IPC分类号 : A61K47/34,A61K47/42,A61K9/127,A61P35/00,C08G65/00,A61K31/337N
专利摘要
本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料，其结构式如下：，n＝10，12，14，16。制备方法：以脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和有机碱为原料，多肽、有机碱、脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为(1～3)：(1～3)：1；在氮气保护下，将脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、有机碱和第一溶剂混合得到第一溶液，将多肽溶于第二溶剂中得到第二溶液，将第一溶液和第二溶液混合，在避光、20～40℃条件下搅拌反应12～48小时。利用该药用材料制备出的载药脂质体能进一步提高肿瘤治疗效果，减少毒副作用且利于长时间存放。
权利要求
1.一种可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料，其特征在于该药用材料的结构式如下：
上述结构式中，n＝10，12，14，16。
2.权利要求1所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，其特征在于以脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和有机碱为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、有机碱、脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为(1～3)：(1～3)：1，所述多肽D-(KLAKLAK)2-C5的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述，工艺步骤如下：
在氮气保护下，将脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、有机碱和第一溶剂混合均匀得到第一溶液，所述第一溶剂的用量为使第一溶液中脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的浓度为100～300mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于第二溶剂中得到第二溶液，第二溶剂的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5的浓度为100～900mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、搅拌下于20～40℃反应12～48小时，反应结束后除去溶剂得到固态物质，将所得固态物质用氯仿或二甲亚砜溶解后过滤掉不溶物，收集滤液，除去滤液中的溶剂即得到可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料。
3.根据权利要求2所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺中的一种。
4.根据权利要求2或3所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述有机碱为三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙胺中的一种。
5.根据权利要求2或3所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述第一溶剂为二氯甲烷或氯仿，第二溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种。
6.根据权利要求4所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，其特征在于所述第一溶剂为二氯甲烷或氯仿，第二溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种。
7.权利要求1所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料在制备载药脂质体中的应用。
说明书
技术领域
本发明属于药物及其制备技术领域，具体涉及一种磷脂药用材料及其制备方法与应用。
背景技术
化疗是治疗癌症的主要手段之一，但目前癌症患者化疗后的死亡率仍然居高不下。多药耐药(multidrugresistance，MDR)是临床上化疗失败的主要原因之一。肿瘤细胞的耐药性分为先天性与后天获得性两大类。研究表明，肿瘤细胞基因或基因表型发生变化引起细胞凋亡通路改变，最终导致肿瘤先天耐药性的出现。线粒体是细胞的“动力工厂”，同时也是“自杀武器库”，能启动细胞凋亡通路，因而肿瘤细胞先天性耐药与线粒体功能异常密切相关。以线粒体作为抗癌药物传递系统的靶点，将传统化疗药物递送到线粒体、促使线粒体启动凋亡通路，释放细胞色素C，激活caspase9/3，从而实现肿瘤细胞“自杀”式死亡，这将是克服肿瘤先天性耐药性，提高肿瘤治疗效果的一种有效手段。将抗癌药物递送到肿瘤细胞线粒体过程中，需要面临多重生理屏障，包括穿透血管进入肿瘤间隙的血管屏障、穿透肿瘤细胞外基质和肿瘤细胞膜的质膜屏障以及线粒体膜屏障。线粒体靶向治疗取得成功的关键在于将药物递送到肿瘤细胞线粒体，避免在跨越生理屏障时药物递送系统解体，药物脱靶。
现有技术报道了二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)与3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯反应合成二硬脂酰磷脂酰乙醇胺马来酰亚胺(DSPE-mal)，DSPE-mal再与D-(KLAKLAK)2-C反应得到DSPE-(KLAKLAK)2，DSPE-(KLAKLAK)2与二甲基马来酸酐通过酰胺化反应生成一种具有线粒体靶向和pH响应双重功能的新型改性磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-(KLAKLAK)2-二甲基马来酰亚胺(DSPE-KLA-DMA，缩写DKD)，将DKD与大豆磷脂、胆固醇、抗癌药物紫杉醇混合，采用薄膜分散法制备出载药纳米DKD脂质体，并证实了该脂质体具有降低非特异性蛋白吸附以及线粒体靶向递送药物功能，能促使线粒体凋亡途径启动，在一定程度上能克服肿瘤先天性耐药性，提高肿瘤治疗效果(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)。但DKD还存在以下不足：1)DKD不具有长循环功能，导致制备出的DKD脂质体在血管内清除快，不利于抗癌药物跨越血管屏障递送药物；2)利用DKD制备出的载药纳米脂质体是由分子通过非共价键力组装形成的纳米聚集体，在血液循环以及跨膜过程中不稳定，容易解体，导致药物在达到靶点前提前释放，达不到治疗效果，而且药物脱靶后进入正常组织极易造成严重的毒副作用；3)由于DKD的分子结构中不具有亲水保护层，制备出的DKD脂质体放置一段时间后容易产生团聚，粒径变大，不利于脂质体从血管进入组织，从而降低肿瘤组织靶向性，同时存在堵塞毛细血管等安全隐患。因此DKD脂质体的长期稳定性不好，不利于长期存放。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料及其制备方法与应用，该药用材料具有良好的长循环功能、可交联性及线粒体靶向性，利用该药用材料制备出的载药脂质体在血液循环和跨膜过程中具有更好的稳定性，并具有更好的肿瘤组织靶向性、更大的细胞摄取量和线粒体靶向性，从而能进一步提高肿瘤治疗效果，同时降低毒副作用，并能长期存放。
本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料，其结构式如下：
上述结构式中，n＝10，12，14，16。
本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，以脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和有机碱为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、有机碱、脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为(1～3)：(1～3)：1，所述多肽D-(KLAKLAK)2-C5的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述，工艺步骤如下：
在氮气保护下，将脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、有机碱和第一溶剂混合均匀得到第一溶液，所述第一溶剂的用量为使第一溶液中脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的浓度为100～300mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于第二溶剂中得到第二溶液，第二溶剂的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5的浓度为100～900mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、搅拌下于20～40℃反应12～48小时，反应结束后除去溶剂得到固态物质，将所得固态物质用氯仿或二甲亚砜溶解后过滤掉不溶物，收集滤液，除去滤液中的溶剂即得到可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料。
上述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，所述脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺中的一种。
上述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，所述有机碱为三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者N、N-二异丙基乙胺中的任一种。
上述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法，所述第一溶剂为二氯甲烷或氯仿，第二溶剂甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的任一种。
本发明还提供了上述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料在制备载药脂质体中的应用，所述药用材料可与抗癌药物、磷脂、胆固醇混合制得脂质体，抗癌药物为阿霉素、紫杉醇等。所述脂质体在制备好后可在加入乙二硫醇和通氧气条件下以共价键的形式形成二硫键交联结构，以提高载药脂质体在血液循环和跨膜过程中的稳定性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明为抗肿瘤载药脂质体的制备提供了一种新的药用材料。
2、本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料由于具有聚乙二醇链段，能延长体内循环时间，并以多肽D-(KLAKLAK)2-C5为线粒体靶向分子，且具有可交联结构巯基，因此具有良好的长循环功能、可交联性和线粒体靶向性。
3、本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料由于具有可交联结构，利用该药用材料制备的载药脂质体在加入乙二硫醇和通氧气条件下以共价键的形式形成二硫键交联结构，在血液循环中具有良好的稳定性，能避免脂质体解体导致药物提前释放，同时具良好更好的肿瘤组织、线粒体靶向能力，因此对正常组织的毒副作用很小。
4、利用该药用材料制备出的载药脂质体在体内具有更长的循环时间(见长循环实验)，药用材料的可交联性使得载药脂质体在加入1,2-乙二硫醇并通氧气条件下以共价键的形式形成二硫键交联结构，进入人体后在血液中具有良好的稳定性，药物释放极缓慢(见体外释放实验)，有利于脂质体跨越血管屏障递送药物，同时由于肿瘤血管壁上皮细胞间隙比正常血管壁的上皮细胞间隙大，稳定的载药脂质体在体内的循环时间长有利于载药脂质体从肿瘤血管渗出，通过增强渗透与滞留效应(EPR效应)使更多的载药脂质体进入肿瘤组织，因此具有更好的肿瘤组织靶向性(见肿瘤组织靶向性比较实验)；载药脂质体进入肿瘤组织间隙后，由于该载药脂质体zeta电位为正，更容易通过静电作用吸引显负电荷的肿瘤细胞摄取，加之载药脂质体具有以二硫键形成的交联结构，具有良好的稳定性，能避免脂质体解体，避免药物提前释放，能顺利穿透肿瘤细胞外基质和肿瘤细胞膜的质膜屏障，将药物递送至肿瘤细胞内；载药脂质体进入肿瘤细胞后，因肿瘤细胞内的谷胱甘肽浓度高于血液和组织间隙，脂质体因二硫键形成的交联结构在谷胱甘肽还原作用下断裂，有利于脂质体进入线粒体后药物释放，加之线粒体摄取量大(见线粒摄取试验)，有更多的药物释放到线粒体中。综上所述，利用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的载药脂质体具有更好的肿瘤组织靶向性、更大的细胞摄取量、更好的线粒体靶向性，药物到达线粒体后才开始大量释放，从而更能有效启动肿瘤细胞自杀式死亡，克服肿瘤细胞的先天耐药性，进一步提高耐药肿瘤治疗效果(见肿瘤治疗效果对比实验)。
5、利用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的载药脂质体，由于其聚乙二醇链段可在脂质体的双分子层外形成亲水层，通过空间位阻效应阻碍脂质体团聚，避免粒径变大，从而维持脂质体粒径的稳定性，其稳定性优于DKD脂质体(见稳定性比较实验)，从而利于长期存放，保障存放后使用的肿瘤组织靶向性和使用安全性。
6、本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备方法操作简单，工艺条件温和，采用常规设备即可实现。
附图说明
图1是实施例1制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的质谱图。
图2是实施例1制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的氢核磁谱图。
图3是实施例1～4制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的细胞毒性测试结果。
图4为载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体与载紫杉醇的DKD脂质体体外药物释放实验结果图。
图5为注射载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体与载紫杉醇的DKD脂质体的荷瘤小鼠肿瘤体积变化曲线(**表示P<0.01)。
图6为交联线粒体靶向荧光脂质体和DKD荧光脂质体中的荧光分子在小鼠组织和肿瘤中的分布图(其中图A为交联线粒体靶向荧光脂质体组，图B为DKD荧光脂质体组)。
图7为交联线粒体靶向荧光脂质体和DKD荧光脂质体的细胞摄取实验结果图。
图8为交联线粒体靶向荧光脂质体和DKD荧光脂质体的线粒体摄取实验结果图。
图9载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体结构示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料及其制备方法与应用做进一步说明。
以下实施例中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DSPE-PEG2000-Mal)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DMPE-PEG2000-Mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DPPE-PEG2000-Mal)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DLPE-PEG2000-Mal)购自美国Nanocs公司。D-(KLAKLAK)2-C5多肽购自中科亚光科技有限公司。紫杉醇购自大连美仑生物技术有限公司。蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂、胆固醇购自西安瑞禧生物科技有限公司。
实施例1
本实施例所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-KLA)，其结构式为：
制备方法如下：
以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和三乙胺为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、三乙胺、DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为1:1:1；
在氮气保护下，将DSPE-PEG2000-Mal、三乙胺和氯仿混合均匀得到第一溶液，所述氯仿的用量为使第一溶液中DSPE-PEG2000-Mal的浓度为100mmol/L，三乙胺的浓度为100mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于甲醇中得到第二溶液，甲醇的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为100mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、20℃条件下搅拌反应48小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用氯仿溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DSPE-PEG2000-KLA，其质谱图见图1，氢核磁谱图见图2。
实施例2
本实施例所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG2000-KLA)，其结构式为：
制备方法如下：
以二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DMPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和4-二甲氨基吡啶为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、4-二甲氨基吡啶、DMPE-PEG2000-Mal的摩尔比为2:2:1；
在氮气保护下，将DMPE-PEG2000-Mal、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷混合均匀得到第一溶液，二氯甲烷的用量为使第一溶液中DMPE-PEG2000-Mal的浓度为200mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为400mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于N，N-二甲基甲酰胺中得到第二溶液，N，N-二甲基甲酰胺的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为400mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、40℃条件下搅拌反应24小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用二甲亚砜溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DMPE-PEG2000-KLA。
实施例3
本实施例所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-PEG2000-KLA)，其结构式为：
制备方法如下：
以二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DPPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和N，N-二异丙基乙胺为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、N，N-二异丙基乙胺、DPPE-PEG2000-Mal的摩尔比为3:3:1；
在氮气保护下，将DPPE-PEG2000-Mal、N，N-二异丙基乙胺、二氯甲烷混合均匀得到第一溶液，所述二氯甲烷的用量为使第一溶液中DPPE-PEG2000-Mal的浓度为300mmol/L，N，N-二异丙基乙胺的浓度为900mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于N，N-二甲基甲酰胺中得到第二溶液，N，N-二甲基甲酰胺的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为900mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、25℃条件下搅拌反应12小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用二甲亚砜溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DPPE-PEG2000-KLA。
实施例4
本实施例所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE-PEG2000-KLA)，其结构式为：
制备方法如下：
以二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DLPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和三乙胺为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、三乙胺、DLPE-PEG2000-Mal的摩尔比为3:3:1；
在氮气保护下，将DLPE-PEG2000-Mal、三乙胺、氯仿混合均匀得到第一溶液，所述氯仿的用量为使第一溶液中DLPE-PEG2000-Mal的浓度为100mmol/L，三乙胺的浓度为300mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于甲醇中得到第二溶液，甲醇的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为100mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、20℃条件下搅拌反应48小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用氯仿溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DLPE-PEG2000-KLA。
实施例5：材料细胞毒性实验
将密度为1×105个/mL的L929细胞(购自中国科学院细胞库)悬液接种于96孔培养板内，每孔接种0.1mL，并向每孔加入0.1mL完全培养基(DMEM培养基+10％胎牛血清+100g/mL链霉素)，然后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。分别将实施例1～4所制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料用完全培养基稀释作为试验组，终浓度分别为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.30mg/mL、1.0mg/mL。以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，培养48h后弃去每孔中的上清液，用PBS缓冲液(135mMNaCl，2.7mMKCl，1.5mMKH2PO4,，8mMK2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200LPBS缓冲液，再加入20L5mg/mL的MTT溶液(将0.5gMTT溶于100mLPBS缓冲液中得到)，继续培养4h，继后吸尽上清液，加入100L二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定波长为570nm处的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的细胞存活率。
细胞毒性试验结果见图3，从图中可以看出，实施例1～4制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料均无明显细胞毒性。
实施例6：长循环实验
将大豆磷脂、胆固醇、实施例1制备的DSPE-PEG2000-KLA和紫杉醇溶于氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，其中大豆磷脂、胆固醇和DSPE-PEG-KLA摩尔比为90:7:3，紫杉醇与大豆磷脂的质量比为1:10，所述混合溶剂量的量为使大豆磷脂摩尔浓度为0.1mmol/L。减压旋转蒸发除去溶剂，得到干燥的脂膜。向所得脂膜中加入磷酸盐缓冲液(PBS)，所述PBS的量使大豆磷脂的摩尔浓度为1mM。然后置于50℃水浴中超声15min，继以探头超声5min，得到脂质体悬液。向脂质体悬液中加入DSPE-PEG2000-KLA二倍摩尔的乙二硫醇，并持续通氧气10分钟，再以3500r/min的转速离心3min以除去游离的紫杉醇，所得上清液即为载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体，结构见图9。
将大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-MAL和紫杉醇溶于氯仿-甲醇混合溶剂中(氯仿与甲醇的体积比为3:1)，其中大豆磷脂、胆固醇和DSPE-PEG-MAL摩尔分数比为90:7:3，紫杉醇与脂质材料的质量分数比为1:10，其余制备方法同上，得到普通紫杉醇脂质体。
将12只Wistar大鼠(购自四川大学动物实验中心)随机分为两组，每组分别尾静脉注射载紫杉醇的线粒体靶向脂质体和普通紫杉醇脂质体，给药剂量为5mg/kg。分别于尾静脉注射给药后的5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h通过尾静脉取血。采用高效液相法检测药物浓度，采用DAS药动学软件计算药物生物半衰期(t1/2)。载紫杉醇的线粒体靶向脂质体的t1/2为22.5h，普通紫杉醇脂质体的t1/2为1.2h，可见本利用发明所述线粒体靶向聚乙二醇化脂质药用材料制备的载药脂质体具有长循环的特点。
实施例7：对比实验
将背景技术中引用文献的DKD脂质体与利用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的脂质体做以下对比。
1、体外药物释放对比实验
按照实施例6中的方法制备载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体。
按照背景技术的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中2.3节所述方法制备载紫杉醇DKD脂质体。
取载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体和DKD脂质体各0.5ml，分别与等量牛血清混合，每种脂质体重复一组，共四组，再分别装入截留分子量为6000～7000的透析袋中，将一个装有交联线粒体靶向脂质体的透析袋和一个装有DKD脂质体的透析袋分别浸入50ml含0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液中，剩下的两个透析袋分别浸入50ml含10mmoL/L谷胱甘肽(GSH)和0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液中，37℃恒温振荡。于0.5、1、2、4、6、12、18、24小时后取透析介质1ml，同时补充1ml新鲜的释放介质。按照背景技术文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中2.14节所述高效液相色谱法测定药物释放介质中的药物浓度，计算药物累计释放量，结果见图4。
从图4可知，载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体在血清中更稳定，药物释放缓慢，加入GSH后脂质体的二硫键断裂，交联结构破坏后，药物释放加快。而DKD脂质体在血清中稳定性更差，药物释放较快，且不受GSH浓度影响。
2、肿瘤治疗效果对比实验
按照实施例6的方法制备载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中2.3节所述方法制备载紫杉醇DKD脂质体。
按照文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中2.12体内肿瘤治疗实验方法，对制备的两种载药脂质体进行体内抗肿瘤效果评价，结果见图5。
从图5可知，采用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的交联线粒体靶向脂质体能明显减小肿瘤体积，在第25天部分荷瘤裸鼠肿瘤消失，而注射载紫杉醇的DKD脂质体的荷瘤裸鼠的肿瘤体积为治疗前的1.4倍，肿瘤体积有轻微增加。可见采用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体具有更好的肿瘤治疗效果。
3、肿瘤组织靶向性比较
按照实施例6中的方法，将紫杉醇更换为DiR，制备交联线粒体靶向荧光脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)的第127页2.3节所述方法，将荧光分子DiL更换为DiR制备DKD荧光脂质体。
对18～20gBALB/c裸鼠皮下接种1×106个耐药人肺癌细胞，接种2周后，将裸鼠分为两组，每组3只，各组分别尾静脉注射线粒体靶向荧光脂质体和DKD荧光脂质体。6小时后，各组裸鼠腹腔注射水合氯醛注射液，待裸鼠麻醉后置于小动物活体成像仪中观察荧光分子DiR在小鼠体内的分布情况，结果如图6所示。
从图6可知，注射交联线粒体靶向荧光脂质体的裸鼠的肿瘤部位荧光强度更高，说明其具有更强的肿瘤组织靶向性。
4、细胞摄取量比较
按照实施例6中的方法，将紫杉醇更换为DiL，制备交联线粒体靶向荧光脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)的第127页2.3节所述方法制备DKD荧光脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中第128页2.7节所述细胞摄取实验方法检测耐药肺癌细胞A549对制备的两种脂质体的摄取情况，结果见图7。
从图7可知，耐药肺癌细胞A549对采用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的交联线粒体靶向荧光脂质体的摄取量显著高于DKD荧光脂质体。
5、线粒体摄取量对比实验
按照实施例6中的方法，将紫杉醇更换为DiL，制备交联线粒体靶向荧光脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)的第127页2.3节所述方法制备DKD荧光脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中第128页2.10.2节所述线粒体摄取实验方法检测分离的耐药肺癌细胞A549线粒体对制备的两种脂质体的摄取情况，结果见图8。
从图8可知，分离耐药肺癌细胞A549线粒体对采用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的交联线粒体靶向荧光脂质体的摄取量显著高于DKD荧光脂质体。
6、稳定性比较
按照实施例6中的方法制备载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体。
按照背景技术中的文章(L.Jiangetal.Biomaterials52(2015)126-139)中第127页2.3节所述方法制备载紫杉醇的DKD脂质体。
将制备的两种载药脂质体于4℃冷藏静置储存2周，分别于储存前、储存1周、2周取两种脂质体溶液采用激光动态光散射仪检测脂质体粒径变化。检测结果见表1。
从表1可知，载紫杉醇DKD脂质体粒径变得很大，采用本发明所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制备的载紫杉醇的交联线粒体靶向脂质体的粒径几乎无变化，因而具有更好的稳定性，利于长期存放。
可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料及其制备方法与应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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