专利摘要

本发明涉及一种β-环糊精功能化硅胶微球手性固定相制备及其在对映体分离中的应用。首先在硅球表面引入3-巯丙基后，然后加入β-环糊精衍生物功能单体和引发剂，功能单体在引发剂的调控下进行巯基-烯加成反应，制备出表面修饰β-环糊精功能单体的手性固定相。该手性固定相的制备过程简单、反应条件温和，并成功应用于对映体的分离。

权利要求

1.一种β-环糊精功能化硅胶微球手性固定相(CSP)，该固定相是通过二氧化硅微球表面上的硅烷化反应在硅胶上键合环糊精功能单体，其结构示意图如下，

其中，m＝1或2。

2.一种权利要求1所述功能化硅胶微球手性固定相的制备方法，其特征在于：

在二氧化硅微球表面修饰3-巯丙基后，加入点击化学反应的功能单体和引发剂，在引发剂的诱导下将功能单体接枝到硅球表面形成单分子功能单体杂化的二氧化硅微球。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，

(1)二氧化硅微球表面修饰3-巯丙基：取4.0-8.0g二氧化硅微球在超声作用下分散在30-90mL的无水甲苯中，在氮气保护下，室温滴加1-8mL3-巯丙基三甲氧基硅烷，在112-120℃油浴中回流16-60h，取出二氧化硅微球用无水乙醇洗涤，然后置于40-80℃的真空干燥箱中干燥2-24h；

(2)β-环糊精功能单体的制备：取1.0-5.0g干燥的β-环糊精溶于20-70mL干燥的吡啶中，然后向其中滴加干燥四氢呋喃3-12mL(内含十一烯酰氯1.092-5.463mL)，最终的混合物在20-80℃下搅拌18-48h，然后向其中加入4-20mL异氰酸苯酯，再将所得混合物置于60-110℃的油浴中反应6-18h；反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，然后将其倒入盛有100-250mL水的烧杯中，有大量的固体析出；过滤后，滤饼用乙醇重结晶，得土黄色的β-环糊精功能单体；

(3)按点击化学方式制备手性固定相材料：取步骤(1)制备的巯丙基功能化二氧化硅微球1.0-3.0g加入到反应瓶中，并向其中加入20-50mL乙腈，超声分散10-40min，再加入0.2-2.5g步骤(2)制备的β-环糊精功能单体，0.45-10.00mg偶氮二异丁腈(AIBN)，冷冻(-60至-80℃)-脱空气-室温溶解循环2-5次，在氮气保护下置于50-65℃的油浴中反应12-36h，产物依次用四氢呋喃、甲醇洗涤后，置于50℃的真空干燥箱中干燥2-24h；得产物。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：

采用匀浆法将步骤(3)制备的手性固定相填装到高效液相色谱柱管中：取步骤(3)制备的手性固定相3-5g并向其中加入70-120mL甲醇中，超声分散20-60min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入不锈钢柱管中。色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)。填充压力为35-60MPa。

5.一种权利要求1所述β-环糊精功能化二氧化硅微球的应用，其特征在于：β-环糊精功能化二氧化硅微球作为高效液相色谱固定相应用于对映体的手性分离。

说明书

技术领域

本发明涉及对映体的分离，具体地说是一种β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相及其制备，以及其在对映体分离中的应用。

背景技术

通过高效液相色谱分离对映体是一项重要而且有挑战的工作。基于环糊精的手性固定相是一种广泛使用的手性固定相(CSP)，因为环糊精的中空结构可以与对映体客体分子形成强的包合物，对映体客体分子与环糊精空腔形成的包合物强度的差异使得这种环糊精功能化的固定相可以用于对映体的分离。许多研究集中于发展将功能化环糊精键合到二氧化硅微球的新方法。氨基连接基团是第一个被引进用于将环糊精衍生物键合到二氧化硅微球表面的连接基团(文献1.Fujimuraet.al“Retentionbehaviorofsomearomaticcompoundsonchemicallybondedcyclodextrinsilicastationaryphaseinliquidchromatography”《AnalyticalChemistry》,1983,55(3),446-450.)。然而，水解不稳定性，繁琐的合成路径以及环糊精低负载量使得氨基连接的环糊精手性固定相在含水流动相中具有很强的局限性(文献2.Armstronget.al“Cyclodextrinbondedphasesfortheliquidchromatographicseparationofoptical,geometrical,andstructuralisomers”《JournalofChromatographicScience》,1984,22(9),411-415.)。随后，酰胺和氨基甲酸酯连接基团也被吸纳用于制备环糊精键合二氧化硅微球(文献3.Kawaguchiet.al“Chemicallybondedcyclodextrinstationaryphasesforliquidchromatographicseparationofaromaticcompounds”《AnalyticalChemistry》,1983,55(12),1852-1857.文献4.Fujimuraet.al“Retentionbehaviorandchiralrecognitionmechanismofseveralcyclodextrin-bondedstationaryphasesfordansylaminoacids”《AnalyticalChemistry》,1990,62(20),2198-2205.)，但是，这些环糊精手性固定相也遇到了氨基连接基团手性固定相同样的问题。另一种固定环糊精的方法是采用不容易水解的醚键连接基团。目前，大多数商品化的环糊精固定相也是通过这些醚键连接基团来制备的(文献5.Wanget.al“Enantioseparationofanovel“click”chemistryderivednativeβ-cyclodextrinchiralstationaryphaseforhigh-performanceliquidchromatography”《JournalofChromatographyA》,2009,1216(12),2388-2393.)。

近年来，1价铜催化的1,3-偶极环加成点击化学已经广泛用于表面修饰。研究者们通过单个的三唑连接基团制备了一系列点击化学衍生的天然环糊精手性固定相和苯基氨基甲酸酯衍生的环糊精手性固定相。这些手性固定相在反相模式下对丹酰氨基酸、黄烷酮、单羟基取代的黄烷酮、苄氟噻嗪、酮洛芬和氯噻酮都有合理的手性分离能力(文献6.Zhanget.al“Preparationofnovelβ-cyclodextrinchiralstationaryphasebasedonclickchemistry”《JournalofChromatographyA》,2008,1191(1),188-192.文献7.Wanget.al“Clickchemistryforfacileimmobilizationofcyclodextrinderivativesontosilicaaschiralstationaryphases”《TetrahedronLetters》2008,49(35),5190-5191.文献8.Wanget.al““Click”immobilizedperphenylcarbamatedandpermethylatedcyclodextrinstationaryphasesforchiralhigh-performanceliquidchromatographyapplication”《JournalofChromatographyA》2010,1217(31),5103-5108.)。然而，在合成这些环糊精手性固定相过程中，涉及到合成相对低收率的单-6-对甲苯磺酰化的β-环糊精中间体。此外，由于使用了1价铜催化剂，这样纯化过程相对复杂。另外，在缓冲液中暴露长时间后，单个三唑连接基团可能变得不稳定。为了提高环糊精手性固定相的合成效率，采用多个三唑连接基团将环糊精衍生物固定在二氧化硅微球上(文献9.Wanget.al““Click”preparationofhinderedcyclodextrinchiralstationaryphasesandtheirefficientresolutioninhighperformanceliquidchromatography”《JournalofChromatographyA》2010,1217(50),7878-7883.)。多个连接基团可以明显地提高环糊精手性固定相在酸性和碱性缓冲液中的稳定性。然而，由于硅胶上炔基的量是固定的，多个三唑连接基团的出现会减少环糊精的键合量。因而，仍然有必要探讨合成β-环糊精手性固定相的有效合成方法。

最近，由于巯基-烯点击化学具有快速反应动力学以及易于在各种模式下引发的特性而备受关注。硫醇和烯的加成可以在亲核催化剂或者碱性催化剂催化下定量的转化而且产生很少的副产物。巯基-烯反应也高度服从自由基聚合的特点，而且光化学和热引发方式也是最常采用的引发模式。此外，这种反应与氧和水兼容，而且可以以立体选择性方式定量地形成对应的硫醚。因此，巯基-烯点击化学有可能成为合成手性固定相的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相的制备及应用，其可用作高效液相色谱的固定相高效快速地完成对映体的分离。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相，β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相的结构示意如下，

其中，m＝1或2。

所述β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相粒径为5μm，孔径为20nm，比表面积为159.8m²/g。

可按如下步骤操作，

(1)二氧化硅微球表面修饰3-巯丙基

具体为：取4.0-8.0g二氧化硅微球在超声作用下分散在30-90mL的无水甲苯中，在氮气保护下，室温滴加1-8mL3-巯丙基三甲氧基硅烷，在112-120℃油浴中回流16-60h，取出二氧化硅微球用无水乙醇洗涤，然后置于40-80℃的真空干燥箱中干燥2-24h；

(2)β-环糊精功能单体的制备

具体为：取1.0-5.0g干燥的β-环糊精溶于20-70mL干燥的吡啶中，然后向其中滴加干燥四氢呋喃3-12mL(内含十一烯酰氯1.092-5.463mL)，最终的混合物在20-80℃下搅拌18-48h，然后向其中加入4-20mL异氰酸苯酯，再将所得混合物置于60-110℃的油浴中反应6-18h；反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，然后将其倒入盛有100-250mL水的烧杯中，有大量的固体析出；过滤后，滤饼用乙醇重结晶，得土黄色的β-环糊精功能单体；

(3)按点击化学方式制备手性固定相材料

具体为：取步骤(1)制备的巯丙基功能化二氧化硅微球1.0-3.0g加入到反应瓶中，并向其中加入20-50mL乙腈，超声分散10-40min，再加入0.2-2.5g步骤(2)制备的β-环糊精功能单体，0.45-10.00mg偶氮二异丁腈(AIBN)，冷冻(-60至-80℃)-脱空气-室温溶解循环2-5次，在氮气保护下置于50-65℃的油浴中反应12-36h，产物依次用四氢呋喃、甲醇洗涤后，置于50℃的真空干燥箱中干燥2-24h，得产物；

(4)手性高效液相色谱柱的填装

具体为：运用匀浆法将步骤(3)制备的手性固定相填装到高效液相色谱的柱管中。取步骤(3)制备的手性固定相3-5g并向其中加入20-70mL甲醇中，超声分散20-60min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入不锈钢柱管中。色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)。填充压力为35-60MPa。

所述β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相可用于对映体(如：β-受体阻断剂：吲哚洛尔(Pindolol)，普萘洛尔(Propranolol)，阿普洛尔(Alprenolol)；黄烷酮类化合物：黄烷酮(Flavanone)；生物碱类化合物：阿托品(Atropine)；以及其它化合物：异丙基肾上腺素(N-isopropyl-DL-noradrenaline)，苯乙胺(Phenylethylamine)，3-氨基-3-苯基丙酸(3-amino-3-phenylpropionicacid)，苯丙氨醇(2-amino-3-phenyl-1-propanol)，二苯乙醇酮(Benzoin)，吡喹酮(Praziquantel)，反-氧化吡烯(Trans-stilbeneoxide)，雷诺嗪(Ranolazine)，佐匹克隆(Zipiclone)和苄氟噻嗪(Bendroflumethiazide等化合物)的分离。

本发明具有如下优点：

1.该合成路线步骤少，反应条件温和，反应效率高，这有利于环糊精功能化二氧化硅微球的快速、高效合成。

2.十一烯酰化的β-环糊精中十一个碳原子的烷烃链提供了合适的间隔臂长度，一方面使得二氧化硅微球表面接枝的功能单体密度高，另一方面可以让对映体分子容易地进入到功能化的环糊精分子中，有利于实现手性拆分。

3.环糊精边缘上的苯基氨基甲酸酯拓展了环糊精固定相的空腔，这在反相模式下有利于与各种类型的对映体化合物形成包合复合物，在正相模式下有利于提高与对映体之间的π-π作用，偶极-偶极相互作用，氢键以及疏水相互作用。

附图说明

图1为β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相的制备示意图。

图2为β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相红外光谱图；

(b)巯丙基功能化二氧化硅微球,(c)β环糊精功能化手性固定相。

图3为对映体化合物结构式。

图4为反相条件下对映体分离的色谱图。

图5为正相条件下对映体分离的色谱图。

具体实施方式

实施例利用β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相分离对映体。

β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相的制备：

1)取3.00gβ-环糊精溶解到50mL无水吡啶中，然后缓慢滴加干燥四氢呋喃8mL(内含十一烯酰氯3.279mL)，在50℃下搅拌36h，再加入12mL异氰酸苯酯，最终的反应物在90℃下搅拌10h；在减压条件下除去吡啶和异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，然后将其倒入盛有200mL水的烧杯中，有大量的固体析出；过滤后，滤饼用乙醇重结晶，得土黄色的单/双(十一烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精，MALDI-TOFMS(m/z):3704和3751分别对应于[单(十一烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精+Na+]和[双(十一烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精+Na+]的分子量；

2)取8.46g二氧化硅微球分散到60mL干燥甲苯中，然后向其中加入7mL3-巯丙基三甲氧基硅烷，最终的反应液在氮气保护下于115℃的油浴中回流24h，产物用30mL水和乙醇各洗5次，置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，得3-巯丙基功能化的二氧化硅微球；

3)取2.3g3-巯丙基功能化的二氧化硅微球分散到乙腈中，依次加入1.9g单/双(十一烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精和8.0mgAIBN后，冷冻(-80℃)-脱空气-室温溶解循环三次，在氩气保护下置于60℃的油浴中反应24h，产物用20mL四氢呋喃洗3次，甲醇洗2次后，置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，得到β-环糊精功能化手性固定相(CD-CSP)；

4)取2.3gCD-CSP材料并向其中加入30mL甲醇中，超声分散30min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入不锈钢柱管中。色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)。填充压力为50MPa。

产物表征

在FT-IR谱中，470,800以及1100cm^-1分别属于Si-O-Si伸缩振动，[SiO4]环振动和Si-O的弯曲振动。2935-2940和2860-2854属于CH₂的振动吸收峰。在CD-CSP(图2(b))的FT-IR谱中，新出现的1734cm^-1属于C＝O的振动吸收峰，这个特征峰的出现说明功能化β-环糊精单体成功接枝到二氧化硅微球表面。

元素分析(表1)中，在3-巯丙基功能化二氧化硅微球中没有氮元素，而在CD-CSP(图2(c))中有氮元素出现，而且碳和氢的含量相对于3-巯丙基功能化二氧化硅微球都有所增加，这说明功能化β-环糊精单体成功接枝到微球表面。

流动相和样品的制备：pH＝4.2的三乙胺醋酸盐缓冲液是用三乙胺和水按体积比为1:1000来配制的，pH值是用醋酸来调节的。甲醇、异丙醇和正己烷这些流动相在使用前用超声仪超声30min。

样品是用甲醇将其配成3mg/mL，上样量为5μL。

表1.巯丙基功能化二氧化硅微球和β-环糊精功能化二氧化硅微球固定相的元素分析数据

表2.在反相条件下对对映体的分离结果

条件：I，甲醇/缓冲盐(醋酸三乙胺缓冲盐0.1％，pH，4.20)，40/60(v/v)，流速，0.7mL/min；II，甲醇/缓冲盐(醋酸三乙胺缓冲盐0.1％，pH，4.20)，50/50(v/v)，流速，0.7mL/min；III，甲醇/缓冲盐(醋酸三乙胺缓冲盐0.1％，pH，4.20)，50/50(v/v)，流速，0.8mL/min。

表3.在正相条件下对对映体的分离结果

条件：I，正己烷/异丙醇，20/80(v/v)，流速，0.7mL/min；II，正己烷/异丙醇，50/50(v/v)，流速，0.7mL/min；III，正己烷/异丙醇，35/65(v/v)，流速，0.7mL/min；IV，正己烷/异丙醇，35/65(v/v)，流速，1.0mL/min。

结论：从上述表中的分离结果可以看出，该手性固定相对图3所示的对映体具有较好的拆分效果。

一种β-环糊精功能化手性固定相及其制备和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。