专利摘要
本发明公开了一种麦冬多糖MDG－1硫酸化衍生物，具有式(I)所示结构。该麦冬多糖MDG－1硫酸化衍生物的抗心肌缺血活性有增强的趋势，取代度为0.03－0.08时药理活性最强。另外，本发明还公开了该麦冬多糖MDG－1硫酸化衍生物的制备方法及其在制备抗心肌缺血药物中的应用。式(I)中n≈6，R＝H或－SO3Na，－SO3Na的取代度为0.03－0.1。
权利要求
1、麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物，具有式(I)所示结构：
式(I)
式(I)中n≈6，R＝H或-SO3Na，-SO3Na的取代度为0.03-0.1。
2、如权利要求1所述的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法，采用如下步骤：
在0℃至室温下，将麦冬多糖MDG-1悬浮于有机溶剂中，加入H2SO4和二环己基碳二亚胺作为硫酸化试剂，反应生成麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物，其中：麦冬多糖MDG-1与硫酸的摩尔比为1∶2-8，麦冬多糖MDG-1与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶8-16，反应后用碱溶液调pH至7-8，对透析液透析1-5天，冻干；
或采用如下步骤：
在0℃至室温下，将麦冬多糖MDG-1悬浮于有机溶剂中，加入氯磺酸-吡啶复合物作为硫酸化试剂，反应生成麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物，其中：麦冬多糖MDG-1与氯磺酸-吡啶复合物的用量为1g麦冬多糖MDG-1使用2-5ml氯磺酸-吡啶复合物，反应后用碱溶液调pH至7-8，对透析液透析1-5天，冻干。
3、如权利要求2所述的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂是二甲基亚砜、吡啶、二甲基甲酰胺或甲酰胺。
4、如权利要求2所述的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法，其特征在于，所述碱溶液是Na2CO3或NaOH溶液，浓度为0.1-1M。
5、如权利要求2所述的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法，其特征在于，所述透析液是蒸馏水或NaHCO3溶液。
6、如权利要求2所述的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法，其特征在于，透析时间为3天。
7、麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物在制备抗心肌缺血药物中的应用。
说明书
技术领域技术领域
本发明涉及麦冬多糖MDG-1衍生物，尤其涉及麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物；另外，本发明还涉及麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法及其用途。
技术背景背景技术
养阴类中药具有生津润燥、滋阴养液等功效，以治疗阴虚证为主，它们的毒性一般较小，作用比较温和，以滋补作用为主，对提高人体免疫力，防病治病具有重要的意义。随着人们对多糖药理作用的认识，多糖的研究也愈来愈受到重视，具有养阴作用的中药常含有大量的多糖，它们的生理活性作用分别体现在：免疫调节作用、抗肿瘤作用、降血糖、降血脂作用、抗氧化、抗衰老、心血管系统作用、保肝作用、抗病毒作用、抗疲劳、耐缺氧、抗纤维化、抗溃疡作用等各方面。
在对麦冬中多糖、黄酮、皂苷、氨基酸等大类成分进行筛选中发现：分子量在10 000以下的麦冬多糖可明显增加小鼠耐缺氧能力和心肌营养血流量，能显著增加豚鼠离体心脏冠脉流量，显著抑制犬冠扎引起的心电图ST段抬高及CK、CK-MB的增加，同时有减小缺血心室肌重占总心室肌重的比例的趋势。口服、腹腔注射均能对抗异丙肾上腺素引起的心肌细胞坏死。证实了相对分子质量在10000以下的麦冬多糖是抗心肌缺血作用的有效部位之一。
中国发明专利CN1227013C(授权公告日：2002年11月16日)首次公开了植物多糖在抗心肌缺血方面的作用。在上述基础上，我们应用超滤、纳滤技术对10 000分质量以下的麦冬多糖按分子量进行分级，以为指标进行有效部位的筛选，得到麦冬多糖MDG-1，经凝胶过滤法检定为单一对称峰形，证明为均一组分。经糖组分分析，红外吸收光谱、核磁共振光谱分析及甲基化反应确定：MDG-1为β-D-果聚糖，以2→1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链残基上有一个Fruf(2→6)Fruf(2→分支)。该多糖的还原端可能与α-D-Glc相连，其峰尖分子量为5000(中国发明专利CN1257918C，授权公告日2006年05月31日)。
麦冬多糖MDG-1可以使缺血再灌的心脏收缩幅度和冠脉流量较快地恢复，并可抑制心率加快，还可降低缺血后血浆中乳酸脱氢酶的释放。说明MDG-1对缺血再灌的心肌细胞具有保护作用。其机制可能有以下几个方面：①抑制心肌缺血造成的自由基生成增加和清除氧自由基，保护心肌细胞膜的作用[徐德生，冯怡，周跃华.麦冬多糖中抗急性心肌缺血活性部位研究[J].中成药，2004，26(10)：832-837.]。②增加心肌营养血流量[周跃华，徐德生，冯怡，等.麦冬提取物对小鼠心肌营养血流量的影响[J].中国实验方剂学杂志，2003，9(1)：22-24.]，使缺血的心肌较快恢复供血。阐明了麦冬多糖MDG-1为麦冬抗心肌缺血的物质基础之一。
多糖经硫酸酯化后富含SO42-，易与蛋白质的特定结构域结合，由此改变其构象并影响其功能。随着组成多糖的单糖排列顺序、分子量大小、硫酸酯化部位及硫酸酯化程度不同，可在抗病毒、抗凝血、抗肿瘤等方面发挥特殊作用。硫酸基团是抗病毒活性的一个先决条件，如葡聚糖本身不具有抗病毒活性，但硫酸葡聚糖则具有抗HIV活性。如香菇多糖硫酸化后形成香菇多糖硫酸酯，其抗H IV的活性增强。
现有技术中尚无麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物、其制备方法及其用途的文献报道。
发明内容发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是对麦冬多糖MDG-1进行结构改造，提出一种具有更高抗心肌缺血活性的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物。
本发明所要解决的技术问题之二是提出麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三是提出麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物的用途。
本发明为解决上述技术问题之一而提出的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物，具有式(I)所示结构：
式(I)
式(I)中n≈6，R＝H或-SO3Na，-SO3Na的取代度为0.03-0.1。
式(I)所示的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物通过如下步骤制备而成：在0℃至室温下，将麦冬多糖MDG-1悬浮于有机溶剂中，加入H2SO4和二环己基碳二亚胺作为硫酸化试剂，反应生成麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物，其中：麦冬多糖MDG-1与硫酸的摩尔比为1∶2-8，麦冬多糖MDG-1与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶8-16，反应后用碱溶液调pH至7-8，对透析液透析1-5天，冻干；
式(I)所示的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物还可通过如下步骤制备而成：在0℃至室温下，将麦冬多糖MDG-1悬浮于有机溶剂中，加入氯磺酸-吡啶复合物作为硫酸化试剂，反应生成麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物，其中：麦冬多糖MDG-1与氯磺酸-吡啶复合物的用量为1g麦冬多糖MDG-1使用2-5ml氯磺酸-吡啶复合物，反应后用碱溶液调pH至7-8，对透析液透析1-5天，冻干。
本发明上述制备方法中，所述有机溶剂最好是二甲基亚砜、吡啶、二甲基甲酰胺或甲酰胺，所述碱溶液最好是Na2CO3或NaOH溶液，浓度最好为0.1-1M；所述透析液最好是蒸馏水或NaHCO3溶液。
随后的实验将表明MDG-1经硫酸化修饰后，其药理活性有增强的趋势，这可能与硫酸化多糖具有细胞膜的保护作用有关。与离体实验结果相似，整体实验同样表明MDG-1经硫酸化后其抗心肌缺血的活性有增强的趋势，但其抗心肌缺血的活性不与硫酸根取代度呈现正相关性，当硫酸根取代度为0.03-0.08时，药理活性较强，具有明显增强的抗心肌缺血作用，可用于制备抗心肌缺血药物；而取代度为0.12-0.13时，麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物无显著的抗心肌缺血的作用。随后的实验将表明硫酸化MDG-1能非常显著地抑制乳酸脱氢酶的释放，说明其抗心肌缺血的作用机制可能与细胞膜的稳定作用有关。
本发明用经典的硫酸化衍生物制备方法合成了硫酸化MDG-1，实验结果表明：MDG-1经硫酸化后其抗心肌缺血的活性有增强的趋势，其取代度为0.03-0.08时药理活性最强。
附图说明附图说明
图1是麦冬多糖MDG-1的红外图谱；
图2是麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物(MDG-1-S)的红外图谱；
具体实施方式具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
取麦冬多糖MDG-1400mg，悬浮于50ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温搅拌30min，加入DCC(5.0946g)的二甲基甲酰胺(DMF)75ml，混合物迅速冷却至0℃，再加入的H2SO41.2099g的DMF 50ml，在25℃温度下反应30min，混合物倾入装有250g碎冰的烧杯中，用1M NaOH调pH至7-8，滤除不溶物，清液对流动水透析2天，对蒸馏水透析2天，袋内出现沉淀滤除，收集清液，冻干。经测定，MDG-1硫酸酯中硫酸根的取代度为0.03，具有显著抗心肌缺血活性。
实施例2
取麦冬多糖MDG-1500mg，悬浮于25ml甲酰胺(FA)中，室温搅拌30min，在冰盐浴中冷却至＜0℃，缓慢滴加氯磺酸-吡啶复合物2ml，室温搅拌6h时间，反应完毕，加1M NaOH调pH至7-8，对蒸馏水透析3天，冻干。经测定，MDG-1硫酸酯中硫酸根的取代度为0.1，具有显著抗心肌缺血活性。
实施例3
取麦冬多糖MDG-1500mg，悬浮于50ml二甲基亚砜(DMSO)中，室温搅拌30min，加入DCC 10.1891g的二甲基甲酰胺(DMF)75ml，混合物迅速冷却至0℃，再加入的H2SO41.2099g的DMF 50ml，在30℃温度下反应60min，混合物倾入装有250g碎冰的烧杯中，用1M NaOH调pH至7-8，滤除不溶物，清液对流动水透析2天，对蒸馏水透析2天，袋内出现沉淀滤除，收集清液，冻干。经测定，MDG-1硫酸酯中硫酸根的取代度为0.08，具有显著抗心肌缺血活性。
实施例4(麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物红外光谱鉴定)
随机选取实施例1或2或3制备得到的麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物进行了红外光谱鉴定：
分别称取MDG-1硫酸化衍生物各1-2mg用KBr压片，测定范围4000cm-1-400cm-1。
比较麦冬多糖MDG-1的红外图谱(如图1所示)和麦冬多糖硫酸化衍生物(MDG-1-S)的红外图谱(如图2所示)可以看出，除原来的多糖母体吸收特征外，还增加了1240cm-1吸收，是由-SO3H的S＝O伸缩振动引起的，819.6cm-1处有C-O-S伸缩振动，这些都是硫酸键的特征吸收。说明多糖上连接上的磺酸基。
实施例5(MDG-1硫酸化衍生物抗心肌缺血研究)
5.1.模型制备与给药方法。
皮下注射Iso致大鼠心肌缺血模型，与正常对照组相比，模型组大鼠在皮下注射Iso后，ST段明显抬高或降低，LDH含量明显升高，提示心肌明显缺血坏死，表明造模是成功的。空白对照组和模型对照组分别预先给予生理盐水溶液(同给药组等容量)，MDG-1硫酸化衍生物各剂量组及普奈洛尔组分别经口灌胃给药，每日1次，体积为1ml/100g体重，连续给药三天，模型对照组、MDG-1各剂量组及普奈洛尔组第二天和第三天给药1h后给予Iso(0.1ml/100g体重，s.c.)，正常对照组给予等容量的生理盐水(s.c.)。分别记录给药前及第2次注射Iso后30min的心电图(标准II导联)，测量J点位移，计算注射Iso后各组大鼠J点位移改变的绝对值。大鼠腹主动脉采血，肝素抗凝后离心分离血浆，分光光度法测定计算血浆中LDH活性单位。
5.2.实验分组与剂量设置。
健康雄性SD大鼠80只，随机分为10组，分别为以下几组：
(1)正常对照组；
(2)模型组；
(3)MDG-1(低、高剂量分别为20mg/kg、40mg/kg)；
(4)MDG-1-S(低、高剂量分别为20mg/kg、40mg/kg)；
(5)阳性对照药：β受体拮抗剂普奈洛尔(剂量为8mg/kg)。
5.3.实验结果。
5.3.1.对Iso s.c.后大鼠心电图的影响。
如表1所示，与模型组相比，阳性药普奈洛尔、MDG-1高剂组和MDG-1-S高、低剂量组均能明显抑制Iso所致大鼠的心电图ST段位移(P＜0.05)。MDG-1-S的作用呈现随剂量增加反而有减弱的趋势。
表1.对抗Iso所致大鼠心电图的影响(0.1mv，x±s，n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01vs正常对照组；
5.3.2.对Iso(s.c.)大鼠后LDH活性的影响。
LDH释放增加可认为是心肌细胞损伤的敏感标示之一。心肌LDH的消耗可反映心肌缺血范围的大小，冠状静脉窦血清LDH浓度的增加，标志着心肌损伤时酶的释放增加，故测定血清LDH浓度可作为估计心肌缺血损伤范围和程度的指标。
如表2所示，在LDH活性检测中发现，与模型组相比，阳性药普奈洛尔、MDG-1-S高、低剂量组可明显降低LDH活性单位。MDG-1高剂量组可明显降低LDH活性单位。其中硫酸化MDG-1低剂量组降低LDH活性单位的作用最明显，与模型组相比P＜0.01；普奈洛尔、MDG-1-S1高剂量组与模型组相比P＜0.05。MDG-1-S1不同剂量组的LDH活性与正常组一致。说明口服给予不同剂量MDG-1及其衍生物，对大鼠损伤心肌细胞具有膜稳定作用，其中MDG-1-S1作用最显著，且呈现随剂量增加活性减弱的趋势。
表2.对Iso所致大鼠后LDH活性的作用(0.1mv，x±s，n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01vs 模型组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01vs正常对照组；
实施例6(不同取代度MDG-1硫酸化衍生物抗心肌缺血生物活性研究)
6.1.实验分组与剂量设置：
实验中我们发现MDG-1硫酸化衍生物抗心肌缺血作用，以低剂量组较为明显。因此，将剂量稍作调整。麦冬多糖硫酸化衍生物(MDG-1-S)加入生理盐水分别配制成1、2mg/ml两种浓度的溶液。健康雄性SD大鼠96只，随机分为12组。
①正常对照组；
②模型组；
③MDG-1-S1(低、高剂量分别为10mg/kg、20mg/kg)；
④MDG-1-S2(低、高剂量分别为10mg/kg、20mg/kg)；
⑤MDG-1-S3(低、高剂量分别为10mg/kg、20mg/kg)；
⑥MDG-1-S4(低、高剂量分别为10mg/kg、20mg/kg)；
⑦MDG-1-S5(低、高剂量分别为10mg/kg、20mg/kg)。
6.2.实验结果：
如表3、4所示，MDG-1-S1、MDG-1-S2、MDG-1-S3高、低剂量组均能明显降低LDH活性单位，MDG-1-S1、MDG-1-S2的低剂量组与模型组相比P＜0.05，高剂量组与模型组相比差异非常显著P＜0.01，其抗心肌损伤作用与剂量呈明显正相关。MDG-1-S3高、低剂量组与模型组相比P值均＜0.05，其作用随剂量升高有降低趋势，是否降低其剂量能产生更好的药效有待进一步研究。其中MDG-1-S1、MDG-1-S2、MDG-1-S3与正常对照组相比显著性差异(P＞0.05)。
MDG-1-S4、MDG-1-S52个剂量组对LDH均无明显影响，与模型组相比P＞0.05。
以上结果说明MDG-1-S1、MDG-1-S2、MDG-1-S3均可对抗Iso所致的心肌缺血损伤，而MDG-1-S4、MDG-1-S5无明显的作用。
表3.不同取代度MDG-1硫酸化衍生物对抗Iso所致大鼠心电图的影响(0.1mv，x±s，n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01vs正常对照组；
表4.不同取代度MDG-1硫酸化衍生物对Iso所致大鼠后LDH活性的作用 (0.1mv，x±s，n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01vs模型组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01vs正常对照组；
实施例7(麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物对豚鼠离体心脏缺血再灌注损伤的影响)
7.1.模型制备与给药方法。
取成年健康豚鼠，击枕部致昏，打开胸腔，迅速取出心脏，制备Langendorff离体心脏，以95％O2+5％CO2混合气体饱和的K-H营养液(37±0.5℃)冠状动脉恒压灌流，流量7～10ml/min，灌注压7.0～7.5KPa。待心脏恢复正常节律自主收缩后稳定灌流15分钟，再换用K-H营养液配制的不同浓度的药液灌流10分钟，然后停止灌流使全心缺血30min，再恢复灌注15min。测定药液灌流前和灌流10分钟后，恢复灌注后2、5、8、10、12、15分钟的收缩幅度和心率，并于药液灌流前和灌流10分钟后、恢复灌注后0、5、10、15分钟测定冠脉流量。
7.2.实验分组与剂量设置：
根据前期预实验结果，MDG-1离体心脏的最终有效浓度为10-4g/ml。按照1∶10的比例折算，确定豚鼠离体心脏药效学的最终实验浓度分别为10-6，10-5，10-4g/ml。阳性对照药FDP采用10-6，10-5，10-4g/ml三个最终有效浓度进行平行的药效学对照研究。
①模型组：阴性对照；
②FDP给药组(10-6，10-5，10-4g/ml)；
③MDG-1给药组(10-6，10-5，10-4g/ml)；
④MDG-1-S给药组(10-6，10-5，10-4g/ml)；
7.3.实验结果如表5、6和7所示。
表5.MDG-1及其硫酸化衍生物对Langendorff离体心脏缺血再灌注前后收缩幅度的影响 (％，n＝6，x±S)
*P＜0.05，**P＜0.01同空白对照组比(以K-H液稳定灌流15min后为100)
表6.MDG-1及其硫酸化衍生物对Langendorff离体心脏缺血再灌注前后心率的影响 (％，n＝6，x±S)
●P＜0.05，**P＜0.01同空白对照组比较(以K-H液稳定灌流15min后为100)
表7.MDG-1及其硫酸化衍生物对Langendorff离体心脏缺血再灌注前后冠脉流量的影响 (％，n＝6，x±S)
*P＜0.05，**P＜0.01同空白对照组比较；ΔΔP＜0.01同缺血前比较(以K-H液稳定灌流15min后为100)。
麦冬多糖MDG-1硫酸化衍生物、其制备方法及用途专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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