专利摘要

本发明属于天然抗菌药物技术领域，具体涉及从顶花板凳果中提取分离得到的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，所述孕甾烷生物碱类化合物分子式为C28H46N2O2，化学结构式为：。本发明的孕甾烷生物碱类化合物DSHP对耐药菌表现出全程的生长抑制作用，在浓度为50μg/mL时也表现出良好的杀菌活性，与传统抗生素相比，对感染的小鼠肝、肾、脾、肺等器官有明显的保护作用且不易产生诱导耐药。

权利要求

1.一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，所述孕甾烷生物碱类化合物分子式为C₂₈H₄₆N₂O₂，化学结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述孕甾烷生物碱类化合物的来源是从顶花板凳果干燥全草中提取获得。

3.根据权利要求2所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述孕甾烷生物碱类化合物的提取方法具体步骤如下：步骤1）取顶花板凳果干燥全草15 kg，经剪碎后，加入20 L质量百分比浓度为90%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得浓缩的乙醇提取物；步骤2）将浓缩的乙醇提取物分散于10 L水中，用质量百分比浓度2%稀盐酸调整pH值至2，抽滤除去不能溶解物质得酸性母液；步骤3）用质量百分比浓度4%氨水调整酸性母液pH值至9，得到的碱性溶液用等体积石油醚进行萃取脱脂，而后碱水层再用等体积的氯仿萃取两次，浓缩后得氯仿萃取物即为总生物碱；步骤4）对总生物碱用氧化铝柱层析进行分离提纯，接收流份，并用硅胶薄层层析检测，收集R_f值在0.25～0.40处显示黄色斑点的流份进行ODS反相柱层析，以甲醇-水的混合溶剂洗脱，接收流份经薄层层析检测，合并含该孕甾烷生物碱类化合物的第19～26流份，减压蒸干溶剂后得浓缩物，浓缩物用甲醇溶解，再采用Sephadex LH-20凝胶柱层析除去大分子类杂质，接收流份进行薄层层析检测，合并含该孕甾烷生物碱类化合物的第15～22流份，减压蒸干溶剂后得到浓缩物，该浓缩物再采用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，得到该孕甾烷生物碱类化合物纯品。

4.根据权利要求3所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述的对总生物碱用氧化铝柱层析进行分离提纯：以氯仿-甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，取下层作为洗脱液，洗脱液的体积比依次为30:1:0、20:1:0、10:1:1、8:1:1、9:2:1、5:2:1、7:3:1和6.5:3:1，每个梯度洗脱液用量为2 L，按500 mL为1个流份接收。

5.根据权利要求3所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述硅胶薄层层析检测，展开剂为15:4:1氯仿-甲醇-水混合溶剂的下层，显色剂为改良的碘化铋钾溶液。

6.根据权利要求3所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述ODS反相柱层析，以甲醇-水的混合溶剂洗脱，洗脱液的体积比依次为1:2，1:1，2:1，3:2和5:1，每个梯度洗脱液用量为400 mL，按50 mL为1个流份接收。

7.根据权利要求3所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述采用Sephadex LH-20凝胶柱层析除去大分子类杂质，甲醇为流动相，用量为800ml，按20 mL为1个流份接收。

8.根据权利要求3所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱条件为：YMC-Triart C18液相色谱柱，柱高250 mm，柱半径20 mm，质量百分比浓度78%的甲醇水溶液为流动相，其中含质量百分比3%的氨水，流速8 mL/min，室温下UV-VIS检测器225 nm波长处检测，保留时间为18 min，得到孕甾烷生物碱类化合物的纯品。

9.根据权利要求1-3任一项所述的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：所述孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物时能单独使用或与其他辅料混合，其剂型是注射剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。

说明书

技术领域

本发明属于天然抗菌药物技术领域，具体涉及从顶花板凳果中提取分离得到的一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

众所周知，由于抗生素的滥用，各种细菌的耐药性问题日益突出，无药可治的细菌感染将严重影响人类的生存。特别是近二十年来，随着新型抗菌药物的发明和使用，各种致病菌的新型耐药性也伴之而来，事实表明目前新抗生素的研发速度完全跟不上细菌变异产生耐药性的速度，造成了临床用于耐药菌的有效抗菌药物正日趋减少，形势愈发严峻，为有效对抗日益严重的耐药细菌，寻找具有新型结构且不易产生诱导耐药的抗菌药物，已经成为全世界高度关注的焦点和当今各国相关学科研究的当务之急。

 时至今日，在全球新上市的药物中，直接或间接来自于天然产物或其衍生物的仍占较大比重。生物碱类化合物是人类研究最早和最多的具有生物活性的一类天然有机化合物，往往是众多天然药物的有效成分，已有大量单体成分及其衍生物应用于临床。黄杨科植物富含生物碱类成分，由于药理活性广泛，该科许多植物长久以来已被药用，如细叶黄杨、金丝矮陀陀、顶花板凳果、野扇花、东方野扇花、长柄野扇花、大叶野扇花等均为较有名的药用植物。板凳果属植物隶属于黄杨科，共有三个种，美洲产一种，我国产有两个种和两个变种，分别为顶花板凳果、板凳果、多毛板凳果和光叶板凳果，其中顶花板凳果的干燥全草在陕西俗名为“捆仙七”，是秦岭“太白七药”之一，从该植物获得的生物碱化合物隶属于孕甾烷类富贵草型生物碱，对该生物碱化合物进行抑菌杀菌试验，对耐药菌表现出全程的生长抑制作用及良好的杀菌活性。

发明内容

 本发明涉及一种来源于顶花板凳果的孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用。本发明涉及的孕甾烷生物碱类化合物是从顶花板凳果中分离提取出来，用于对抗日益严重的耐药细菌，寻找具有新型结构且不易产生诱导耐药的抗菌药物。

本发明的技术方案是：一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，所述孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用，所述孕甾烷生物碱类化合物分子式为C₂₈H₄₆N₂O₂，化学名称为20α-二甲胺基-3β-二甲烯丙酰胺基-16β-羟基-孕甾-5(6)-烯，简称为DSHP，化学结构式如下：

所述孕甾烷生物碱类化合物的来源是从顶花板凳果干燥全草中提取获得。

所述孕甾烷生物碱类化合物的提取方法具体步骤如下：

步骤1）取顶花板凳果干燥全草15 kg，经剪碎后，加入20 L质量百分比浓度为90%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得浓缩的乙醇提取物；步骤2）将浓缩的乙醇提取物分散于10 L水中，用质量百分比浓度2%稀盐酸调整pH值至2，抽滤除去不能溶解物质得酸性母液；步骤3）用质量百分比浓度4%氨水调整酸性母液pH值至9，得到的碱性溶液用等体积石油醚进行萃取脱脂，而后碱水层再用等体积的氯仿萃取两次，浓缩后得氯仿萃取物即为总生物碱；

步骤4）对总生物碱用氧化铝柱层析进行分离提纯，接收流份，并用硅胶薄层层析检测，收集R_f值在0.25～0.40处显示黄色斑点的流份进行ODS反相柱层析，以甲醇-水的混合溶剂洗脱，接收流份经薄层层析检测，合并含该孕甾烷生物碱类化合物的第19～26流份，减压蒸干溶剂后得浓缩物，浓缩物用甲醇溶解，再采用Sephadex LH-20凝胶柱层析除去大分子类杂质，接收流份进行薄层层析检测，合并含该孕甾烷生物碱类化合物的第15～22流份，减压蒸干溶剂后得到浓缩物，该浓缩物再采用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，得到该孕甾烷生物碱类化合物纯品。

所述的对总生物碱用氧化铝柱层析进行分离提纯：以氯仿-甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，取下层作为洗脱液，洗脱液的体积比依次为30:1:0、20:1:0、10:1:1、8:1:1、9:2:1、5:2:1、7:3:1和6.5:3:1，每个梯度洗脱液用量为2 L，按500 mL为1个流份接收。

所述硅胶薄层层析检测，展开剂为15:4:1氯仿-甲醇-水混合溶剂的下层，显色剂为改良的碘化铋钾溶液。

所述ODS反相柱层析，以甲醇-水的混合溶剂洗脱，洗脱液的体积比依次为1:2，1:1，2:1，3:2和5:1，每个梯度洗脱液用量为400 mL，按50 mL为1个流份接收。

    所述采用Sephadex LH-20凝胶柱层析除去大分子类杂质，甲醇为流动相，用量为800ml，按20 mL为1个流份接收。

所述半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱条件为：YMC-Triart C18液相色谱柱，柱高250 mm，柱半径20 mm，质量百分比浓度78%的甲醇水溶液为流动相，其中含质量百分比3%的氨水，流速8 mL/min，室温下UV-VIS检测器225 nm波长处检测，保留时间为18 min，得到孕甾烷生物碱类化合物的纯品。

所述孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物时能单独使用或与其他辅料混合，其剂型是注射剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。

本发明的特点：

 1、对耐药菌表现出全程的生长抑制作用，在浓度为50μg/mL时也表现出良好的杀菌活性；

    2、与传统抗生素相比，对感染的小鼠肝、肾、脾、肺等器官有明显的保护作用且不易产生诱导耐药。

附图说明

图1是DSHP的主要碎片离子峰(EI-MS)；

图2是DSHP的主要HMBC相关；

图3是DSHP的主要NOESY相关；

图4是DSHP作用于LAC的生长曲线；

图5是DSHP作用于MRSE的生长曲线；

图6是 DSHP作用于LAC的杀菌曲线；

图7是DSHP作用于MRSE的杀菌曲线；

图8是小鼠肝脏组织切片(HE染色×200)；

图9是小鼠脾组织切片(HE染色×200)；

图10是小鼠肺组织切片(HE染色×200)；

图11是小鼠肾组织切片(HE染色×200)；

图12 DSHP作用于LAC 180 min 后透射电镜观察结果；

图13 几种药物及DSHP对LAC的诱导耐药结果。

具体实施方式

实施例1：

本实施例提供该孕甾烷生物碱类化合物的分离提纯，分子式为C₂₈H₄₆N₂O₂，化学名称为20α-二甲胺基-3β-二甲烯丙酰胺基-16β-羟基-孕甾-5(6)-烯，以下简称为DSHP，化学结构式如下：

制备DSHP的原料为顶花板凳果干燥全草15 kg，经剪碎后，加入20 L质量百分比浓度为90%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得浓缩的乙醇提取物；将该提取物分散于10 L水中，用质量百分比浓度2%稀盐酸调整pH值至2，抽滤除去不能溶解物质得酸性母液；酸性母液再使用质量百分比浓度4%氨水调整pH值至9，得到的碱性溶液用等体积石油醚进行萃取脱脂，而后碱水层再用等体积的氯仿萃取两次，浓缩后得氯仿萃取物即为总生物碱32 g；对总生物碱进行氧化铝柱层析，以氯仿-甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，取下层作为洗脱液，洗脱液的体积比依次为30:1:0、20:1:0、10:1:1，、8:1:1、9:2:1、5:2:1、7:3:1和6.5:3:1，每个梯度洗脱液用量为2 L，按500 mL为1个流份接收，并用硅胶薄层层析检测，其中展开剂为15:4:1氯仿-甲醇-水混合溶剂的下层，显色剂为改良的碘化铋钾溶液，收集Rf值在0.25～0.40处显示黄色斑点的流份，共6 g；将该6 g物质继续进行ODS反相柱层析，以甲醇-水的混合溶剂洗脱，洗脱液的体积比依次为1:2，1:1，2:1，3:2和5:1，每个梯度洗脱液用量为400 mL，按50 mL为1个流份接收，薄层层析检测，合并含化合物DSHP的第19～26流份，减压蒸干溶剂后得1.0 g浓缩物，用甲醇溶解，再采用Sephadex LH-20凝胶柱层析除去大分子类杂质，甲醇为流动相，用量为800 mL，按20 mL为1个流份接收，薄层层析检测，合并含化合物DSHP的第15～22流份，减压蒸干溶剂后得到0.45 g浓缩物，该浓缩物再采用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱条件为YMC-Triart C18液相色谱柱，柱高250 mm，柱半径20 mm，质量百分比浓度78%的甲醇水溶液为流动相，其中含质量百分比3%的氨水，流速8 mL/min，室温下UV-VIS检测器225 nm波长处检测，保留时间为18 min，得到化合物DSHP的纯品56.0 mg。

实施例2：

化合物DSHP的结构鉴定：DSHP为淡黄色无定形粉末，ESI-MS给出准分子离子峰m/z 443 [M+H]⁺ (正离子模式) 和 m/z 441 [M?H]^? (负离子模式)，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 443.3640 [M+H]⁺ (calcd. for C₂₈H₄₇N₂O₂ 443.3638)。同时，结合¹H-NMR (500 MHz，CDCl₃)和¹³C-NMR (125 MHz，CDCl₃) 波谱数据，见表1，确定该化合物的分子式为C₂₈H₄₆N₂O₂。

表1 DSHP(溶剂：CDCl₃)的氢谱(500 MHz)及碳谱(125 MHz)数据

    化合物DSHP的核磁共振氢谱(500 MHz，CDCl₃)中高场区显示该化合物有七个甲基信号δ0.89 (3H，s，Me-18)，0.95 (3H，d，J = 6.5 Hz，Me-21)，1.00 (3H，Me-19)，1.82 (3H，s，Me-4’)，2.14 (3H，s，Me-5’)和2.25 (6H，s，Me₂-N_a)，其中2.25 (6H，s，Me₂-N_a)是典型的氮甲基质子信号；在中场区可以观察到三个孤立的多重峰信δ2.94 (1H，m，H-20)，δ3.73 (1H，m，H-3)和δ4.34 (1H，m，H-16)；在低场区有两个烯氢信号δ5.53 (1H，s，H-2’) 和δ5.37 (1H，s，H-6)。

结合DEPT谱分析化合物DSHP的核磁共振碳谱(125 MHz，CDCl₃)，可以观测到28个碳原子(由于屏蔽效应，两个氮甲基碳原子需结合HSQC谱仔细分辨)，其中在低磁场区可以观测到一个羰基信号δ166.4 (C-1’)，四个烯碳信号δ150.4 (C-3’)，δ140.5 (C-5)，δ121.8 (C-6)和δ119.0 (C-2’)；在中高场区可以观测到五个甲基信号δ10.0 (C-21)，δ 14.2 (C-18)，δ 19.5 (C-19)，δ 19.9 (C-5’)，δ 27.3 (C-4’)，两个氮甲基碳信号δ40.0 (Me₂-N_a)，七个亚甲基碳信号δ 20.9 (C-11)，δ 32.1 (C-7)，δ 29.4 (C-2)，δ 35.0 (C-15)，δ 38.0 (C-1)，δ 39.5 (C-4)，δ 40.2 (C-12)，七个次甲基碳信号δ 31.4 (C-8)，δ 49.4 (C-3)，δ 50.3 (C-9)，δ 53.7 (C-14)，δ 57.0 (C-20)，δ 59.0 (C-17)，δ 72.8 (C-16),两个季碳信号δ 36.8 (C-10)，δ 41.6 (C-13)。综合以上波谱数据并从生源角度出发，推测该化合物为富贵草型生物碱，如图1所示，化合物EI-MS给出的强碎片离子峰m/z 72，为CH₃CH=N⁺(CH₃)₂碎片，是20α-二甲胺基孕甾烷类生物碱特征碎片离子。

如图2，从HMBC谱图上可以观察到H-16与C-13，14的相关信号以及H-17与C-13，16，20的相关信号，进一步验证了羟基连于C-16。如图3，从NOESY谱图上可以观察到H-16与14α-H、17α-H的相关信号，可以推测16-OH为β构型。同时，有文献[邱明华, 王德祖, 聂瑞麟. Pachysandra型生物碱¹³C NMR谱的研究 [J]. 波谱学杂志, 1995, 12(2): 155-65.]报道该类化合物C-16上的β-OH对C-13的位移值(41.6 ± 0.2)几乎没有影响，与DSHP测得的C-13位移值(41.6)亦相吻合，从而进一步确定了16-OH的β构型，该化合物的其他手性中心的构型(C-3，8，9，10，13，14，17)根据生源及与富贵草型生物碱模式化合物的波谱数据比较而确定。

综上所述，化合物DSHP的结构确定为20α-二甲胺基-3β-二甲烯丙酰胺基-16β-羟基-孕甾-5(6)-烯，经系统文献检索，确定该化合物为新化合物。

实施例3：

化合物DSHP最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定，MIC测定方法：参照NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)和抗菌药物敏感性试验操作方法，用微量稀释法检测待测样品对受试菌株的MIC，步骤如下：

A. 菌悬液制备：取冻存于-20oC的待测菌株，划线接种于M-H琼脂平板，37oC孵箱中孵育过夜，次日用接种环挑取单克隆菌落，接种于3 mL营养肉汤中，37oC, 220 r/min, 增值至对数生长期后，用M-H肉汤将菌液稀释至0.5麦氏比浊标准，约1×108 CFU/mL，然后用M-H肉汤将上述菌悬液1:100稀释后备用，稀释后的菌液应在15 min内接种；

B. 药物的稀释及菌液接种：将化合物DSHP分别用DMSO溶解后用无菌水稀释成400μg/mL，过滤除菌，分装备用，头孢他啶用无菌碳酸钠水溶液，无水碳酸钠是所用头孢他啶的10%；

C. 加样：取无菌96孔板非边缘的6行×10列，每行分别标记为“DSHP、抗生素对照、不含药物的生长对照”，每孔分别加入100μL M-H肉汤，每行第1列孔中按照标记顺序依次加入100 μL 化合物、抗生素、M-H肉汤，用排枪充分混匀后，从每孔吸出100 μL 加入到对应的第2孔中，依次类推，2倍倍比稀释至第10列，弃去最后吸出的100 μL液体；然后每孔加入100 μL上述制备的待测菌悬液使每孔最终菌液浓度为5×10⁵ CFU/mL；在96孔板的外周，加入200 μL待测菌悬液(不含药物)作为无菌对照，注意应该同时取待测菌悬液在琼脂平板上传代培养，以检查菌液纯度；

D. 孵育和结果判断：将接种好的96孔板微量振荡器上震荡1 min，充分混匀后置于湿盒中，37oC孵箱中孵育16~20 h，对耐甲氧西林和耐万古霉素的葡萄球菌应持续孵育24 h，以肉眼观察清亮孔的最低药物浓度为此药物的MIC，同时应检查生长对照孔的细菌生长情况是否良好，无菌对照孔是否清亮，检查菌悬液的平板培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围，此测定重复3次。

MBC测定方法：MBC是指药物能使活菌生长减少99.9%或以上的最小药物浓度，其测定方法是在MIC测定方法的基础上，从肉眼观察无菌生长的孔中取10 μL接种于琼脂平板作次代培养，37oC孵育24~48 h，活菌计数法计算菌落数，平均数小于5个的药物浓度即为最低杀菌浓度。

    分别选用S. aureus ATCC 29213和E.coli ATCC 25922作为测试菌株，美国临床实验室标准协会( CLSI）规定，环丙沙星(CIP)对ATCC29213的MIC标准范围是0.25~1 μg/mL，庆大霉素（Gen）对ATCC 25922的MIC标准范围是0.25~2 μg/mL。本实验测得环丙沙星(CIP)对ATCC 292132的MIC值为0.25 μg/mL，庆大霉素（Gen）对ATCC25922的MIC值为0.5 μg/mL，见表2，均符合各自标准范围，说明本实验方法准确可靠。MIC检测结果显示，化合物DSHP对ATCC 25922基本没有抑菌活性，而对ATCC 29213显示出较好的抗菌活性，MIC值为32 μg/mL。

    本实施例还检测了DSHP对五种菌S. epidermidis ATCC 14990、MRSA、MRSE、VRSAMu50和LAC的抑菌和杀菌活性，见表2，结果显示，头孢他啶(CAZ)对VRSAMu50的MIC为64~128 μg/mL, 对MRSA和MRSE的MIC为256 μg/mL，对LAC的MIC为64 μg/mL，符合耐药菌株要求；DSHP对MRSE、MRSA和LAC的抑菌活性较高，MIC值在25 μg/mL左右；对VRSAMu50抗菌活性较弱，MIC值大于100 μg/mL。MBC实验结果提示，DSHP对MRSE的MBC值最低，为50 μg/mL，对MRSA和LAC的MBC为100 μg/mL。

表2DSHP的MIC及MBC值

实施例4：

生长曲线的测定：用接种环挑取待测菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆菌落，接种于3 mL营养肉汤中，37oC, 220 r/min, 增值至对数生长期后，用M-H肉汤将菌液稀释至0.5 麦氏比浊标准，约1×10⁸ CFU/mL（CFU为菌落形成单位），准备96孔板，分别标记为“药物高浓度组、低浓度组，头孢他啶和无药物生长对照组”，然后每孔对应加入药物和阳性对照，生长对照组加入无菌水，各管菌液的终浓度为5×10⁷ CFU/mL；37oC, 每隔1 h测OD600值，24 h后终止实验，根据OD600平均值和对应时间点绘制浓度效应关系曲线，此测定重复3次。

检测了高（100 μg/mL）、低（50 μg/mL）两个浓度DSHP对LAC和MRSE的生长抑制情况，结果如图4、5所示，DSHP对受试菌株表现出良好的浓度依赖的抑菌作用。与生长对照组相比，高浓度的DSHP可实现对受试菌株LAC的全程生长抑制，低浓度DSHP仅可实现对受试菌株前15 h的生长抑制作用，64 μg/mL头头孢他啶(CAZ)对LAC的生长曲线没有影响，见图 4。同样，与生长对照组相比，高浓度的DSHP可实现对MRSE的全程生长抑制，低浓度DSHP仅可实现前12 h的生长抑制作用，64 μg/mL头孢他啶对MRSE的生长曲线没有影响，见图 5。生长曲线结果表明DSHP体外对LAC和MRSE具有很强的抗菌活性。

杀菌曲线的测定：准备待测菌悬液，用营养肉汤稀释至0.5麦氏比浊标准备用。取无菌锥形瓶4个，分别标记为“DSHP、头孢他啶组和生长对照”，每瓶加入5 mL肉汤，再分别加入定量的待测药物，使其浓度为6倍MIC，生长对照组加入同等体积的无菌水，然后加入50 μL 待测菌悬液，每瓶菌液终浓度约为10⁶ CFU/mL；37oC分别培养0、0.5、1、2、4、6 h后，分别从每组取100 μL均匀菌悬液，10倍比连续稀释10⁰~10⁷后，用三角形涂布棒接种于M-H琼脂平板(每组接种3份)，37oC孵育过夜做菌落计数，取菌落数在30~300之间的平板做菌落计数，计算每组平均值。原菌液中每毫升的活菌数CFU = 菌落平均数×稀释倍数，根据平均CFU和对应时间绘制菌数时效关系曲线。

高低两个浓度的DSHP与LAC或MRSE共孵育，与不同时间点测定CFU计数，绘制杀菌曲线。结果显示，见图 6，DSHP可抑制LAC的生长，药物与LAC作用0.5 h后，50 μg/mL 和100 μg/mL DSHP组CFU计数从10⁶ 降低到10⁴ CFU/mL；作用4 h后，与生长对照组和头孢他啶组相比，100 μg/mL DSHP处理组CFU计数接近0，即<50 CFU/mL(P < 0.01)；而头孢他啶组与生长对照组在各时间点菌落计数无统计学差异，说明LAC对头孢他啶严重耐药，见图6。同样，DSHP可抑制MRSE的生长，见图7，药物与MRSE作用1.5 h后，50 μg/mL和100 μg/mL DSHP组CFU计数从10⁶ 降低到10⁵ CFU/mL；作用4 h后，与生长对照组和头孢他啶组相比，50 μg/mL和100 μg/mL DSHP处理组CFU计数接近10³ CFU/mL(P < 0.01)。杀菌曲线结果表明DSHP对LAC对MRSE具有良好的抗菌活性，与传统抗生素相比具有明显的优势。

实施例5：

DSHP对LAC所致BALB/c小鼠脓毒血症的治疗：BALB/c小鼠禁食12小时后随机分为六组，每组10只小鼠。除空白对照组外，每只小鼠腹腔注入含1.0×10⁹ cfu LAC 的0.4毫升MHB，构建腹膜内感染的败血症动物模型。然后，每组分别给予不同的处理：①空白对照组：腹腔注射灭菌蒸馏水(含0.01%乙酸)稀释液；②感染模型组：腹腔注射灭菌蒸馏水(含0.01%乙酸)稀释液；③氨苄西林治疗组：细菌感染后0.5 h腹腔注射氨苄西林20 mg/kg；④万古霉素治疗组：细菌感染后0.5 h腹腔注射万古霉素20 mg/kg；⑤低剂量治疗药物组：细菌感染后0.5 h腹腔注射给予治疗药物DSHP 2.5 mg/kg；⑥高剂量治疗药物组：细菌感染后0.5 h腹腔注射给予治疗药物DSHP 5 mg/kg。感染BALB/c小鼠12 h后，将肝、脾、肺和肾完整取出后，用生理盐水冲洗干净后浸泡于10％中性福尔马林缓冲液中固定48小时，组织包蜡后切片，做HE染色观察脏器损伤。

各处理组小鼠肝脏HE染色结果，见图 8，其中，8A为正常BALB/c 小鼠的肝脏HE染色，8B为LAC感染模型组，8C 为LAC感染后给予20 mg/kg氨苄西林治疗组，8D为LAC感染后给予20 mg/kg 万古霉素治疗组，8E、8F分别为LAC感染后给予2.5 mg/kg和5 mg/kg DSHP治疗组。小鼠组织的病理学观察分析表明，与正常组相比，模型组和氨苄西林组肝组织损伤严重，形成大量血栓，有炎细胞侵润，肝细胞有不同程度的变性和肿胀，枯否细胞增生，而万古霉素组亦可见肝组织的轻微损伤，并伴有炎细胞侵润；2.5 mg/kg和5 mg/kg DSHP处理组肝脏损伤程度呈剂量依赖性减轻，见图 8E、8F，其中图 8F可见到正常的肝细胞，仅有少量血栓。以上结果说明DSHP高剂量处理组治疗效果明显优于其他给药组，可显著抑制LAC对小鼠肝脏的损伤。  

图6为各处理组小鼠脾HE染色结果，相比空白对照组9A，从9B中可以观察到脾脏组织红髓区中充血较为严重，而在药物处理组9C和9D中亦可发现少量充血，在DSHP处理组9E和9F中红髓充血逐渐减小。此外，各处理组小鼠肺脏、肾脏HE染色结果显示，分别见图 10、图 11，DSHP处理组可显著保护感染小鼠的相关脏器损伤。

实施例6：

细菌透射电镜的观察：收集处于对数生长期的LAC(1.0×10⁸ cfu/mL)，取无菌摇菌试管2个，分别标记为生长对照组和DSHP处理组，处理组加入化合物DSHP (100 mg/L)，在220 rpm、37 oC摇床震荡培养，180 min后将两管细菌转移至1.5 mL 离心管内，5000 rpm离心5 min，弃去上清，经过进一步的固定、快染、脱水、渗透、包埋后，制作常规透射电镜样品超薄切片，并用醋酸铀和柠檬酸铅染色，JEM-2000EX 透射电镜观察，并记录图像。

 透射电镜结果显示，生长对照组菌体圆形的纵切面显示，菌体表面光滑，边缘整齐，胞壁结构紧密，内缘与细胞膜之间完整无空隙，细胞拟核区清晰没有明显变化，胞浆均匀分布，核糖体呈黑色颗粒散在分布，如图12A；DSHP作用180 min后，菌体形态发生显著变化，具体表现：①核固缩：细菌变性，胞质浓缩，引发核固缩，如图12B；②空泡：细胞膜与细胞壁脱离，形成明显的空隙，DNA分子呈浓缩紧张态，细胞壁有轻微的疏松、肿胀，个别细菌细胞壁完全溶解，细胞膜缺损，有胞质成分丢失，形成部分空泡结构，如图 12C；③细胞膜破损：部分细菌胞膜破损形成空洞，导致胞质成分漏出，如图 12D。透射电镜结果进一步证实了化合物DSHP对LAC有显著的抑制和杀灭作用，其作用机制可能与其可导致细菌胞膜渗透性变化，形成空泡有密切关系。

实施例7：

 DSHP的耐药性测定：

第一步，测定抗菌药物及DSHP对LAC的MIC值，方法同实施例3；

第二步，稀释上面1/2 MIC孔内的细菌，使其浓度为5×10⁵ CFU/mL，此为次代培养的细菌，再次测定抗菌药物及DSHP对LAC的MIC值，方法同上；

第三步，连续15天，每天测定一次抗菌药物及DSHP对LAC的MIC值，方法同上；

第四步，计算抗菌药物及DSHP对15代培养细菌的MIC值与第1代培养细菌的MIC的相对值。

结果如图13所示，可以看出，LAC与抗菌药物环丙沙星(CIP)、头孢曲松(CTRX)、哌拉西林(PIP)、头孢他啶(CAZ)、左旋氧氟沙星(LEV)和 DSHP共孵育，连续15代培养的MIC与第1代MIC的相对值分别为128、64、32、8、4和1。表明LAC容易对以上常用抗生素产生耐药性，而DSHP不易产生耐药。

 实施例8：

    药物的制备，注射剂配方：2 mg DSHP，50 mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0，总体积1 mL。制法：取实施例化合物DSHP 10 mg，加50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0) 5 mL，在无菌条件下完全溶解，分别经过G3和G6玻砂过滤器过滤，灌封于1 mL安瓿中，100 oC灭菌30分钟，得5支。

口服制剂配方：5 mg DSHP，50 mg甘露醇，100 mg可溶性淀粉。制法：取实施例化合物DSHP 5 mg，加50 mg甘露醇和100 mg可溶性淀粉，充分混匀后制粒，所制颗粒包装即得颗粒剂；所制颗粒装于空胶囊壳中，即得胶囊剂；所制颗粒直接压片，包薄膜衣，即得片剂；此外，还可以通过添加不同辅料如乳糖等制成散剂；也可以与聚乙二醇6000为囊材，进行包囊，制成丸剂、微囊剂和软胶囊剂等。

   外用制剂配方：5mg DSHP，硬脂酸100 g，蓖麻油 100 mg,液体石蜡100 mg，三乙醇胺8 mg ,甘油40 mg。制法：取实施例化合物DSHP 5 mg，加入硬脂酸100 g，蓖麻油100 mg,液体石蜡100 mg，三乙醇胺8 mg 和甘油40 mg，搅拌，充分乳化，可以制成膏剂；还可以通过加入其他辅料如苯甲酸和乙醇等制成酊剂和膜剂；此外，还可以加入乙醇 和二氟二氯甲烷（F₁₂ ）等，再装于特殊容器内制成气雾剂。

本实施例没有详细叙述的测试方法属本行业的公知技术和常用方法，这里不一一叙述。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

一种孕甾烷生物碱类化合物在制备抗菌药物中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。