专利摘要

本发明公开了一种含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集和检测方法。首先以硅胶作填充剂填充固相萃取柱对植物水培液进行萃取吸附根系代谢物，然后取出填充硅胶加到硅胶层析柱上层进行柱层析分离，再以石油醚、乙酸乙酯、乙醇、氯仿作洗脱剂，以不同组合配比进行洗脱，按洗脱液组分收集洗脱液，旋蒸浓缩，利用气质联用（GC‑MS）技术对分离组分进行分析。本发明实现了两种植物水培根系分泌物中化感物质的大量分离富集和检测。结果从喜树水培根系和蛇根草水培根系分泌物中共分离得到25种化感物质。本发明对探明更多的水培体系中的化感物质具有非常重要的技术指导作用，基于本发明将可以实现对化感物质中有自毒作用的物质及时进行清除，保证植物的生长不会被抑制，促使植物旺盛生长，对优化植物水培体系具有重要意义。

权利要求

1.一种含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将收集的水培液除去杂质，以硅胶作为填充料，利用SPE固相萃取，富集水培液至吸附平衡，富集完毕后收集含根系分泌物的硅胶，烘干得含浓缩粗品的硅胶粉；

S2.取经烘干前处理的硅胶，加入石油醚，匀浆法装柱，用石油醚冲洗层析柱；

S3.取步骤S1所得含浓缩粗品的硅胶粉，用石油醚稀释混匀，加入步骤S2准备的层析柱中，重复上述操作使柱体充分密实，然后在样品硅胶上加柱层析硅胶；

S4.配制不同比例的洗脱液进行梯度洗脱，流出液分段收集；

其中，步骤S1所述水培液分别是喜树水培的分泌液或蛇根草水培的分泌液；

步骤S4所述的洗脱液，喜树水培的分泌液所用的洗脱液为石油醚、乙酸乙酯、乙醇的混合物，石油醚：乙酸乙酯体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9，乙酸乙酯：乙醇体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4；蛇根草水培的分泌液所用的洗脱液为石油醚、乙醇、乙酸乙酯和氯仿的混合物，石油醚：乙酸乙酯体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9，乙醇：氯仿体积比为0:1、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7；3、8:2、9:1、1:0；从喜树水培的分泌液中分离富集的化感物质分别是环庚三烯酮、4-氧代-7,7-二硝基-4,5,6,7-四氢-2H-苯并三唑、二苯铬、1,1,2,2-四氯乙烷、2,4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸二异丁酯、N-甲基苯胺、苯胺和N,N-二甲基苯胺；从蛇根草水培的分泌液中分离富集的化感物质分别是1,1,2,2-四氯乙烷、N,N-二甲基苯胺、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯苯硒酚、二苯铬、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、2,4-二叔丁基苯酚、9-亚甲基-9H-芴、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、3-甲基邻苯二酚、十六酸甲酯、2,2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、十二烷基乙二醇。

2.根据权利要求1所述含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，步骤S1所述水培液，分别是喜树水培60天后的分泌液或蛇根草水培45天后的分泌液。

3.根据权利要求1所述含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，步骤S2所述硅胶的粒径为200～300目。

4.根据权利要求1所述含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，步骤S4所述匀浆法装柱的高度为30cm；所述用石油醚冲洗层析柱是使用3～4倍柱体积石油醚冲洗层析柱。

5.根据权利要求1所述含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，步骤S4所述流出液分段收集是一共分81段样品收集，其中第1～72号样品每50mL收集一次流出液，第73～81号样品每100mL收集一次。

6.根据权利要求1至5任一项所述含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，还包括将步骤S4收集到的流出液旋转蒸发至干，加入乙腈，溶解，有机相滤膜过滤后进行色谱分析的步骤。

7.根据权利要求6所述含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，其特征在于，所述旋转蒸发至干是在45℃下旋转蒸发至干；所述有机相滤膜过滤是用0.22μm有机相滤膜过滤；

所述色谱分析是利用GC-MS进行分析鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物的分离制备技术领域，更具体地，涉及一种含喜树碱植物水培根系化感物质的分离与鉴定的技术。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)是从喜树中发现的一种重要抗癌活性生物碱，后来在蛇根草类植物中也发现一定含量。它是迄今发现的唯一通过抑制拓扑异构酶发挥细胞毒性的天然活性成分。市场对喜树碱类抗癌药物的需求非常大，而大规模化学全合成和体外生物合成的难度较大，大量采集喜树等植物资源提取喜树碱，是目前获得喜树碱的重要途径。然而，长期盲目采集会致使生态环境的破坏，以及植物资源的浪费，不符合当今环保要求。当前利用生物合成手段是连续生产植物次生代谢物新的途径。毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，某些产物的产量甚至高于正常植物，国内外现已成功地培养出喜树、青蒿、南美蟛蜞菊等药用植物的毛状根。人参皂甙、黄连素等已通过毛状根培养得以工业化生产。贾黎明等利用循环水根系分泌物收集装置成功在栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准确收集根系分泌物，在7天时间收集到根系分泌物中的多种氨基酸，并达到可检出的量。

本申请人成功建立了喜树和广州蛇根草等含喜树碱类植物水培体系，并分析确认这些水培体系根系分泌物中含有喜树碱和金丝桃苷等活性代谢产物。然而根系分泌物中除了具有药用价值的活性次生代谢成分外，也可能存在一些具有不同活性功能的化感物质，包括具有杀虫活性、抑菌活性、除草活性、自毒作用等的化感物质。其中，部分化感物质对植物的生长抑制作用给生产带来一定的负面影响，比如根系分泌物中化感物质引发药用植物的连作障碍，化感物中的酚酸类化合物能影响水稻等植物的代谢途径，产生自毒现象从而阻碍生长。因此，植物水培根系分泌中的这部分化感物质长期积累对植物生长具有抑制作用，探明水培体系中的更多的化感物质，对其中有自毒作用的物质及时进行清除，保证植物的生长不会被抑制，旺盛生长对优化植物水培体系具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有水培体系中的化感物质研究技术不足，提供一种含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法。

本发明要解决的另一技术问题是提供所述分离富集得到的化感物质的检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法，包括以下步骤：

S1.将收集的水培液除去杂质，以硅胶作为填充料，利用SPE固相萃取，富集水培液至吸附平衡，富集完毕后收集含根系分泌物的硅胶，烘干得含浓缩粗品的硅胶粉；

S2.取经烘干前处理的硅胶，加入石油醚，匀浆法装柱，用石油醚冲洗层析柱；

S3.取步骤S1所得含浓缩粗品的硅胶粉，用石油醚稀释混匀，加入步骤S2准备的层析柱中，重复上述操作使柱体充分密实，然后在样品硅胶上加柱层析硅胶；

S4.配制不同比例的洗脱液进行梯度洗脱，流出液分段收集；

其中，所述含喜树碱植物为喜树或蛇根草；步骤S1所述水培液分别是喜树水培的分泌液或蛇根草水培的分泌液；

步骤S4所述的洗脱液，喜树水培的分泌液所用的洗脱液为石油醚、乙酸乙酯、乙醇的混合物；蛇根草水培的分泌液所用的洗脱液为石油醚、乙醇、乙酸乙酯和氯仿的混合物。

本发明设计了一条新的分离富集路线，将含喜树碱植物的根系分泌物水培液先用硅胶做固相萃取填充剂吸附根系分泌物，取出吸附剂，不用溶剂洗脱就直接加到硅胶层析柱进行洗脱，旋转蒸发，不仅操作简单，获得的分离富集效果更佳。

优选地，步骤S1所述水培液，分别是喜树水培60天后的分泌液或蛇根草水培45天后的分泌液。

优选地，步骤S1所述批量富集水培液至吸附平衡后更换硅胶。所述烘干是在45℃烘干，4℃保存备用。

优选地，步骤S2所述硅胶的粒径为200～300目。步骤S2所述前处理是优选在110℃下烘2小时。

优选地，步骤S3所述重复上述操作使柱体充分密实后继续在样品硅胶上加入2cm厚的柱层析硅胶。

优选地，步骤S4所述匀浆法装柱的高度为30cm；所述用石油醚冲洗层析柱是使用3～4倍柱体积石油醚冲洗层析柱。

优选地，步骤S4所述流出液分段收集是一共分81段样品收集，其中第1～72号样品每50mL收集一次流出液，第73～81号样品每100mL收集一次。

优选地，步骤S4所述的洗脱液，喜树水培的分泌液的洗脱液为石油醚：乙酸乙酯体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的混合物，或者为乙酸乙酯：乙醇体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4的混合物。

优选地，从喜树水培的分泌液中分离富集的化感物质分别是环庚三烯酮、4-氧代-7,7-二硝基-4,5,6,7-四氢(2H)苯并三唑、二苯铬、1,1,2,2-四氯乙烷、2,4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸二异丁酯、N-甲基苯胺、苯胺和N,N-二甲基苯胺。

优选地，步骤S4所述的洗脱液，蛇根草水培的分泌液的洗脱液为石油醚：乙酸乙酯体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的混合物；或者为乙醇：氯仿体积比为0:1、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、1:0的混合物。

优选地，从蛇根草水培的分泌液中分离富集的化感物质分别是1,1,2,2-四氯乙烷、N,N-二甲基苯胺、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯苯硒酚、二苯铬、、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、2,4-二叔丁基苯酚、9-亚甲基-9H-芴、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、3-甲基邻苯二酚、十六酸甲酯、2,2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、十二烷基乙二醇。

本发明同时提供分离富集到的化感物质的检测方法，是将步骤S4收集到的流出液旋转蒸发至干，加入乙腈，溶解，有机相滤膜过滤后进行色谱分析；优选所述旋转蒸发至干是在45℃下旋转蒸发至干；所述有机相滤膜过滤是用0.22μm有机相滤膜过滤；所述色谱分析是利用GC-MS进行分析鉴定。

在此基础上，最优选地，所述分离富集方法包括以下步骤：

S1.将收集的水培液除去杂质，以硅胶作为填充料，利用SPE固相萃取，富集水培液至吸附平衡，富集完毕后收集含根系分泌物的硅胶，烘干得含浓缩粗品的硅胶粉；

S2.取经前处理的硅胶，加入石油醚，匀浆法装柱，用石油醚冲洗层析柱。步骤S2所述前处理是优选在110℃下烘2小时。

S3.取步骤S1所得含浓缩粗品的硅胶粉，用石油醚稀释混匀，加入步骤S2准备的层析柱中，重复上述操作使柱体充分密实，然后在样品硅胶上加柱层析硅胶；

S4.配制不同比例的洗脱液进行梯度洗脱，流出液分段收集；

S5.将步骤S4收集到的流出液旋转蒸发至干，加入乙腈，溶解，有机相滤膜过滤后进行色谱分析。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种新的含喜树碱植物水培根系分泌物中分离富集化感物质的方法，通过对分离富集手段和条件的进一步针对性精确优化，获得了共计25种化感物质，从喜树或者蛇根草任一一种植物中分离富集的化感物质均超过10种以上。本发明对探明水培体系中化感物质具有非常重要的技术指导作用，基于本发明将可以实现对化感物质中有自毒作用的物质及时进行清除，保证植物的生长不会被抑制，促使植物旺盛生长，对优化植物水培体系具有重要意义。

本发明方法步骤简单易行，首先以硅胶作填充剂填充固相萃取柱对植物水培液进行萃取吸附根系代谢物，然后取出填充硅胶加到硅胶层析柱上层进行柱层析分离，再以石油醚、乙酸乙酯、乙醇、氯仿的不同组合作为洗脱剂，以不同组合的不同配比进行洗脱，按洗脱液组分收集洗脱液，旋蒸浓缩，并针对本发明分离方法进一步科学利用气质连用(GC-MS)技术对分离组分进行分析，实现两种植物水培根系分泌物中化感物质的大量分离富集和检测。

本发明从两种含喜树碱植物水培根系分泌物中检测到更多的化感物质，包括从喜树水培根系分泌物中检测到的1,1,2,2-四氯乙烷、N,N-二甲基苯胺、二苯铬、2,4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸二异丁酯等11种化感物质；在广州蛇根草水培根系分泌物中检测到邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸二异丁酯、苯硒酚、二苯铬等14种化感物质。

附图说明

图1蛇根草水培根系物石油醚：乙酸乙酯＝7:3组分HPLC检测结果。

图2蛇根草水培根系物乙醇：氯仿＝2:8组分的HPLC检测结果。

图3蛇根草水培根系物乙醇：氯仿＝4:6组分的HPLC检测结果。

图4蛇根草水培根系物乙醇：氯仿＝6:4组分的HPLC检测结果。

图5蛇根草水培根系物乙醇组分的HPLC检测结果。

图6蛇根草水培根系物石油醚：乙酸乙酯＝7:3组分GC-MS总离子流图。

图7蛇根草水培根系物乙醇：氯仿＝2:8组分的GC-MS总离子流图。

图8蛇根草水培根系物乙醇：氯仿＝4:6组分的GC-MS总离子流图。

图9蛇根草水培根系物乙醇：氯仿＝6:4组分的GC-MS总离子流图。

图10蛇根草水培根系物乙醇组分的GC-MS总离子流图。

图11喜树根系分泌物石油醚：乙酸乙酯(9:1)组分的HPLC检测结果。

图12喜树根系分泌物石油醚：乙酸乙酯(9:1)组分的GC-MS总离子流图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步说明本发明方法。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的生物材料、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生物材料和试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。实施例1蛇根草水培根系物化感物质的富集分离

1.蛇根草水培体系的构建

1.1蛇根草水培及相关操作

广州蛇根草采集回来后，挑选长势良好的植株用自来水轻轻冲洗去除根部的泥土，尽量不伤根，置于6L的塑料盆中加水于人工大棚培养，每盆6～8株，视植株大小而定，广州蛇根草在温度为18～25℃下的持续通风的遮阴大棚下较适宜生长。

1.2根系分泌液的富集

水培45天后，合并收集水培液，过滤除去固体杂质.以硅胶作为填充料，利用SPE固相萃取，批量富集水培液至吸附平衡，更换硅胶.富集完毕后收集含根系分泌物的硅胶，45℃烘干，4℃保存备用。

1.3浓缩液分离检测工艺

(1)装柱与上样

取200～300目经过前处理(110℃下烘2小时)的硅胶，加入石油醚，匀浆法装柱，高度约30cm，使用3～4倍柱体积石油醚冲洗柱子.取3～4g含浓缩粗品的硅胶粉，用少量石油醚稀释混匀，缓慢的加入层析柱中，重复上述操作使柱体充分密实。继续在样品硅胶上加入2cm柱层析硅胶(防止加液时激起硅胶样品导致平面被破坏)。

(2)梯度洗脱

配制不同比例的洗脱液(表1所示)，进行梯度洗脱，洗脱液用量与和极性同样由HPLC分析结果决定。流出液分段收集并做好记录，每40mL收集一次.将收集到的流出液转移至梨形瓶，35℃旋转蒸发至干，加入1.5mL乙腈，超声震荡溶解。用0.22μm有机相滤膜过滤后供色谱分析。

表1洗脱液配比及用量

2.洗脱液的分析：

2.1HPLC检测

色谱条件：色谱柱为Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)；紫外检测波长254nm；流动相为乙腈/水(V/V，40/60))，流动相在使用前超声脱气，并经0.22μm滤膜过滤，流速1mL/min；柱温28℃；进样量20μL。

本发明以乙酸乙酯与石油醚、乙醇与氯仿的不同配比进行梯度洗脱，洗脱液先用HPLC进行检测，经检测，石油醚：乙酸乙酯(7:3)、乙醇:氯仿(2:8)、乙醇:氯仿(4:6)、乙醇:氯仿(6:4)、乙醇:氯仿(1:0)，化感物质分离效果比较好，见图1、图2、图3、图4、图5所示。

2.2GC-MS检测

色谱条件：色谱柱30m×0.25mm，0.33μmSE-30弹性石英毛细管柱。程序升温：初始温度50℃，保持2min，以5℃/min的速率升至150℃，保持5min，再以5℃/min的速率升至220℃，保持10min。进样口温度250℃，载气为氦气，分流比40:1，柱前压68kpa，进样量1μL。

质谱条件：离子源EI，离子源温度230℃，电子能量70eV，接口温度270℃，溶剂延迟3min，离子扫描范围50～800amu。

筛选经HPLC初步分析分离度较好，峰形较为单一的洗脱液浓缩样品，即石油醚：乙酸乙酯(7:3)、乙醇:氯仿(2:8)、乙醇:氯仿(4:6)、乙醇:氯仿(1:0)这几个洗脱比例。经GC-MS检测其中热稳定性化合物，探索植物根系分泌物中化感物质。其离子流图如图6、图7、图8、图9、图10所示。图6中时间的单位为min。附图中没有特别说明的话，时间的单位均为min。

3.分析结果：

利用GC-MS对蛇根草根系分泌物培根系分泌物进行分析，在蛇根草根系分泌物中分离检测到14种化感物质，分别是1,1,2,2-四氯乙烷、N,N-二甲基苯胺、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯苯硒酚、二苯铬、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、2,4-二叔丁基苯酚、9-亚甲基-9H-芴、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、十六酸甲酯、3-甲基邻苯二酚、2,2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、十二烷基乙二醇。

其中以石油醚：乙酸乙酯、乙醇：氯仿的不同配比进行洗脱，当洗脱液为以乙醇:氯仿＝1:0时，分离得到化感物质最多，达到8种，其次是当洗脱液为以乙醇:氯仿＝2:8、乙醇:氯仿＝4:6时，都分别分离得到5种化感物质。

实施例2喜树根系分泌物化感物质的富集分析

1.喜树水培体系的构建

1.1喜树水培相关操作

喜树幼苗水培体系构建的探究：选取50cm左右长势优良的幼苗，挖取时不伤根。一组洗净根部泥土，置于户外培养。

1.2根系分泌液的富集

水培60天后，合并收集水培液，过滤除去固体杂质。以硅胶作为填充料，利用SPE固相萃取，批量富集水培液至吸附平衡，更换硅胶。富集完毕后收集含根系分泌物的硅胶，45℃烘干，4℃保存备用。

1.3浓缩液分离检测工艺

(1)装柱与上样

取200～300目经前处理(110℃下烘2小时)的硅胶，加入石油醚，匀浆法装柱，高度约30cm，使用3～4倍柱体积石油醚冲洗柱子.取20mL浓缩粗品的硅胶粉，用少量石油醚稀释混匀，缓慢的加入层析柱中,重复上述操作使柱体充分密实.继续在样品硅胶上加入2cm厚的柱层析硅胶(防止加液时激起硅胶样品导致平面被破坏)。

(2)梯度洗脱

配制不同比例的洗脱液(表2)，进行梯度洗脱，每次加入50mL洗脱液，为了有效的分离纯化，溶剂极性的渐增程度和用量主要根据各段流出液的HPLC色谱检测决定。流出液分段收集并做好记录，其中1～72号样品每50mL收集一次流出液、73～81号样品每100mL收集一次.将收集到的流出液转移至梨形瓶，45℃旋转蒸发至干。加入1.5mL乙腈，超声振荡溶解。用0.22μm有机相滤膜过滤后供色谱分析。

表2洗脱液配比及用量

2.洗脱液的分析：

2.1HPLC检测

色谱条件：色谱柱为Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)；紫外检测波长254nm；流动相为乙腈/水(V/V，40/60)，流动相在使用前超声脱气，并经0.22μm滤膜过滤，流速1mL/min；柱温28℃；进样量20μL。

本发明以乙酸乙酯与石油醚、乙酸乙酯与乙醇的不同配比进行梯度洗脱，洗脱液先用HPLC进行检测，经检测，在石油醚：乙酸乙酯(1:0)、石油醚：乙酸乙酯(9:1)、石油醚：乙酸乙酯(7:3)、石油醚：乙酸乙酯(3:7)、乙酸乙酯：乙醇(8:2)、乙酸乙酯：乙醇(6:4)，化感物质分离效果比较好。比如在石油醚：乙酸乙酯(9:1)时，其液相的分析图，分离效果比较明显，如图11所示。

2.2GC-MS检测

色谱条件：色谱柱30m×0.25mm，0.33μmSE-30弹性石英毛细管柱.程序升温：初始温度50℃，保持2min，以5℃/min的速率升至150℃，保持5min，再以5℃/min的速率升至220℃，保持10min。进样口温度250℃，载气为氦气，分流比40:1，柱前压68kpa，进样量1μL。

质谱条件：离子源EI，离子源温度230℃，电子能量70eV，接口温度270℃，溶剂延迟3min，离子扫描范围50～800amu。

筛选经HPLC初步分析分离度较好，峰形较为单一的洗脱液浓缩样品，即石油醚：乙酸乙酯(1:0)、石油醚：乙酸乙酯(9:1)、石油醚：乙酸乙酯(7:3)、石油醚：乙酸乙酯(3:7)、乙酸乙酯：乙醇(8:2)、乙酸乙酯：乙醇(6:4)，化感物质分离效果比较好。这几个洗脱比例。经GC-MS检测其中热稳定性化合物，探索植物根系分泌物中化感物质。其中当洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝9:1时，分离出的化感物质最多，达到4种，其离子流图见图12所示。

3.分析结果：

利用GC-MS对喜树水培根系分泌物进行分析，检测到11种化感物质，分别是环庚三烯酮、4-氧代-7,7-二硝基-4,5,6,7-四氢(2H)苯并三唑、二苯铬、1,1,2,2-四氯乙烷、2,4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸二异丁酯、N-甲基苯胺、苯胺和N,N-二甲基苯胺。

含喜树碱植物水培根系化感物质的分离富集方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。