专利摘要

本发明属于培养基技术领域，公开了一种诱导辣椒疫霉菌快速产生大量游动孢子囊的培养基、制备方法及应用。所述培养基以橙子汁为主要原料，pH值适宜，营养丰富，包括多种无机及有机营养物，如糖类、蛋白质及维生素B1、维生素C等，提供了辣椒疫霉菌生长所需的各类营养物质，更有利于辣椒疫霉菌孢子囊的形成。利用该培养基，短期内即可诱导大量的游动孢子囊，试验证明：24h内每平方厘米的菌丝块产生的游动孢子囊数量高达3.19万，既解决了一般固体培养基很难产生大量孢子囊的问题，又避免了利用水培法诱导产生游动孢子囊容易被污染的难题。

权利要求

1.应用诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊的方法，其特征在于，

所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基以橙子汁为碳源，每升所述培养基中含有橙子汁25～75 mL；所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基的制备方法，包括如下步骤：在所述橙子汁中加入琼脂，加水定容，混合后灭菌，即得所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基；

诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊的方法，包括如下步骤：

（1）将辣椒疫霉菌菌丝块接种于所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基上，置于25～28℃黑暗培养，直至菌丝长满培养基；

（2）将步骤（1）的培养基体系置于光照度为1600～2400 lx下连续光照培养1～2天即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）置于26℃黑暗培养5天。

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）置于光照度为2000 lx下连续光照培养1～2天。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每升所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基还含有琼脂15～20 g。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基的pH为5.5～6.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭菌具体为：在120～125℃、0.10～0.12MPa下灭菌15～25min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基的制备方法中，加入所述琼脂前还包括对所述橙子汁进行过滤处理。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过滤采用双层纱布过滤。

说明书

技术领域

本发明属于培养基技术领域，涉及一种诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基，更具体地，涉及一种诱导辣椒疫霉菌快速产生大量游动孢子囊的培养基、制备方法及应用。

背景技术

辣椒疫病(Phytophthora capsici)是一种世界范围内的毁灭性病害，其是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)侵染引起的。辣椒疫霉菌属植物病原卵菌，其病原菌通常以卵孢子和厚垣孢子在病株残体上、土壤中和种子上越冬，成为来年病害发生的初侵染源头，发病后病部产生孢子囊，孢子囊借助风、雨、灌水及其他农事活动进行再侵染，造成病害的蔓延和危害。除危害辣椒外，辣椒疫霉菌还侵染番茄、茄子、黄瓜、西瓜、南瓜等20多种重要蔬菜作物。该病害自1918年首次在美国新墨西哥发现起，现已在全世界范围内发生，并有逐年加重的趋势，严重影响了蔬菜种植业的经济效益，给蔬菜的安全生产造成了巨大的经济损失。因此，如何有效地对辣椒疫病进行综合管理并最大化降低其造成的经济损失是亟待解决的技术问题。

研究并明确辣椒疫病发生流行规律是制定病害综合管理措施的前提条件，研究病害流行规律需借助病原菌人工接种技术，而通过分离纯化获得目标病原菌的纯培养，再由纯培养获得大量的人工接种体是人工接种的第一步。在辣椒疫病的研究中，人工接种体是游动孢子，传统获得游动孢子的方法是获得孢子囊，再通过刺激孢子囊释放游动孢子，从而获得最终的接种体。辣椒疫霉菌产生孢子囊的常规方法是利用固体培养基如马铃薯琼脂培养基、玉米粉培养基、胡萝卜培养基、燕麦培养基等通过一定时间的光照培养，或将菌丝块加到无菌水内诱导产生孢子囊的水培法，前者产孢时间长且很难得到大量孢子囊，后者虽然能快速获得大量游动孢子囊，但操作步骤繁琐，且操作过程中易被其他杂菌污染。

发明内容

因此，本发明旨在提供一种能快速高效诱导辣椒疫霉菌产生大量游动孢子囊的培养基。

为此，本发明提供了一种诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基，所述培养基以橙子汁为碳源，每升所述培养基中含有橙子汁25～75mL。

进一步地，每升所述培养基还含有琼脂15～20g。

进一步地，所述培养基的pH为5.5～6.5。

本发明还提供了一种上述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基的制备方法，，包括如下步骤：

在所述橙子汁中加入所述琼脂，加水定容，混合后灭菌，即得所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基。

进一步地，所述灭菌具体为：在120～125℃、0.10～0.12MPa下灭菌15～25min。

进一步地，加入所述琼脂前还包括对所述橙子汁进行过滤处理。

更进一步地，所述过滤采用双层纱布过滤。

上述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基或根据上述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基的制备方法得到的诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊的方法，包括如下步骤：

(1)将辣椒疫霉菌菌丝块接种于所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基上，置于25～28℃黑暗培养，直至菌丝长满培养基；

(2)将步骤(1)的培养基体系置于光照度为1600～2400lx下连续光照培养1～2天即可。

进一步地，所述步骤(1)置于26℃黑暗培养5天。

进一步地，所述步骤(2)置于光照度为2000lx下连续光照培养1～2天。

本发明的技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基，以橙子汁为主要原料，pH值适宜，营养丰富，包括多种无机及有机营养物，如糖类、蛋白质及维生素B1、维生素C等，提供了辣椒疫霉菌生长所需的各类营养物质，更有利于辣椒疫霉菌孢子囊的形成。利用该培养基，短期内即可诱导大量的游动孢子囊，试验证明：24h内每平方厘米的菌丝块产生的游动孢子囊数量高达3.19万，既解决了一般固体培养基很难产生大量孢子囊的问题，又避免了利用水培法诱导产生游动孢子囊容易被污染的难题。

采用橙子汁为主要原料，取材容易、成本低、操作简便，便于大规模推广应用，具有非常高的实际应用价值。

2.本发明提供的诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基的制备方法，对培养基进行过滤灭菌，大大减少了培养基被污染的机会。培养基制备过程简单，重复性好，效果稳定，对于开展辣椒疫病的研究具有重要意义。

3.采用本发明的诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基诱导孢子囊的方法简单，充分的光照处理即可诱导产生大量的游动孢子囊，较传统培养诱导方法相比，诱导周期大大减短。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是辣椒疫霉菌普通菌株在本发明实施例2的培养基上于2000lx光照下培养48小时产生孢子囊的结果图；

图2是辣椒疫霉菌普通菌株在CA培养基上于2000lx光照下培养48小时产生孢子囊的结果图；

图3是辣椒疫霉菌普通菌株OA培养基上于2000lx光照下培养48小时产生孢子囊的结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

以下实施例中，辣椒疫霉菌菌株为普通菌株，从田间病组织中分离得到；

实验操作所需的培养皿、PDA培养基、OA培养基、CA培养基、RA培养基、打孔器、灭菌锅、蒸馏水、去离子水、培养箱等均为实验室常规工具或材料。

实施例1

本实施例提供了一种诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有25mL橙子汁和15g琼脂粉。其制备方法具体为：取若干普通甜橙，去皮，切成小块，榨汁，量取25mL橙子汁，用双层纱布过滤，所得滤液中加入15g琼脂粉，加蒸馏水定容至1L，用玻棒充分搅匀。根据需要分装后置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.103MPa、121℃下灭菌20min，取出倒入已灭菌的直径为9cm培养皿中，制得所述诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基。

实施例2

本实施例提供了一种诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有50mL橙子汁和15g琼脂粉。其制备方法同实施例1。

实施例3

本实施例提供了一种诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有75mL橙子汁和15g琼脂粉。其制备方法同实施例1。

对比例1

本对比例提供了一种马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有200g去皮马铃薯、20g葡萄糖及15g琼脂粉。其制备方法具体为：称取200g去皮马铃薯，切成小块后放入1000mL蒸馏水中煮沸30min后过滤，所得滤液中加入20g葡萄糖、15g琼脂粉，用玻棒充分搅匀后定容至1L。根据需要分装后置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.103MPa、121℃下灭菌20min，取出倒入已灭菌的直径为9cm培养皿中，制得所述PDA培养基。

对比例2

本对比例提供了一种燕麦(OA)培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有30g燕麦片和15g琼脂粉。其制备方法具体为：称取30g燕麦片，放入1000mL蒸馏水中，60℃下水浴加热1h后过滤，所得滤液中加入15g琼脂粉，用玻棒充分搅匀后定容至1L。根据需要分装后置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.103MPa、121℃下灭菌20min，取出倒入已灭菌的直径为9cm培养皿中，制得所述OA培养基。

对比例3

本对比例提供了一种胡萝卜(CA)培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有200g胡萝卜和15g琼脂粉。其制备方法具体为：称取200g胡萝卜，切成小块后放入1000mL蒸馏水中煮沸30min后过滤，所得滤液中加入15g琼脂粉，用玻棒充分搅匀后定容至1L。根据需要分装后置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.103MPa、121℃下灭菌20min，取出倒入已灭菌的直径为9cm培养皿中，制得所述CA培养基。

对比例4

本对比例提供了一种黑麦(RA)培养基，其具体成分为：每1L培养基中含有50g黑麦种子和15g琼脂粉。其制备方法具体为：称取50g黑麦种子，在1000mL去离子水中浸泡24～36h后，置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min后过滤，所得滤液中加入15g琼脂粉，用玻棒充分搅匀后定容至1L。根据需要分装后置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.103MPa、121℃下灭菌20min，取出倒入已灭菌的直径为9cm培养皿中，制得所述RA培养基。

实验例1

在超净工作台上，将辣椒疫霉菌菌株接种到PDA培养基上，27℃黑暗培养4d。用直径为6cm的打孔器在菌落边缘处打孔，取7块菌丝块分别置于不同的平板培养基中央，26℃黑暗培养5d，然后置于光照度为2000lx的光照培养箱中连续培养。24h、48h后观察各培养基上孢子囊的产生情况并计数。计数方法为：用直径6cm打孔器在平板培养基上随机打取5个菌丝块置于无菌培养皿内，向其中加入30mL蒸馏水，用消毒毛笔刷轻轻刷洗菌丝块表面，使得游动孢子囊脱落在水里；然后用双层纱布过滤去菌丝体，得到滤液，吸取15μL滤液置于载玻片上，并在显微镜下观察并记录游动孢子囊的数量。根据菌丝块面积求出每平方厘米菌丝块上游动孢子囊的数量，每个样本重复观察3次，每种培养基随机取3个平板样本进行检测，最终求平均值作为该培养基上辣椒疫霉菌菌株的平均产孢量，结果如表1所示。

表1游动孢子囊的数量及差异显著性

其中：差异显著性为辣椒疫霉菌在各培养基培养48小时后游动孢子囊的产生量，小写字母表示5％水平的显著水平，大写字母表示1％水平的显著水平，不同字母表示存在显著差异。

从上表1中可以看出，辣椒疫霉菌在本发明的辣椒疫霉菌产孢培养基上的产孢量在1％和5％水平均显著高于PDA培养基、OA培养基、CA培养基和RA培养基，且本发明的辣椒疫霉菌产孢培养基诱导产孢速度较快，24h即可产生大量孢子囊，可满足快速接种试验的需要。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

一种诱导辣椒疫霉菌产孢的培养基、制备方法及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。