专利摘要

本发明公开了一种丹参酮IIA衍生物TAN20，所述丹参酮IIA衍生物TAN20结构式如式(I)所示，其与丹参酮IIA相比，具有更好的改善糖脂代谢的效果，能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥；所述丹参酮IIA衍生物TAN20促进脂肪细胞米色化以及活化棕色脂肪组织，增强有氧氧化及胰岛素敏感性的调控机制，不同于传统的改善肥胖及其相关代谢综合症的方法及机理，可作为白色脂肪细胞米色化促进剂和棕色脂肪激活剂，用于制备防治肥胖及相关代谢综合症的药物，具有较大的应用前景。

权利要求

1.丹参酮IIA衍生物TAN20在制备防治肥胖及相关代谢综合症的药物中的应用，所述相关代谢综合症为糖尿病；

所述丹参酮IIA衍生物TAN20的结构式如式（I）所示：

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2.丹参酮IIA衍生物TAN20在制备降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥的制剂中的应用；

所述丹参酮IIA衍生物TAN20的结构式如式（I）所示：

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说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种丹参酮IIA衍生物TAN20及其制备方法，以及所述丹参酮IIA衍生物TAN20在制备防治肥胖及相关代谢综合症的药物中的应用。

背景技术

长期以来，肥胖发生的主导理论是“热量学说”，认为现代社会的人摄入的食物热量太多、消耗的太少，能量不平衡，多余的热量成为脂肪存储起来，导致体重增加乃至肥胖，而肥胖又可以产生糖尿病及许多相关代谢性疾病。按照这个理论，减肥的主要办法是减少热量的摄入、增加运动量。但现实是这种控制体重的效果欠佳，且易反复。而现今流行的手术抽脂减肥对机体毕竟会造成一定的创伤，并且可能存在潜在的并发症。另一方面，随着全球社会经济发展，越来越多的国家和地区进入富裕社会，糖尿病发病率及患者数目急剧升高。限制热量是预防肥胖的第一道防线，一旦发生糖脂代谢的异常，提高代谢效率和增加脂肪组织等主要代谢器官的能量消耗就显得尤为重要。

另外，与代谢综合症相关病症的最有效方法是多作锻炼，减肥和饮食控制。目前所有对抗代谢综合症方法的共同之处在于促进能量代谢，由此导致体内多余能量的最大消耗从而阻止能量积累。由于从加工食品和快餐中摄取的高卡路里，与不充分的锻炼相比，多余能量以脂肪的形式进行了累积，并由此变成了包括代谢紊乱的多种疾病的根本原因。有效的消除这些多余能量可考虑作为治疗代谢紊乱的方法。提高代谢活性对有效地消除多余能量至关重要。出于这一目的，一般认为必须抑制脂肪合成，抑制糖原异生，协助葡萄糖消耗，协助脂肪氧化，协助能量代谢中心细胞器线粒体的生物发生，以及活化参与代谢活化的因子。

丹参酮(Tanshinone)为丹参根部的乙醚或乙醇提取物，是丹参的主要脂溶性有效成分，含有邻苯二醌或对醌结构，具有很强的脂溶性，可在生物体内广泛分布，具有广泛的药理活性。丹参酮根据其不同的化学结构主要分为丹参酮I(tanshinone I，TSI)、丹参酮IIA(tanshinoneIIA，TAN2A或TSA)、丹参酮IIB(tanshinone B，TSB)、隐丹参酮(cryptotanshinone，CTS)、15,16-二氢丹参酮(15,16-dihydrotanshinone，DTS)等。其中，丹参酮IIA(PubChem CID：164676)活性最为突出，具有抗氧化、抗菌消炎和免疫调节活性。专利CN201110438937.3公开了用增强代谢活性的丹参衍生物治疗肥胖和代谢综合症的报道，具体公开了含有作为有效成分的丹参酮衍生物的预防和治疗代谢综合症的组合物能够通过提高AMPK的活性来预防和治疗肥胖和代谢综合症；专利CN200910145560.5公开了丹参酮IIA在制备治疗肥胖及胰岛素抵抗的药物中的应用。但是上述公开的丹参酮或其衍生物在改善糖脂代谢方面的效果不理想。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种丹参酮IIA衍生物TAN20，所述丹参酮IIA衍生物TAN20具有更好的改善糖脂代谢的效果，丹参酮IIA衍生物TAN20通过活化棕色脂肪以及促进白色脂肪米色化来改善糖脂代谢紊乱，能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥。

本发明的另一目的在于提供所述丹参酮IIA衍生物TAN20的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述丹参酮IIA衍生物TAN20在制备防治肥胖及相关代谢综合症的药物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种丹参酮IIA衍生物TAN20，所述丹参酮IIA衍生物TAN20的结构式如式(I)所示：

所述丹参酮IIA衍生物TAN20的制备方法，在反应容器中加入丹参酮IIA、4-甲砜基苯甲醛，加热混匀后，80～120℃反应10～30min，将反应液冷却至室温，调节溶液pH至6.5～7.5，得到淡黄色沉淀，过滤、层析、洗脱即得丹参酮IIA衍生物TAN20。

优选地，所述丹参酮IIA、4-甲砜基苯甲醛的摩尔比为34：51。

优选地，所述反应为微波反应。

优选地，所述反应为100℃反应20分钟。

优选地，所述pH为7.0。

本发明研究发现，丹参酮IIA衍生物TAN20有更好的改善糖脂代谢的效果，能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥，所述丹参酮IIA衍生物TAN20促进脂肪细胞米色化以及活化棕色脂肪组织，增强有氧氧化及胰岛素敏感性的调控机制，不同于传统的改善肥胖及其相关代谢综合症的方法及机理，可用于进一步制备用于防治肥胖及相关代谢综合症的相关药物。

因此，本发明还请求保护所述丹参酮IIA衍生物TAN20在制备防治肥胖及相关代谢综合症的药物中的应用。

具体地，所述相关代谢综合症为肥胖症，糖尿病，动脉硬化，高血压，高脂血，肝病，脑溢血，心肌梗塞，局部缺血疾病和心血管疾病中的至少一种。

本发明还提供一种防治肥胖及相关代谢综合症的药物，所述药物含有作为有效成分的丹参酮IIA衍生物TAN20。

同时，所述丹参酮IIA衍生物TAN20的下列应用也在本发明保护范围内：

丹参酮IIA衍生物TAN20在制备降低血糖、改善糖耐量的制剂中的应用。

丹参酮IIA衍生物TAN20作为或在制备促进白色脂肪细胞米色化的制剂中的应用，具体为促进白色脂肪细胞转化成米色脂肪的制剂。

丹参酮IIA衍生物TAN20作为或在制备棕色脂肪活化剂中的应用，具体为提高棕色脂肪活性的制剂，即棕色脂肪激活剂。

同时，本发明进一步研究发现，丹参酮IIA衍生物TAN20是通过先磷酸化AMPK，进而上调PGC1a的表达，最终促进UCP1(解偶联蛋白1)的表达来调控棕色脂肪活化或者促进白色脂肪米色化的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种丹参酮IIA衍生物TAN20，所述丹参酮IIA衍生物TAN20有更好的改善糖脂代谢的效果，能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥能降低血糖、改善糖耐量和消脂减肥，所述丹参酮IIA衍生物TAN20促进脂肪细胞米色化以及活化棕色脂肪组织，增强有氧氧化及胰岛素敏感性的调控机制，不同于传统的改善肥胖及其相关代谢综合症的方法及机理；可作为白色脂肪细胞米色化促进剂和棕色脂肪激活剂，用于制备防治肥胖及相关代谢综合症的药物，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为丹参酮IIA衍生物TAN20的(A)结构图，结构鉴定的核磁共振(B)碳谱，(C)氢谱，(D)电喷雾质谱。

图2为丹参酮IIA衍生物TAN20降低肥胖小鼠体重，减小脂肪组织中组织细胞尺寸大小以及脂肪组织中FFA，TG的含量。还可以改善糖耐量(GTT)、胰岛素耐量(ITT)，降低血糖含量和胰岛素水平。(A)丹参酮IIA及其衍生物TAN20的结构式，用二甲基亚砜(DMSO)或丹参酮2A/TAN20处理DIO小鼠(高脂喂养的肥胖小鼠模型)30天；(B)打药过程中对体重的监控；(C)日摄食量变化；(D)体温变化；(E)药物处理后葡萄糖耐量试验；(F)空腹血糖水平；(G)胰岛素耐量；(H)空腹胰岛素水平。

图3为丹参酮IIA衍生物TAN20降低肥胖猴体重，提高体温，改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量，降低糖化血红蛋白水平，降低空腹胰岛素含量，减小脂滴大小及提高线粒体的数量。用DMSO，丹参酮IIA及其衍生物TAN20处理肥胖猴两周：(A)打药过程中对体重进行评估；(B)打药后测体温；(C)高低密度脂蛋白比值；(D)胆固醇；(E)肌酸磷酸激酶(CPK)；(F)乳酸脱氢酶(LDH)；(G)空腹血糖水平；(H)空腹血浆胰岛素水平；(I)葡萄糖耐量试验；(J)胰岛素耐受试验；(K)用透射电镜拍摄皮下脂肪组织的图像(L指脂滴，M指线粒体)。

图4为丹参酮IIA衍生物TAN20减小脂肪细胞中脂滴尺寸，提高还原当量NADH及增强能量ATP生成，增强线粒体呼吸容量。3T3-L1MBX细胞用丹参酮IIA以及其衍生物TAN20处理之后，检测相关指标。(A)3T3-L1MBX细胞油红染色；(B)3T3-L1MBX细胞透射电子显微镜图像；(C)3T3-L1MBX细胞线粒体Mitotracker染色；(D)药物处理后3T3-L1MBX细胞中的ATP水平；(E)3T3-L1MBX中的总NAD(NADt)和NADH产量；(F)3T3-L1MBX细胞中的OCR(氧耗速率)。

图5为丹参酮IIA衍生物TAN20促进棕色脂肪组织脂滴的消耗，对棕色脂肪相对比重没有显著影响，促进UCP1的表达，以及线粒体的产生，上调相应棕色脂肪Maker，相关转录因子，以及能量代谢相关分子，提高UCP1蛋白的表达。给予丹参酮2A/20两周后检测相关指标。(A)棕色脂肪组织(BAT)HE染色；(B)棕色脂肪组织UCP1蛋白的免疫组化；(C)药物处理后棕色脂肪组织占总体重的百分比；(D)药物处理后棕色脂肪组织线粒体mtDNA拷贝数；(D)棕色脂肪活化标志基因的相对表达量；(E)棕色脂肪与UCP1相关转录因子的相对表达量；(E)棕色脂肪线粒体与脂肪酸氧化相关基因的相对表达量；(H)Western-blot显示TAN20处理后棕色脂肪组织中的UCP1蛋白表达。

图6为丹参酮IIA衍生物TAN20促进皮下脂肪组织脂滴的消耗，对棕色脂肪相对比重没有显著影响，促进UCP1的表达，以及线粒体的产生，上调相应棕色脂肪Maker，相关转录因子，以及能量代谢相关分子，提高UCP1蛋白的表达，给予丹参酮2A/20两周后检测相关指标。(A)皮下脂肪组织(scWAT)HE染色；(B)皮下脂肪组织UCP1蛋白的免疫组化；(C)Western-blot显示TAN20处理后皮下脂肪组织中的UCP1蛋白表达；(D)药物处理后皮下脂肪组织线粒体mtDNA拷贝数；(E)皮下脂肪组织米色化标志基因的相对表达量；(F)皮下脂肪组织米色化相关转录因子的相对表达量；(G)皮下脂肪组织线粒体与脂肪酸氧化相关基因的相对表达量；(H)Western-blot显示TAN20处理后皮下脂肪组织中UCP1蛋白的表达。

图7为丹参酮IIA衍生物TAN20通过诱导脂肪米色化改善代谢稳态的示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1丹参酮IIA衍生物TAN20的合成

丹参酮IIA衍生物TAN20的合成，包括如下步骤：

在30毫升石英管中加入丹参酮IIA(102.1毫克，0.34毫摩尔)，4-甲砜基苯甲醛(95.9毫克，0.51毫摩尔)，乙酸铵5克和冰醋酸15毫升。将石英管在磁力搅拌器上加热搅拌10分钟，置于微波反应器中，100℃反应20分钟。结束后取出石英管，待其冷却至室温，将反应液加入200毫升烧杯，加入30毫升蒸馏水，用浓氨水将PH值调至7，将产生大量淡黄色沉淀。将其过滤，真空干燥得到淡黄色沉淀粗产品。将其用乙酸乙酯溶解，过100～200目硅胶柱层析。将石油醚和乙酸乙酯混合作为洗脱剂，将目标化合物洗脱下来。减压旋干得到淡黄色固体，产率为83.5％(以4-甲砜基苯甲醛计算)。TAN20的核磁共振谱，氢谱，质电喷雾谱结果见图1，表明成功制备得到了式(I)所示丹参酮IIA衍生物TAN20。上述反应的化学反应方程式如下所示：

实施例2丹参酮IIA衍生物TAN20的生物学功效

本实施例使用现有的丹参酮IIA和实施例1合成的丹参酮IIA衍生物TAN20进行糖脂代谢方面的相关研究。

一、试验方法

1、体内实验包括：高脂诱导肥胖/糖尿病动物模型、糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)、腹腔注射、脂肪组织提取与分析等。

2、细胞实验包括：原代脂肪细胞的分离提取与诱导；免疫(荧光)细胞组织化学、线粒体染色示踪技术、线粒体呼吸容量检测(氧气消耗率OCR、NADH)。

3、生物大分子检测技术：免疫印迹(Western-blot)、实时定量PCR(qPCR)、ELISA、Oil-Red O染色示踪脂肪滴技术、脂肪酸检测技术、糖化血红蛋白检测。

4、附睾垫及腹股沟原代脂肪细胞(Primary adipocytes of the inguinal orepididymal)的分离提取与诱导：

首先在无菌的条件下分离老鼠的腹股沟、附睾垫，先用加了双抗的PBST将脂肪组织洗三遍，再用高压灭菌的剪刀将脂肪组织剪碎，以1：2的比例加入已用40μm过滤器过滤的二型胶原酶。在37℃，100转/分钟的条件下消化1小时左右。其中加上双抗，当脂肪组织都被消化好之后就可以用加了10％FBS的DMEM高糖培养基以1：1的比例加入消化液中已终止消化。以1500转/分钟的转速离心10分钟。弃上清后用新的培养基重悬细胞种版即可。诱导的过程：首先前两天加上诱导液1(加上1um/ML的IBMX；1um/ML的地塞米松(DEX)；10ng/ML的胰岛素；10％胎牛血清(FBS)；0.01％的双抗的DMEM高糖培养基)，在用诱导液1诱导2天后换成诱导液2(加上10ng/ML的胰岛素；10％胎牛血清(FBS)；0.01％的双抗的DMEM高糖培养基)诱导2～4天后换成诱导液3(10％胎牛血清(FBS)；0.01％的双抗的DMEM高糖培养基)诱导2～4天后即可看见脂滴。此为诱导成功的原代脂肪细胞。此时其可以用于后续各种实验处理。

5、GTT，即糖耐量测试：肥胖/糖尿病或正常鼠预先处理后再空腹过夜达18小时后进行，静脉注射葡萄糖(4μl/g体重或1g葡萄糖/kg体重)，尾静脉取血，在葡萄糖灌注后0，15，30，60，120分钟时间点用血糖测量仪测量血糖，然后以时间为横坐标、血糖浓度为纵坐标，绘制糖耐量曲线，反应血糖水平的变化趋势。

ITT，即胰岛素耐量测试：肥胖/糖尿病鼠预先处理后再饥饿6小时后进行，腹腔注射生理盐水稀释的0.5U/ml的重组胰岛素，每只肥胖/糖尿病鼠用量1U胰岛素/kg体重，然后在0，15，30，60，120分钟时间点用血糖测量仪测量血糖，以平均值作曲线，反应血糖水平变化趋势。

6、检测用丹参酮IIA衍生物TAN20处理动物或者细胞后糖、脂代谢的关键分子：采用Real-time PCR和/或Western-blot检测肝脏、脂肪(包括皮下脂肪，腹股沟脂肪，棕色脂肪)等组织器官的能量代谢AMPK；PGC1A等，胰岛素敏感性相关蛋白：pAKT，糖脂代谢GLUT4，米色化Maker：UCP1，PRDM16，TMEM16等相关指标，及控制糖、脂代谢的的情况，以此分析丹参酮IIA衍生物TAN20对糖、脂代谢系统的影响。证实丹参酮IIA衍生物TAN20能缓解胰岛素抵抗效应：通过空腹进行口服糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验，观察丹参酮IIA衍生物TAN20是否可以降低肥胖动物糖耐量水平，以此判断能否具有缓解胰岛素抵抗的效应；观察丹参酮IIA衍生物TAN20能否降低肥胖动物eWAT，BAT实质重量及脂肪组织内脂类含量，以此判断TAN20能否干预脂肪代谢；通过HE染色观察脂肪组织中脂滴的改善情况以及通过油红染色观察脂肪细胞中脂肪的积累情况。

7、用透射电镜观察脂肪组织和脂肪细胞的脂滴大小以及线粒体的多少，用MitoTracker染色来观察线粒体在细胞上的数量。用mtDNA来定量脂肪组织和细胞中线粒体的扩增情况。

二、具体试验过程及结果如下：

1、采用二甲基亚砜(DMSO)溶解丹参酮IIA衍生物TAN20，腹腔注射肥胖小鼠，检测体重。

(1)建立了高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型：小鼠为C57BL6，从中山大学动物实验中心购买。高脂饮食组采用脂肪含量为60％的饲料喂养，正常饮食组采用10％脂肪饲料作对照组，每周固定时间称量各组中每只动物的体重、活动情况、饲料的消耗等。

(2)用DMSO溶解的丹参酮IIA衍生物TAN20直接腹腔注射db/db肥胖糖尿病模型鼠：db/db鼠重新分组，5只/组，编为：DMSO注射组(DMSO)，丹参酮IIA注射组(TAN2A)、丹参酮IIA衍生物TAN20注射组(TAN20)。小鼠的注射浓度为30mg/kg TAN2A/TAN20(溶于DMSO)，每天注射一次。对照组老鼠每只注射相同体积的DMSO。

结果显示，丹参酮IIA衍生物TAN20注射肥胖鼠第2周即开始表现明显的体重减轻效果，实验结束后体重减轻幅度达到10％以上，而TAN2A组体重没有显著变化。HE染色显示能明显减小脂肪组织中组织细胞尺寸大小。并且葡糖糖耐量以及胰岛素耐量，空腹血糖，胰岛素含量等糖代谢相关数据也有所改善。并且TAN20组的都比TAN2A的效果显著。此部分的数据结果如图1所示。此外，丹参酮IIA衍生物TAN20注射肥胖小鼠后，线粒体生成增多，体温增加，能量代谢水平也相应的提高了，而且TAN20的效果比TAN2A更显著。此部分结果见图2。

2、丹参酮IIA衍生物TAN20直接注射到肥胖食蟹猴

采用二甲基亚砜(DMSO)溶解丹参酮IIA衍生物TAN20，腹腔注射肥胖食蟹猴，检测体重。

(1)建立了高脂饮食诱导的食蟹猴肥胖模型：猴子为食蟹猴，在广东省实验动物监测所饲养。高脂饮食组采用特定的高脂饲料喂养，正常饮食组采用普通饲料作对照组，每月固定时间称量各组中每只动物的体重、活动情况、饲料的消耗等。

(2)用DMSO溶解的丹参酮IIA衍生物TAN20直接腹腔注射高脂饮食诱导的肥胖猴：食蟹猴雄性鼠用高脂饮食喂养6个月后，肥胖食蟹猴重新分组，3只/组，编为：丹参酮IIA衍生物TAN20注射组(HFD-TAN20)、DMSO注射组(HFD-DMSO)；食蟹猴的注射浓度为30mg/kgTAN20(溶于DMSO)，每天注射一次；对照组食蟹猴每只注射相同体积的DMSO。丹参酮IIA衍生物TAN20注射肥胖组第1周即开始表现明显的体重减轻效果，实验结束后体重减轻幅度达到10％以上，HE染色显示能明显减小脂肪组织中细胞尺寸大小。并且葡糖糖耐量以及胰岛素耐量，空腹血糖，胰岛素含量等糖代谢相关数据也有所改善。此部分的数据结果如图3所示。

3、在细胞模型上进一步探讨丹参酮IIA衍生物TAN20对能量代谢的调控。

采用二甲基亚砜(DMSO)溶解丹参酮IIA及其衍生物TAN20，用30mg/kg的浓度处理诱导成脂肪细胞的3T3-L1细胞，检测能量代谢的相关指标

探讨了丹参酮IIA衍生物TAN20对脂肪细胞脂滴的影响，对线粒体生成的影响，对能量代谢的指标ATP及还原性氢的作用，以及对脂肪细胞氧耗速率的影响。发现丹参酮IIA衍生物TAN20可促进脂滴的分解，促进线粒体的生物产生，提高ATP和NADH的水平，促进细胞的氧耗。并且TAN20的效果要好于TAN2A。结果见图4所示。

4、在已有的动物实验的基础上进一步探讨丹参酮IIA衍生物TAN20调节糖脂代谢及能量代谢的机制。

(1)探讨了丹参酮IIA衍生物TAN20对棕色脂肪组织产热的影响：在棕色脂肪组织及原代棕色脂肪组织细胞上探讨丹参酮IIA衍生物TAN20对脂肪的代谢，线粒体的产生，棕色脂肪的活性的影响，发现丹参酮IIA衍生物TAN20可增加脂肪的消耗，促进线粒体的生物产生，提高棕色脂肪的活性。结果见图5所示。

(2)探讨了丹参酮IIA衍生物TAN20对白色脂肪组织米色化的影响：在皮下白色脂肪组织，附睾垫白色脂肪组织，及其相应的原代脂肪细胞上探讨丹参酮IIA衍生物TAN20对脂肪米色化，线粒体产生的影响，发现丹参酮IIA衍生物TAN20可增加脂肪的消耗，提高线粒体的生物产生，促进皮下或者内脏白色脂肪组织米色化。结果见图6所示。

一种丹参酮IIA衍生物TAN20及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。