等频繁被检出超量。

辛硫磷的毒性已渐渐被重视，虽然辛硫磷常温稳定，高于120℃易于光解，但其光解产物生成对哺乳动物有很大毒性的硫代特普，对蜜蜂和鱼高毒。据报道辛硫磷能使成年雄鼠的生殖系统完全发生异常。长期接触辛硫磷会危害人们的心脏、肝脏等器官及生殖系统。因此，辛硫磷残留超标问题不容忽视。在我国国标（GB 14869—1994 ）明确规定：辛硫磷在粮食(原粮)和果蔬中最大残留量每公斤不得超过0 .05mg。

辛硫磷等有机磷杀虫剂在粮仓、土壤及根茎类作物比在叶菜上残留时间长。在粮食加工中，辛硫磷等有机磷杀虫剂残留主要在农作物的外表皮部分，因此用作饲料的麦麸、米糠等农副产品均存在辛硫磷严重超标的问题。

发明内容

本发明目的是，针对目前辛硫磷大量过量使用导致频繁被检出超标的现状，提供一种生长速度快、培养方法简单、能高效、稳定安全降解辛硫磷的戴尔福特菌菌株，该菌株用于降解粮仓粮食或农产品加工副产品中的辛硫磷残留，利用该菌株制备了一种酶制剂，将该酶制剂首次用于降解辛硫磷，而且辛硫磷残留能降解90%～99%以上。

本发明目的通过以下技术方案得以实现。

一种戴尔福特菌，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 16844。

该戴尔福特菌是由山东省科学院生态研究所分离获得并保存，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCC NO. 16844，菌种的分类命名是：戴尔福特菌Delftia sp.，参据微生物（株）：D39，保藏日期为2018年11月30日。

本发明的另一目的在于提供本发明的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，进一步的为戴尔福特菌用于降解粮仓粮食或农产品加工副产品中辛硫磷的应用。

本发明的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，将采用戴尔福特菌制备得到的酶制剂，以喷雾或者搅拌的方式加入到待处理的体系中，使体系中酶制剂浓度为0.05 g/kg～0.30 g/kg，在温度为20～37℃的条件下，反应1 ～24 h，即可。

本发明的戴尔福特菌用于降解辛硫磷的应用，所述的酶制剂的制备方法，具体步骤如下：

（1）取戴尔福特菌D39菌株划线于LB固体培养基上，25～30℃倒置活化培养1～2d，制得活化后的菌株；

（2）取步骤（1）活化后的菌株接种于LB液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为150～200rpm的条件下，摇床培养6～8h，制得种子液；

（3）取步骤(2)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于LB液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为150～200rpm的条件下，扩大培养3～5d，制得戴尔福特菌D39菌液；

（4）取步骤(3)制得的戴尔福特菌D39菌液，在5000～10000rpm的条件下，离心5～10min，收集菌体，悬浮于10～30倍体积的pH6 .0～9 .0的磷酸盐缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在4～25℃、5000～8000rpm的条件下，离心5～8min，弃掉细胞碎片，收集上清液，制得高效降解酶制剂。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的LB固体培养基，每升组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，水定容至1L，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中的LB液体培养基，每升组分如下：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中的超声波细胞破碎，条件如下：破碎时间/间隙时间为20sec/10sec，总时间15min，功率为170w。

本发明的有益效果为：

本发明筛选得到一种生长速度快、培养方法简单、能高效、稳定完全降解辛硫磷的戴尔福特菌菌株，并首次利用戴尔福特菌研制降解辛硫磷的酶制剂，该酶制剂对粮仓的储粮及农产品加工的副产品中的辛硫磷残留能降解90%～99%以上。另外，本发明的戴尔福特菌D39酶制剂工艺简单，易于大规模生产。

附图说明

图1为D39在SMM平板上降解辛硫磷后形成的透明水解圈。

图2为D39摇培24h对辛硫磷的降解。

图3为HPLC检测本发明菌株D39对辛硫磷的降解率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1 本发明的戴尔福特菌菌株特性

本发明的戴尔福特菌菌株，菌落呈圆形，乳白色，有凸起，边缘平整，形态饱满，光滑湿润，细胞呈短杆状，大小为（0.6～ 0.8）μm× ( 1.0 ～ 1.5) μm，无芽孢。菌株D39的生理生化特征为: 接触酶反应为阳性，V～P 反应、甲基红反应、硝酸盐还原反应、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验均为阴性，革兰氏染色显阴性。

实施例2 本发明的戴尔福特菌菌株的培养、分离、筛选步骤以及16S rDNA鉴定

本发明的D39 的戴尔福特菌属(Delftia sp.) 菌株，通过以下培养、分离、筛选而得到:

（1）2016年2月从菏泽巨野后屯村不同的麦地和棉花地采用五点取样法取了20个样品。在实验室内每个样品秤取土壤10 g，分别置于90mL的 SMM培养基中，SMM培养基的配方为: NH4NO31.0 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4 0.2 g/L， NaCl 0.5g/L，调pH=7.0后，按100 mg/L添加辛硫磷，于30 ℃，150 rpm摇床培养；

（2）上述培养液每周转移接种一次，以10%的接种量接入新鲜的SMM培养基中,并逐步提高（100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L，500 mg/L）辛硫磷的浓度达500 mg/L。摇瓶结束后，取0.1 mL的富集液涂布于含500 mg/L辛硫磷原液的基础培养基SMM平板中，放置恒温培养箱中培养3 d后挑取生长速度快、菌落规则且有透明圈的降解菌39个，分别转接于含500 mg/L辛硫磷原液的SMM平板中进一步的分离纯化。将活化好的单菌落显微镜检，保证纯单菌落。

（3）降解菌株的筛选：初筛先根据平板水解圈的大小挑取菌落大且水解圈也大的降解菌，选出了2、4、7、8、9、22、23、26、30、34、37、39共12株辛硫磷降解菌。复筛采用HPLC进行降解性能测定。同接菌量摇瓶2 d取培养液1 mL置于具塞的刻度试管中，加入5 mL二氯甲烷，剧烈震荡后静置分层，弃去上层水相，有机相经无水硫酸铵脱水后，取1 mL于微量离心管中，氮气吹干后加入1 mL甲醇溶解（色谱纯），HPLC测定条件为：流动相甲醇：水=80:20，流速1 mL.min-1，进样量10 uL，可变波长检测器的工作波长为280 nm，采用外标法定量。经过测定，筛选得到降解率最高的菌株39。

（4）菌株的16S rDNA鉴定

提取菌株39 的基因组DNA 作为模板，进行16S rRNA 基因的扩增。一对引物分别为:正向引物:5′～AGAGTTTGATCCTGGCTCAG～3′，反向引物:5′～TACGGCTACCTTGTTACGACTT～3′；25 μL 体系为:模板1 μL，引物(1mmol L)各1 μL,Mix（dNTP+Taq+扩增缓冲液）12.5μL , 超纯水9.5μL 。聚合酶链式反应条件:94 ℃, 5 min ；94 ℃, 30 sec ;52.3 ℃, 45sec ;72 ℃, 1.5 min ;循环30 次, 72 ℃延伸10 min 。采用PCR 回收试剂盒回收16SrRNA 的基因片段, 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1.5 kb 左右)后, 将其TA 克隆后进行测序(由BIOAISA 公司完成)。测序结果通过在线分析(http : www .ncbi .nlm.nih.gov), 与GenBank 中的16S rRNA 基因序列进行相似性比较，发现该序列与Delftiasp的16S rRNA序列同源性高达99%。确定该菌株为戴尔福特菌属（Delftia sp.），命名为D39。

实施例3 戴尔福特菌D39酶制剂的毒理学安全性评价

（1）急性毒性试验方法：选最大耐受剂量法，SPF级KM小鼠20只，雌雄各半，设3.0g/kg·BW一个剂量组，以蒸馏水进行配制，搅拌混匀后浓度受试液为13.3%。灌胃给药(灌胃容量为20 mL/kg·BW)，灌胃3次，间隔4 h。求雌雄小鼠急性经口最大耐受剂量（MTD）。

急性毒性试验结果：戴尔福特菌D39酶制剂以3.0 g/kg·BW 剂量灌胃给予小鼠，实验动物饮食及活动正常，未见任何中毒症状和死亡实验结束后，对动物进行大体解剖，肉眼观察各脏器未见异常表明戴尔福特菌D39酶制剂粉雌雄性小鼠经口最大耐受剂量（MTD）均大于3.0 g/kg·BW。

（2）90 d喂养试验

动物单笼喂养，自由进食和饮水，每天观察实验动物的活动和生长情况。分别喂饲含样品2.5、5.0、10.0%和不含样品的饲料，连续90 d。第2、5、13周分别称一次体重，记录给食量和剩食量。计算酶制剂对大鼠体重的影响。实验结束后在对各剂量组动物作大体检查未发现明显病变，只进行最高剂量组及对照组动物主要脏器的解剖。

实验期间，各组动物行动灵活，反应敏捷，被毛整洁，眼鼻口无分泌物，进食饮水正常，生长发育良好，无异常行为和中毒症状，无死亡。通过13周的饲喂，计算每周实际摄食量及每周平均体重。经分析，各剂量组雌雄鼠始重、增重、与对照组比较，无显著性差异。各组间差异不存在剂量反应关系，无统计学意义，说明该样品对大鼠生长发肓无明显影响。

实施例4 用在降解粮仓粮食中的辛硫磷残留

（1）取戴尔福特菌D39菌株划线于LB固体培养基上，25℃倒置活化培养1d，制得活化后的菌株；

（2）取步骤（1）活化后的菌株接种于LB液体培养基中，在温度为25℃、转速为150rpm的条件下，摇床培养8h，制得种子液；

（3）取步骤(2)制得的种子液，按10的体积百分比接种于LB液体培养基中，在温度为25℃、转速为150rpm的条件下，扩大培养3d，制得戴尔福特菌D39菌液；

（4）取步骤(3)制得的戴尔福特菌D39菌液，在8000rpm的条件下，离心10min，收集菌体，悬浮于30倍体积的pH7.0的磷酸盐缓冲液中，进行超声波细胞破碎，在10℃、8000rpm的条件下，离心8min，弃掉细胞碎片，收集上清液，制得高效降解酶制剂。

所述的超声波细胞破碎，条件如下：

破碎时间/间隙时间为20sec/10sec，总时间15min，功率为170w。

上述酶制剂在降解粮仓粮食中辛硫磷的应用步骤如下：

取上述制得的酶制剂，以喷雾或者搅拌的方式加入到待处理的体系中，使体系中酶制剂浓度为0.05～0.30g/kg，在温度为25℃的条件下，反应12h，即可。该待处理的体系是指，待降解的粮仓粮食或农产品加工副产品。

采用五点取样法取上述酶制剂处理后麦粒10克放入三角瓶中加水定容至100mL，摇床150rpm摇30min，取1mL麦粒溶液加入5 mL二氯甲烷萃取3次，有机相经无水硫酸铵脱水后，取1 mL于微量离心管中，氮气吹干后加入1 mL甲醇溶解（色谱纯），HPLC检测辛硫磷的降解率，辛硫磷酶制剂的降解率达93.3%。

实施例5 用于降解食品加工副产品麸皮中残留的辛硫磷

（1）取戴尔福特菌D39菌株划线于LB固体培养基上，25℃倒置活化培养1d，制得活化后的菌株；

（2）取步骤（1）活化后的菌株接种于LB液体培养基中，在温度为25℃、转速为150rpm的条件下，摇床培养8h，制得种子液；

（3）取步骤(2)制得的种子液，按5的体积百分比接种于LB液体培养基中，在温度为25℃、转速为150rpm的条件下，扩大培养3d，制得戴尔福特菌D39菌液；

所述的超声波细胞破碎，条件如下：

破碎时间/间隙时间为20sec/10sec，总时间15min，功率为170w。

上述酶制剂在降解粮仓粮食中辛硫磷的应用步骤如下：

取上述制得的酶制剂，喷雾或者搅拌加入酶制剂使体系中酶制剂浓度为0.10g/kg，在温度为25℃的条件下，反应10h，检测麸皮上的辛硫磷降解率。麸皮的取样和辛硫磷的HPLC检测方法同上述实施例4，经HPLC检测辛硫磷酶制剂对麸皮上辛硫磷的降解率达96.8%。

实施例6

本发明菌株D39单克隆划线法转接于含500mg/L辛硫磷原液的SMM平板中，在25℃恒温培养箱中培养48h后菌株生长的地方SMM培养基变为透明，说明辛硫磷被降解。而没有菌株生长的地方，培养基中的辛硫磷仍然为混浊的乳白色，具体见附图1。

实施例7

发明菌株D39在无菌操作台上按10的体积百分比接种于含500mg/L辛硫磷原液的液体SMM培养基中（以不接菌的为CK对照），在温度为25℃、转速为180rpm的条件下摇培2d后对辛硫磷的降解见附图2，从图2可以看出右边含有D39的三角瓶中辛硫磷被降解后培养液已经变为澄清透明。而对照CK三角瓶培养液中辛硫磷仍然为混浊的乳白色。

实施例8

取上述实施例7中摇瓶2d的培养液采用HPLC进行辛硫磷降解率的检测。具体步骤为，分别取1mL的D39和对照培养液置于具塞的刻度试管中，加入5 mL二氯甲烷，剧烈震荡后静置分层，弃去上层水相，有机相经无水硫酸铵脱水后，取1mL于微量离心管中，氮气吹干后加入1 mL甲醇溶解（色谱纯），HPLC测定条件为：流动相甲醇：水=80:20，流速1 mL.min-1，进样量10uL，可变波长检测器的工作波长为280nm，采用外标法定量。从图3中可以看出对照辛硫磷的出峰时间为4.361min，而含有D39的培养液中在同时间段前后均没有物质峰的出现，D39已经被完全降解。

本发明涉及的序列表如下

序列表

<110>山东省科学院生态研究所

<120>一种戴尔福特菌及应用

<130>18-1-1497

<141>

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1439

<212>DNA

<213>

<400>1

accgtaccgg ctgccttacc atgcagtcga acggtaacag gtcttcggac gctgacgagt60

ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt gcccagtcgt gggggataac tactcgaaag 120

agtagctaat accgcatacg atctgaggat gaaagcgggg gaccttcggg cctcgcgcga 180

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ctcgccagaa gtaggtagcc taaccgcaag gagggcgcta ccacgacggt cgcggcgcc1439

序列表

<110> 山东省科学院生态研究所

<120> 一种戴尔福特菌及应用

<130> 18-1-1497

<141>

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> DNA

<213>

<400> 1

accgtaccgg ctgccttacc atgcagtcga acggtaacag gtcttcggac gctgacgagt 60