专利摘要

专利摘要

本发明涉及医疗器械中的生物反应器技术领域，更具体地，涉及一种灌注式生物反应器实验方法及其使用装置。本发明提出了针对灌注式生物反应器中细胞受层流引起的剪切力与液体静压力的双重影响的实验测试方法，为在灌注式生物反应器的放大培养中，测试培养液在重力作用下对细胞施加的静压力对细胞培养的影响提供了可定量研究的途径。本发明设计了可在所设定的流体剪切力上定量施加液体静压力的装置，能为细胞培养提供在设定的流体剪切力作用的条件下，再提供按既定规律变化或恒定不变的流体静压力的物理刺激因素。

权利要求

1.一种灌注式生物反应器实验方法，其特征在于包括以下步骤：

S1. 根据灌注式生物反应器中层流流体剪切力的要求，同时调节培养液入口（10）与培养液出口（30）的流体流量，使得平行板培养腔（40）内流体的剪切力与灌注式生物反应器中所要求的层流流体剪切力一致；

S2. 保持培养液出口（30）的培养液流出流量固定不变，增加培养液入口（10）的培养液流入流量，使得培养液进入液体静压管（50），当液体静压管（50）内的培养液液面升到所需的高度h时，恢复培养液入口（10）的培养液流入流量；

S3. 液体静压管（50）内培养液的液面高度将维持在所需的高度h，从而可为平行板培养腔（40）内提供压强为                                                 的液体静压力， 为培养液密度，g为重力加速度，h为液体静压管（50）内液面的高度；

S4. 保持培养液出口（30）的培养液流出流量固定不变，调节培养液入口（10）的培养液流入流量，从而调节液体静压管（50）内液面的高度h，从而调节平行板培养腔（40）内所受的液体静压力的大小；

S5. 同步同增量调节培养液入口（10）的培养液流入流量与培养液出口（30）的培养液流出流量，使得液体静压管（50）内液面的高度h维持不变，从而调节平行板培养腔（40）内所受的流体剪切力的大小。

2.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述的步骤S1中，培养液入口（10）与培养液出口（30）流体流量调节通过调节与培养液入口（10）相连的入口蠕动泵、与培养液出口（30）相连的出口蠕动泵实现。

3.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述的步骤S1中对流入、流出流体的同步同增量调节，具体为:

调节培养液的流入、流出流量时，保证流入、流出的流量相同、同步调节，使得液体静压管（50）内的液面高度h维持为0，平行板培养腔（40）内流体所产生的流体剪切力可按泊肃叶定律计算为： ， 为流体流量， 为培养液的粘滞系数，W为平行板培养腔（40）的宽度，H为平行板培养腔（40）的高度，  、W、H都是常量，只需调节培养液的流量Q，获得所需的流体剪切力。

4.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述的步骤S2、S3中，液体静压管（50）内液体相对静止，平行板培养腔（40）内的液体为充分发展的层流运动，静态、动态液体共存，具体为：

从培养液入口（10）进入平行板培养腔（40）内的液体体积，与通过培养液出口（30）流出的液体体积，是相等的，使得平行板培养腔（40）内液体的体积维持不变，从而可使液体静压管（50）内的液面高度维持不变；

在液体静压管（50）中，在管底部的液体参与平行板培养腔（40）内的液体流动，管底部以上的液体不参与平行板培养腔（40）内的液体流动，液体静压管（50）所提供的液体静压力视为静止液体状态下的液体静压力，从而可按压强公式 提供精确的液体静压力，其中， 为培养液密度，g为重力加速度，h为液体静压管（50）内液面的高度。

5.一种使用权利要求1至4任一所述实验方法的实验装置，包括平行板培养腔（40）、与平行板培养腔（40）连通的培养液入口（10）和培养液出口（30），其特征在于，平行板培养腔（40）上还设有液体静压管（50），液体静压管（50）的轴向垂直于平行板培养腔（40），液体静压管（50）与平行板培养腔（40）连通；平行板培养腔（40）上还连通有液体压强测量接口（20）；液体静压管（50）的顶部设有过滤膜（60）。

6.根据权利要求5所述的实验装置，其特征在于，所述的平行板培养腔（40）包括培养腔底盖（41）、设于培养腔底盖（41）上的培养腔上盖（43）、设于培养腔底盖（41）与培养腔上盖（43）之间的培养腔内室（42）；培养腔底盖（41）与培养腔上盖（43）通过密封圈密封固定，所述的培养液入口（10）、培养液出口（30）、液体压强测量接口（20）设于培养腔底盖（41）的外壁上，分别与培养腔内室（42）连通；所述的液体静压管（50）设于培养腔上盖（43）上，且其轴向垂直于培养腔上盖（43）表面，与培养腔内室（42）连通。

7.根据权利要求6所述的实验装置，其特征在于，所述的培养腔上盖（43）上还设有固定螺丝孔（44），螺丝穿过固定螺丝孔（44）使培养腔上盖（43）与培养腔底盖（41）固定。

8.根据权利要求7所述的实验装置，其特征在于，所述的平行板培养腔（40）为长方体结构，其长度为L=60mm，宽度为W=20mm，高度为H=2.5mm。

9.根据权利要求8所述的实验装置，其特征在于，所述的过滤膜（60）为孔径0.2微米的网状膜。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗器械中的生物反应器技术领域，更具体地，涉及一种灌注式生物反应器实验方法及其使用装置。

背景技术

细胞培养是组织工程的关键,也是形成组织工程产业的必要的科学技术基础。现有的用于细胞培养的灌注式生物反应器的研究是基于小规模的细胞培养的条件，在考虑细胞所受的各种物理力刺激时，都是基于所受的液体静压力为零的假设，即是在假设液体的重力加速度为零的前提条件下，主要考虑流体在层流模型下的流体剪切力。

现有的为研究层流模型下提供精确流体剪切力条件的主要实验工具为平行板流动腔装置，其结构示意图如图1所示，其功能为：为图1中的培养腔3内培养的细胞提供精确的流体剪切力的刺激作用，并研究在不同流体剪切力的刺激下细胞培养的效果，以测试流体剪切力与细胞培养效果间存在的量化关系。其原理为：图1所示的平行板流动腔，长L与宽b的值远大于高度h，则在培养腔3的中间部分的流体可认为是充分发展的层流运动，流体产生的流体剪切力可由泊肃叶定律计算为：                                                 ， 为流体流量， 为培养液的粘滞系数，b为图1中培养腔3的宽度，h为培养腔3的高度。 、b、h都是常量，只需调节培养液从培养液入口1进入培养腔3的流量，或调节培养液从培养液出口2流出的流量Q，就能获得所需的流体剪切力。

然而，要实现大规模培养细胞，需考虑现有的小型生物反应器在进行放大后所产生的问题，由于规模的放大，培养液的液深所产生的液体静压力对细胞培养所产生的影响不再是可以忽略的物理力学因素，需要进行研究。即现有的平行板流动腔作为研究灌注式生物反应器中培养液产生力学刺激因素的实验方法与工具时，主要存在以下不足：

（1）、现有的研究灌注式生物反应器中流体力学作用只考虑了流体剪切力的作用，并未考虑流体静压力的作用。事实上，在生物反应器进行放大培养时，由于液深而产生的液体静压力不能再被忽略不计，需要考虑不同的液体静压力对细胞培养的影响；

（2）、现有的能提供精确液体静压力的单一因素对细胞培养影响的实验方法是将细胞放置在有一定液深的培养罐内进行静置培养，这种静置的培养方法虽然可以通过控制液深而获得准确的液体静压力，但会因培养液的不流动使得细胞所需的物质交换难以顺利进行，细胞的培养效果会因物质交换困难而受到严重影响，无法正确测试液体静压力的作用因素；

（3）、现有平行板流动腔只能提供准确的流体剪切力，不能同时提供准确的液体静压力。

（4）、现有的细胞培养实验方法与装置，不能同时提供准确可控的流体剪切力与准确可控的液体静压力，使得这两个作用力为互不影响、能各自调控的共存力。

发明内容

本发明为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷，提供一种灌注式生物反应器实验方法，实现能同时提供准确可控的流体剪切力与准确可控的液体静压力，使得这两个作用力为互不影响、能各自调控的共存力。使得细胞培养在培养液流动培养的条件下，可进行研究液体静压力对细胞培养的影响。进一步的，提供其使用装置，该装置结构简单，方便使用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种灌注式生物反应器实验方法，其中包括以下步骤：

S1. 根据灌注式生物反应器中层流流体剪切力的要求，同时调节培养液入口与培养液出口的流体流量，使得平行板培养腔内流体的剪切力与灌注式生物反应器中所要求的层流流体剪切力一致；其中，培养液入口与培养液出口流体流量调节通过调节与培养液入口相连的入口蠕动泵、与培养液出口相连的出口蠕动泵实现。

S2. 保持培养液出口的培养液流出流量固定不变，增加培养液入口的培养液流入流量，使得培养液进入液体静压管，当液体静压管内的培养液液面升到所需的高度h时，恢复培养液入口的培养液流入流量；

S3. 液体静压管内培养液的液面高度将维持在所需的高度h，从而可为平行板培养腔内提供压强为 的液体静压力， 为培养液密度，g为重力加速度，h为液体静压管内液面的高度；

S4. 保持培养液出口的培养液流出流量固定不变，调节培养液入口的培养液流入流量，从而调节液体静压管内液面的高度h，从而调节平行板培养腔内所受的液体静压力的大小；

S5. 同步同增量调节培养液入口的培养液流入流量与培养液出口的培养液流出流量，从而在调节平行板培养腔内所受的流体剪切力的大小的同时，维持液体静压管内液面高度不变。

进一步的，所述的步骤S1中对流入、流出流体的同步同增量调节，具体为:

调节培养液的流入、流出流量时，保证流入、流出的流量相同、同步调节，使得液体静压管内的液面高度h维持为0，平行板培养腔内流体所产生的流体剪切力可按泊肃叶定律计算为： ， 为流体流量， 为培养液的粘滞系数，W为平行板培养腔的宽度，H为平行板培养腔的高度，  、W、H都是常量，只需调节培养液的流量Q，获得所需的流体剪切力。

进一步的，液体静压管内液体相对静止，平行板培养腔内的液体为充分发展的层流运动，静态、动态液体共存，具体为：

从培养液入口进入平行板培养腔内的液体体积，与通过培养液出口流出的液体体积，是完全相等的，使得平行板培养腔内液体的体积维持不变，从而可使液体静压管内的液面高度维持不变；

在液体静压管中，在管底部的液体参与平行板培养腔内的液体流动，管底部以上的液体不参与平行板培养腔内的液体流动，液体静压管所提供的液体静压力视为静止液体状态下的液体静压力，从而可按压强公式 提供精确的液体静压力，其中， 为培养液密度，g为重力加速度，h为液体静压管内液面的高度。

进一步的，所述步骤S4、S5实现了流体剪切力与液体静压力可分别进行定量调控，而可同时作用于细胞培养的实验测试方法，具体为：

通过步骤S4，可对细胞培养施加所需的液体静压力，所述的液体静压力可进行精确的定量调节，可按照既定的规律变化，也可维持所需的恒定值不变；

通过步骤S5，可对细胞培养施加所需的流体剪切力，所述的流体剪切力可进行精确的定量调节，可按照既定的规律变化，也可维持所需的恒定值不变。

一种灌注式生物反应器实验装置，包括平行板培养腔、与平行板培养腔连通的培养液入口和培养液出口，其中，平行板培养腔上还设有液体静压管，液体静压管的轴向垂直于平行板培养腔，液体静压管与平行板培养腔连通；平行板培养腔上还连通有液体压强测量接口；液体静压管的顶部设有过滤膜。液体压强测量接口可连接检查装置从而检测平行板培养腔内的液体压强。

进一步的，所述的平行板培养腔包括培养腔底盖、设于培养腔底盖上的培养腔上盖、设于培养腔底盖与培养腔上盖之间的培养腔内室；培养腔底盖与培养腔上盖通过密封圈密封固定，所述的培养液入口、培养液出口、液体压强测量接口设于培养腔底盖的外壁上，分别与培养腔内室连通；所述的液体静压管设于培养腔上盖上，且其轴向垂直于培养腔上盖表面，与培养腔内室连通。

进一步的，所述的培养腔上盖上还设有固定螺丝孔，螺丝穿过固定螺丝孔使培养腔上盖与培养腔底盖固定。

具体的，所述的平行板培养腔为长方体结构，其长度为L=60mm，宽度为W=20mm，高度为H=2.5mm。平行板培养腔的长L与宽W的值远大于其高度的值，所述的过滤膜为孔径0.2微米的网状膜，过滤膜将外界细菌进行隔离，整个装置用材料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成。

与现有技术相比，有益效果是：

1）本发明采取准确可控的流体剪切力与准确可控的液体静压力为互不影响、能各自调控的实验方法，使得可分别按其各自的力学作用公式进行严格而准确的调控。

2）本发明采取准确可控的流体剪切力与准确可控的液体静压力能同时共同作用于同一作用点的实验方法，使得该作用点处的细胞所受的力学条件与细胞培养效果间的关系可进行准确的量化分析，并可分离出液体静压力单一因素的影响，为灌注式生物反应器中液体静压力对细胞培养的影响提供可量化的准确分析途径。

3）本发明所采用的实验装置，能为本发明提出的实验方法提供实施的装置，即可同时提供准确可控的流体剪切力与准确可控的液体静压力，所提供的两作用力可互不影响、能各自调控，并可作用于同一作用点。

附图说明

图1是现有的平行板流动腔结构示意图。

图2是本发明实验方法的流程示意图。

图3是本发明实验装置的整体结构示意图。

图4是本发明实验装置的放大结构示意图。

具体实施方式

附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

如图3、4所示，一种灌注式生物反应器实验装置，包括平行板培养腔40、与平行板培养腔40连通的培养液入口10和培养液出口30，其中，平行板培养腔40上还设有液体静压管50，液体静压管50的轴向垂直于平行板培养腔40，液体静压管50与平行板培养腔40连通；平行板培养腔40上还连通有液体压强测量接口20；液体静压管50的顶部设有过滤膜60。液体压强测量接口20可连接检查装置从而检测平行板培养腔40内的液体压强。

平行板培养腔40包括培养腔底盖41、设于培养腔底盖41上的培养腔上盖43、设于培养腔底盖41与培养腔上盖43之间的培养腔内室42；培养腔底盖41与培养腔上盖43通过密封圈密封固定，培养液入口10、培养液出口30、液体压强测量接口20设于培养腔底盖41的外壁上，分别与培养腔内室42连通；液体静压管50设于培养腔上盖43上，且其轴向垂直于培养腔上盖43表面，与培养腔内室42连通。

培养腔上盖43上还设有固定螺丝孔44，螺丝穿过固定螺丝孔44使培养腔上盖43与培养腔底盖41固定。平行板培养腔40为长方体结构，其长度为L=60mm，宽度为W=20mm，高度为H=2.5mm。过滤膜60为孔径0.2微米的网状膜。平行板培养腔的长L与宽W的值远大于其高度的值，其大小符合培养细胞的要求，过滤膜60将外界细菌进行隔离，整个装置用材料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成。

如图3、4所示的装置中，其方法流程如图2所示，将种植了细胞的玻璃载片放置到培养腔内室42的中央位置，将培养腔上盖43覆盖在培养腔底盖41上，之间有O型圈密封，再用螺丝从固定螺丝孔44将其加固。然后仅启动与培养液入口10的蠕动泵，将培养液从储存罐内输入到培养腔内室42内，当培养腔内室42内注满培养液时，启动与培养液出口30连接的蠕动泵，调节其流量，使得培养腔内室42内注满培养液且液体静压管50内没有注入培养液。然后同步同增量调节与培养液出、入口相连接的2个蠕动泵，使培养腔内室42内的流体流量达到所需的流量值 ，以在培养腔内室42内活动所需的流体剪切力： ， 为流体流量， 为培养液的粘滞系数，W为平行板培养腔40的宽度，H为平行板培养腔40的高度。在本发明提出的实验装置中， 、W、H都是常量，只需调节培养液的流量 ，就能获得所需的流体剪切力。此时，由于培养液出、入口的流量始终保持一致，培养腔内室42内培养液的体积没有变化，使得培养腔内室42内注满培养液且液体静压管50内培养液的液面高度为0。

然后保持与培养液出口30相连的蠕动泵的流量不变，仅增加与培养液入口10相连的蠕动泵的流量，使得液体静压管50内的液体表面升高到所需的高度h，然后再使与培养液入口10相连的蠕动泵的流量减少到与培养液出口30相连的蠕动泵的流量，从而使液体静压管50内培养液的液面高度维持为h不变。由于液体压强的连通原理，在培养腔内室42内受到的液体压强与液体静压管50底部受到的液体压强是相同的，都为 提供精确的液体静压力，其中， 为培养液密度，g为重力加速度，h为液体静压管50内液面的高度。从而可为培养腔内室42提供压强为 的液体静压力。

至此，已实现了在培养腔内室42的细胞培养处，同时提供两个作用力，一个作用力是液体静压力 ，可通过液体静压管内液面高度h调节其大小；另外一个作用力是流体剪切力 ，可通过调节培养腔内室42内培养液的流量 调节其大小。

培养腔内室42内的压强，可通过与液体压强测量接口相连的液体压强传感器进行实时观测，以获得准确的液体静压力的数据。

培养液内的气体在培养腔内室42内流动时，可以从图3中的过滤膜60释放到空气中，使得培养腔内室42内的压强不受气体释放而受影响。过滤膜60为孔径为0.2微米的网孔膜，能通过气体，并起隔离细菌的作用。

调节h大小的方法为：保持与培养液出口30相连的蠕动泵的流量不变，仅改变与培养液入口10相连的蠕动泵的流量，使得液体静压管50内的液体表面升高到所需的高度h，然后再使与培养液入口10相连的蠕动泵的流量恢复到与培养液出口30相连的蠕动泵的流量，从而使液体静压管50内培养液的液面高度维持为所需的h不变。

所述的调节 大小的方法是：同步同增量调节与培养液出、入口相连接的2个蠕动泵，使培养腔内室42内的流体流量达到所需的流量值 。

所述的调节h的方法，在调节h的同时，可以保持 不变；所述的调节 的方法，在调节 的同时，可以保持h不变。

所述的液体静压力，是相对静止的作用力，在液体静压管50内，只有底部少量的培养液会因培养腔内室42中培养液的流动而变化，液体静压管50内底部以上的大部分培养液是相对静止的，其对培养腔内室42内提供的液体静压力，可以较严格地按照 进行计算。

本发明提出的实验方法，实现了在提供液体静压力作用的同时，使得细胞能在层流的环境下培养，克服了静置在培养罐中培养时物质交换的不利因素对细胞培养效果的影响，为灌注式生物反应器中液态静压力对细胞培养效果的评估提供了科学准确的量化实验途径。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

一种灌注式生物反应器实验方法及其使用装置专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。