专利摘要

本发明涉及一种提高烟叶质量的生物菌剂，属生物技术领域。该生物菌剂由如下工序制备：a.生产菌株为臭曲霉(Aspergillusfoetidus)G01，CGMCCN0.2851；b.将G01菌株接种到试管斜面培养基上，培养基配方为葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、KH2PO41％、MgSO4·7H2O0.5％、琼脂2％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％、pH7.0，30℃恒温培养2天，获得试管种子；c.将试管种子接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，液体发酵培养基配方为葡萄糖0.7～1％、蛋白胨0.3～0.5％、KH2PO40.5～1％、MgSO4.7H2O0.5％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％、pH7.0，于30～32℃摇床培养，培养时间3～5天，转速为150～200r/min，当菌浓度为每ml活菌数≥107得到液体生物制剂。本发明的生物制剂具有能降低烟叶糖含量、提高钾含量，从而提高烟叶质量的优点，能广泛应用于烟叶的种植。

权利要求

1、一种提高烟叶质量的生物菌剂，其特征在于该生物菌剂由生产菌株经试管种子培养、摇床扩大培养工序制备，其特征在于：

a.生产菌株为臭曲霉(Aspergillus foetidus)G01，CGMCC N0.2851；

b.试管种子培养：将G01菌株接种到试管斜面培养基上，培养基配方为葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、KH₂PO₄ 1％、MgSO₄.7H₂O 0.5％、琼脂2％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％，pH 7.0，配方的比例为重量百分比，30℃恒温培养2天，获得试管种子；

c.摇床扩大培养：将试管种子接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，液体发酵培养基配方为葡萄糖0.7～1％、蛋白胨0.3～0.5％、KH₂PO₄ 0.5～1％、MgSO_4·7H₂O0.5％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％、pH7.0，配方的比例为重量百分比，于30～32℃摇床培养，培养时间3～5天，转速为150～200rpm，当菌浓度为每ml活菌数≥10⁷得到生物制剂。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种提高烟叶质量的生物菌剂，属生物技术领域。

背景技术：

烟叶糖含量偏高、钾含量偏低是影响云南烟叶质量的主要原因之一。降低烟叶糖含量、增加钾含量是烟草科学研究中最受关注的领域之一。烟叶糖含量除受遗传因素、生态因素影响外，应用特殊的施肥(施铵态氮肥、施充足的磷钾肥)、烘烤调制(提高湿度)技术是降低烟叶糖含量的主要途径；增施钾肥是提高烟叶含钾量的主要途径。

随着人们对吸烟与健康问题的广泛关注及减少公害、保护环境运动的兴起，烟草业如何在既能满足消费者的需求，又能减少公害、保护环境上面临严重挑战。目前，提高烟叶质量，必须适当降低烟叶糖含量、增加含钾量。研究开发具有实际应用价值的微生物技术来提高烟叶钾含量、适当降低糖含量，从而提高烟叶质量，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

发明内容：

本发明的主要目的在于提供一种能提高烟叶质量生物菌剂，为生产优质烟叶提供技术支持。

本发明采用的真菌是臭曲霉Aspergillus foetidus G01菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院；保藏日期：2009年1月8日；保藏登记入册的编号CGMCC N0.2851。

G01菌株属于土壤真菌，系本发明人从大量土壤细菌菌株中筛选出来的，具有显著提高烟叶质量的能力，经中国农业科学院中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)进行鉴定，G01菌株为臭曲霉Aspergillus foetidus。

本发明是这样实现的：G01菌株的试管种子培养，摇床扩大培养制备为生物制剂，将制剂应用于大田植烟土壤中，烟叶成熟调制后测定烟叶含钾量。

本发明细菌G01菌株的培养方法(以下为重量百分比)：

1、试管种子培养

试管斜面培养基配方为：葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、KH₂PO₄ 1％、MgSO₄.7H₂O0.5％、琼脂2％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％，pH 7.0。

将G01菌株接种到试管斜面培养基上，30℃恒温培养2天，获得试管种子。

2、液体发酵培养

液体发酵培养基配方为：葡萄糖0.7～1％、蛋白胨0.3～0.5％、KH₂PO₄ 0.5～1％、MgSO₄.7H₂O 0.5％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％，pH 7.0。

将试管种接种子到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，于30～32℃摇床培养，培养时间3～5天，转速为150～200r/min，培养液下摇床后用稀释平板计数法测定菌悬液浓度，菌浓度为每ml活菌数≥10⁷。即得具有提高烟叶含钾量功能的生物制剂。

本发明生物制剂提高烟叶含钾量功能试验：

1、制备生物制剂：按前述G01菌株的培养方法制备试验用制剂；以未接种G01菌株的液体培养基处理作为对照。

2、生物制剂对烟草处理方法

烤烟K326品种(纯氮施用量7克/株，N:P₂O₅:K₂O＝1:1:3)，烟苗大田移栽后15天，将供试菌剂每株浇施100毫升，其余按优质烟生产技术常规管理，烟叶成熟后分叶位采摘按常规烘烤调制。

3、烟叶钾含量测定方法

总糖和还原糖按《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》YC/T159～2002方法测定。总糖(还原糖)含量降低百分率的计算方法为：

总糖(还原糖)含量降低百分率％＝(对照处理烟叶糖含量-制剂处理烟叶糖含量)/对照处理烟叶糖含量×100

烟叶钾含量按《烟草及烟草制品钾的测定火焰光度法》YC/T173～2003方法测定。烟叶钾含量提高百分率的计算方法为：

钾含量提高百分率％＝(制剂处理烟叶钾含量-对照处理烟叶钾含量)/对照处理烟叶钾含量×100

4、试验结果

表1 生物制剂处理烟叶糖和钾含量测定结果

结果表明，生物制剂处理的第5、10、14叶位烟叶总糖含量分别比对照降低27.47％、22.07％、9.49％，还原糖含量分别比对照降低25.91％、20.34％、7.64％，钾含量分别比对照提高7.01％、20.22％、23.72％，表明本发明生物制剂具有降低烟叶糖含量、提高烟叶钾含量，从而提高烟叶质量。

本发明的生物制剂具有降低烟叶糖含量、提高烟叶钾含量，从而提高烟叶质量的优点，能广泛应用于烟叶的种植。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

将Aspergillus foetidus G01菌株接种到试管琼脂斜面上，培养基配方为：葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、KH₂PO₄ 1％、MgSO₄.7H₂O 0.5％、琼脂2％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％、pH 7.0，30℃培养恒温培养2天，获得试管种。

将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为：葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、KH₂PO₄ 1％、MgSO₄·7H₂O 0.5％、氯霉素0.1％、虎红钠盐0.03％，pH7.0。将接好种的三角瓶于30℃下摇床(转速为150r/min)培养，培养时间3天，待菌浓度为达到每ml活菌数≥10⁷时，即得具有提高烟叶质量功能的生物制剂。将该生物菌剂按每株100毫升浇施烟叶，能够降低烟叶糖含量、提高烟叶钾含量，从而提高烟叶质量。

实施例2：

基本同实施例一，不同之处在于液体培养基配方，其配方为：葡萄糖0.7％、蛋白胨0.3％、KH₂PO₄ 0.5％。将接好种的三角瓶于32℃下摇床(转速为200r/min)培养，培养时间5天。

实施例3：

基本同实施例一，不同之处在于液体培养基配方，其配方为：葡萄糖0.8％、蛋白胨0.4％、KH₂PO₄ 0.8％。将接好种的三角瓶于31℃下摇床(转速为180r/min)培养，培养时间4天。

一种提高烟叶质量的生物菌剂专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。