专利摘要

本发明属于医药技术领域，提供了一种中草药过山蕨有效成分及其提取方法和用途。该提取方法包括水提法、醇提法、大孔树脂纯化法、溶剂萃取法。经该方法所得的提取物主要有效成分为总黄酮、总皂苷、总有机酸，其含量分别为总黄酮1％－35％，总皂苷1％－25％，总酚酸1％－3％。本发明还提供了过山蕨直接或与药学上通常用于该类制剂的固体或液体混合制成适宜剂型的方法，过山蕨有效成分及其制剂具有治疗血栓闭塞性脉管炎，肾炎，外伤出血，子宫出血，神经性皮炎，脑栓塞引起的偏瘫以及糖尿病并发症的作用。该提取方法简单易行、成本低，所得提取物无毒副作用。

权利要求

1、过山蕨有效成分，其特征在于：包括山柰酚型黄酮苷类、环阿尔廷型三萜皂苷类、小分子酚酸类；该有效成分的结构式为：

2、一种如权利要求1所述的过山蕨有效成分的提取方法，其特征在于：其提取方法如下：

取原药材去杂后，加15至30倍量水煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置6-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液加乙醇沉淀1-2次，控制提取液中乙醇浓度在50％-90％，在0-10℃下低温静置12-48小时至沉淀完全，再次过滤，滤液回收乙醇至无醇味，所得上清液经大孔树脂进行分离纯化，分别以水，5％-95％乙醇，乙醇洗脱，5％-95％乙醇洗脱物为有效成分组；

或取原药材去杂后，加15至30倍量的5％-95％的乙醇煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置12-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液加乙醇沉淀1-2次，控制提取液中乙醇浓度在50％-90％，在0-10℃下低温静置12-48小时至沉淀完全，再次过滤，滤液回收乙醇至无醇味，所得上清液经大孔树脂进行分离纯化，分别以水，5％-95％乙醇，乙醇洗脱，5％-95％乙醇洗脱物为有效成分组；

或取原药材去杂后，加5％-95％的乙醇煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置12-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液分别用石油醚(或环己烷、正己烷)、乙酸乙酯、正丁醇萃取两次以上至萃取完全。回收溶媒，所得乙酸乙酯萃取层和正丁醇萃取层为有效成分组；

或取原药材去杂后，加15至30倍量水煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置6-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液分别用石油醚(或环己烷、正己烷)、乙酸乙酯、正丁醇萃取两次以上至萃取完全。回收溶媒，所得乙酸乙酯萃取层和正丁醇萃取层为有效成分组。

3、根据权利要求2所述的过山蕨有效成分的提取方法，其特征在于：所述的有效成分组中：总黄酮含量为1％-35％，总皂苷含量为1％-25％，总酚酸含量为1％-3％。

4、根据权利要求2所述的过山蕨有效成分的提取方法，其特征在于：还可以将过山蕨有效成分组提取液经喷雾干燥制成粉末状固体。

5、根据权利要求4所述的过山蕨有效成分的提取方法，其特征在于：其喷雾干燥条件为：喷入的空气预热至280±20℃，喷入的空气压力为3-6kg/cm²，干燥室内温度保持在120±20℃，提取粉中总有效成分含量＞50％。

6、过山蕨有效成分在制备治疗血栓闭塞性脉管炎，肾炎，外伤出血，子宫出血，神经性皮炎，脑栓塞引起的偏瘫以及糖尿病并发症药物中的应用。

说明书

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及中草药过山蕨的有效成分提取方法和用途，以及过山蕨有效成分制剂的生产加工方法。

背景技术：

过山蕨(Camptosorus sibiricus Rupr.)，又名马蹬草，还阳草，过桥草，为铁角蕨科，过山蕨属多年生草本植物。本属全世界共两种，中国产一种。过山蕨是一种传统草药，民间用于治疗外伤出血，子宫出血，血栓闭塞性脉管炎，肾炎，神经性皮炎，脑栓塞引起的偏瘫以及糖尿病并发症等，具有确切疗效。实验表明，该草药毒性很小，对血压无明显影响，长期给药对家兔肝功能未见不良影响。其有效成分的提取及利用其有效成分生产加工成制剂未有报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供过山蕨有效成分的提取方法，以及利用其有效成分生产加工数种制剂，将其作为治疗血栓闭塞性脉管炎，肾炎，外伤出血，子宫出血，神经性皮炎，脑栓塞引起的偏瘫以及糖尿病并发症的药物。

过山蕨有效成分组成如下：

本发明是是通过如下方案实现的：所述过山蕨有效成分的制备方法分四种：

方法1：取原药材去杂后，加15至30倍量水煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置6-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液加乙醇沉淀1-2次，控制提取液中乙醇浓度在50％-90％，在0-10℃下低温静置12-48小时至沉淀完全，再次过滤，滤液回收乙醇至无醇味，所得上清液经大孔树脂(HPD 100或D101)进行分离纯化，分别以水，5％-30％乙醇，30％-60％乙醇，60％-95％乙醇洗脱，5％-30％乙醇洗脱物为有效成分组1，30％-60％乙醇洗脱物为有效成分组2，60％-95％乙醇洗脱物为有效成分组3，三者按折合生药材量1∶1∶1组合为过山蕨有效提取物。

方法2：取原药材去杂后，加15至30倍量的5％-95％的乙醇煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置12-24小时至沉淀完全，除去沉淀，所得上清液经大孔树脂(HPD 100或D101)进行分离纯化，分别以水，5％-30％乙醇，30％-60％乙醇，60％-95％乙醇洗脱，5％-30％乙醇洗脱物为有效成分组1，30％-60％乙醇洗脱物为有效成分组2，60％-95％乙醇洗脱物为有效成分组3，三者按折合生药材量1∶1∶1组合为过山蕨有效提取物。

方法3：取原药材去杂后，加15至30倍量的5％-95％的乙醇煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置12-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液分别用石油醚(或环己烷、正己烷)、乙酸乙酯、正丁醇萃取两次以上至萃取完全。回收溶媒，所得正丁醇萃取层经大孔树脂(HPD 100或D101)纯化，分别以水，5％-95％乙醇，乙醇洗脱，5％-95％乙醇洗脱物为有效成分组分1，乙酸乙酯萃取层为有效成分组2，二者按折合生药材量1∶1组合为过山蕨有效提取物。

方法4：取原药材去杂后，加15至30倍量水煎煮不少于两次，每次提取时间不少于1小时，提取液浓缩至药液体积的五分之一至二十分之一，在0-10℃下低温静置6-24小时至沉淀完全，除去沉淀，取上清液分别用石油醚(或环己烷、正己烷)、乙酸乙酯、正丁醇萃取两次以上至萃取完全。回收溶媒，所得正丁醇萃取层经大孔树脂纯化，分别以水，5％-95％乙醇，乙醇洗脱，5％-95％乙醇洗脱物为有效成分组分1，乙酸乙酯萃取层为有效成分组2，二者按折合生药材量1∶1组合为过山蕨有效提取物。

所得过山蕨有效成分提取物中，总黄酮含量为1％-35％，总皂苷含量为1％-25％，总酚酸含量为1％-3％。

由上述方法可见，过山蕨有效成分提取物由总黄酮、总皂苷和总酚酸组成，可通过上述四种方法制备，可简述为方法一：水提-水沉-醇沉-大孔树脂分段纯化；方法二：醇提-水沉-大孔树脂分段纯化；方法三：醇提-溶剂分段萃取-大孔树脂纯化；方法四：水提-溶剂分段萃取-大孔树脂纯化。

本发明所述提取物具有抗氧化、清除自由基、醛糖还原酶抑制、扩张血管等活性，可用于治疗血栓闭塞性脉管炎、糖尿病性肾炎、外伤出血等症的治疗。利用本发明获得的过山蕨有效成分提取物中的部分单体化合物具有显著的抗氧化、清除自由基、醛糖还原酶抑制的活性。

本发明的优点如下：

(1)本制备方法所得过山蕨提取物成分明确，其中化合物1-12，19-21为过山蕨特有成分，质量可控性强。

(2)本发明所得过山蕨有效成分提取物由三种不同类型天然产物组成，具有多靶点协同作用且毒副作用低的优点。

(3)制备方法简便、易行，提取充分，适宜于工业生产

(4)过山蕨有效成分提取物活性显著，疗效确切，可有效降低中药服用量。

附图说明：

图1为部分单体化合物类SOD活性测试结果

*：IC50＜10uM

图2为部分单体化合物自由基清除活性测试结果

*：IC50＜15uM

图3为部分单体化合物醛糖还原酶抑制活性测试结果

*：IC50＜50uM

具体实施方式：

实施例1

按照有效成分制备方法1

(1)取干燥过山蕨全草10kg，去除杂质、灰尘

(2)在中药提取罐中加入药材和18倍量的水，加热煮沸，提取两次，每次2小时。

(3)合并两次提取液，浓缩至20L，在4℃下低温静置24小时至沉淀完全，除去沉淀。

(4)取上清液加入乙醇，调节醇浓度至50％，在10℃下低温静置24小时至沉淀完全，再次过滤，滤液回收乙醇至无醇味。

(5)上清液上样至非极性大孔树脂柱，分别用水(8V_R)、20％乙醇(4V_R)、60％乙醇(4V_R)、90％乙醇(4V_R)梯度洗脱，得水洗物弃去，20％乙醇洗脱物、60％乙醇洗脱物、90％乙醇洗脱物按照折合生药量1∶1∶1比例混合，得过山蕨有效提取物，其中总黄酮含量为30％，总皂苷含量为20％，总酚酸含量为1％。

实施例2

按照有效成分制备方法2

(1)取干燥过山蕨全草5kg，去除杂质、灰尘

(2)在中药提取罐中加入药材和20倍量的70％乙醇，加热回流提取三次，分别为2小时，1.5小时，1小时。

(3)合并三次提取液，浓缩至8L，在4℃下低温静置12小时至沉淀完全，除去沉淀。

(5)上清液上样至非极性大孔树脂柱，分别用水(8V_R)、30％乙醇(4V_R)、70％乙醇(4V_R)、95％乙醇(4V_R)梯度洗脱，得水洗物弃去30％乙醇洗脱物、70％乙醇洗脱物、95％乙醇洗脱物按照折合生药量1∶1∶1比例混合，得过山蕨有效提取物，其中总黄酮含量为33％，总皂苷含量为20％，总酚酸含量为2％。

实施例3

按照有效成分制备方法3

(1)取干燥过山蕨全草6kg，去除杂质、灰尘

(2)在中药提取罐中加入药材和25倍量的75％乙醇，加热回流提取三次，分别为2小时，1.5小时，1小时。

(3)合并三次提取液，浓缩至10L，在4℃下低温静置20小时至沉淀完全，除去沉淀。

(4)上清液用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取四次。得石油醚萃取物320克，乙酸乙酯萃取物60克，正丁醇萃取物180克。回收溶酶，所得正丁醇萃取物进一步经大孔树脂纯化，分别以水，95％乙醇洗脱，减压回收溶酶得95％乙醇洗脱物140克。将95％乙醇洗脱物与乙酸乙酯萃取物按折合生药比1∶1比例混合，得到过山蕨有效成分提取物。得过山蕨有效提取物，其中总黄酮含量为28％，总皂苷含量为21％，总酚酸含量为1.5％。

实施例4

按照有效成分制备方法4

(1)取干燥过山蕨全草10kg，去除杂质、灰尘

(2)在中药提取罐中加入药材和30倍量的水，加热煮沸提取三次，分别为2小时，1.5小时，1小时。

(3)合并三次提取液，浓缩至15L，在4℃下低温静置12小时至沉淀完全，除去沉淀。

(4)上清液用等体积环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取四次。得石油醚萃取物510克，乙酸乙酯萃取物70克，正丁醇萃取物310克。回收溶酶，所得正丁醇萃取物进一步经大孔树脂纯化，分别以水，90％乙醇洗脱，减压回收溶酶得95％乙醇洗脱物240克。将95％乙醇洗脱物与乙酸乙酯萃取物按折合生药比1∶1比例混合，得到过山蕨有效成分提取物。得过山蕨有效提取物，其中总黄酮含量为26％，总皂苷含量为24％，总酚酸含量为1.1％。

实施例5

采用SOD试剂盒对提取物中的单体化合物进行了抗氧化活性测试

实验方法如下

实验结果：见表1

实施例6

采用DPPH自由基清除筛选模型，对提取物中的单体化合物进行了自由基清除活性测试

实验方法如下

实验结果：见表1

实施例7

采用醛糖还原酶抑制剂(ARI)筛选模型，对提取物中的单体化合物进行了醛糖还原酶抑制活性测试。

实验方法如下

A 180mM Na-K磷酸盐缓冲液                      225μL

B 1.0M Li₂SO4                                 50μL

C 10mM DL-glyceraldehyde(样品组平行2)         50μL

  H₂O(空白组)                                 50μL

D 稀释后的醛糖还原酶                          100μL

E 样品(样品组和空白组各)                      25μL

A-E混合液在30℃下水浴加热3min，加入0.3M NADPH 50μL，再在30℃水浴下加热30min，加入0.5N HCl 150μL，再加入10mMimidazole 500μL(含6N NaOH)，在60℃水浴下加热20min，室温放置，向96孔板中分别加入200μL反应液，荧光检测仪检测(λ_ex 360nm，λ_em 460nm)

实验结果：见表1

实施例8

取过山蕨有效提取物(制备方法如实施例1)干燥、粉碎、过80目筛，直接或加适宜稀释剂(糊精、微晶纤维等)灌装胶囊。

实施例9

取过山蕨有效提取物(制备方法如实施例2)按1∶1～1∶4比例加入稀释剂(糊精、淀粉等)，干燥、粉碎，制粒、压片或制丸剂。

过山蕨有效成分及其提取方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。