专利摘要
本发明提供了一种减少或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予有效量的芳香族阳离子肽，该肽具有至少一个净正电荷；最少四个氨基酸；最多约二十个氨基酸；净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及芳香基的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
权利要求
1.一种在有需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少4个氨基酸；
(c)最多大约20个氨基酸；
(d)所述净正电荷数的最小数目(pm)与所述氨基酸残基的总数(r)之间的关系为，其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及
(e)所述芳香基团的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
2.根据权利要求1所述的方法，其中2pm是小于或等于r+1的最大数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中a等于pt。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少2个正电荷。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少3个正电荷。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽是水溶性的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括一个或多个D-氨基酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基酸的C-末端羧基在所述的C-末端被酰胺化。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括一个或多个非天然存在的氨基酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最少4个氨基酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约12个氨基酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约9个氨基酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有最多约6个氨基酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽具有μ-阿片样物质受体激动剂活性。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽不具有μ-阿片样物质受体激动剂活性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽具有分子式：D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的酪氨酸残基。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的2’，6’-二甲基酪氨酸残基。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的D-精氨酸残基。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的苯丙氨酸氨酸残基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肽包括在N-末端的2’，6’-二甲基苯丙氨酸残基。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽具有分子式：酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(DALDA)。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述肽具有分子式：
2’，6’-Dmt--D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmt1-DALDA)。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述肽具有分子式：苯丙氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Phe1-DALDA)。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述肽具有分子式：
2’，6’-Dmp-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Dmp1-DALDA)。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经口服给药。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经局部给药。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经鼻内给药。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经全身给药。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述肽经静脉内给药。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经皮下给药。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经肌肉内给药。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经脑室内给药。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经鞘内给药。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽经透皮给药。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述透皮给药采用离子电渗疗法。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受局部缺血。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受再灌注。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受缺氧。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述局部缺血是由中风造成的。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述局部缺血是肠局部缺血。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述局部缺血存在于肌肉组织中。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述肌肉组织是心肌组织。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述肌肉组织是骨骼肌组织。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述肌肉组织是平滑肌组织。
46.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受缺氧。
47.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在患神经退行性疾病或病症。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是帕金森氏症。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是阿尔茨海默氏症。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是亨廷顿氏症。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
52.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物正在经受药物诱发的MPT。
53.依据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
54.一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或阻止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予所述离体器官有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少4个氨基酸；
(c)最多大约20个氨基酸；
(d)净正电荷数的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数
(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；
以及
(e)所述芳香基团的最小数目(a)与所述净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
55.一种在需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或阻止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少3个氨基酸；
(c)最多大约20个氨基酸；
(d)净正电荷数的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数
(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；
以及
(e)所述芳香基团的最小数目(a)与所述净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
56.一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或阻止线粒体通透性改变的方法，所述方法包括给予所述离体器官有效量的芳香族阳离子肽，所述芳香族阳离子肽具有：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少3个氨基酸；
(c)最多大约20个氨基酸；
(d)净正电荷数的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数
(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；
以及
(e)所述芳香基团的最小数目(a)与所述净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
57.一种具有序列D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2的肽。
说明书
技术领域用于防止线粒体通透性改变的方法
技术背景背景技术
线粒体几乎存在于所有的真核细胞中，并且通过氧化磷酸化作用产生三磷酸腺苷(ATP)，因而对于细胞生存是必需的。阻断这一重要的功能可以导致细胞死亡。
线粒体还通过积聚钙(Ca2+)而在细胞内的钙调节方面扮演重要的角色。通过膜电位驱动的单向转运体在线粒体基质内产生钙的积聚。
钙的摄入激活了线粒体脱氢酶，而这在维持能量生成和氧化磷酸化方面可能是重要的。另外，线粒体可以作为过量胞浆Ca2+的储槽，从而保护细胞免受Ca2+过载和坏死。
局部缺血或低血糖症可以导致线粒体功能失常，包括ATP水解和Ca2+过载。该功能失常引起线粒体通透性改变(线粒体渗透性转变，MPT)。MPT的特征有：氧化磷酸化解偶联，线粒体膜电位丧失，内膜通透性增加以及肿胀。
另外，线粒体膜间间隙是凋亡基因蛋白(apoptogenic proteins)的储库。因此，线粒体电位的丧失和MPT可以导致将凋亡基因蛋白释放到细胞质内。越来越多的证据表明MPT与坏死性和细胞凋亡性细胞死亡有关(Crompton，Biochem J.341：233-249，1999)，这并不令人奇怪。细胞的轻微损伤可能导致凋亡而不是坏死。
环胞菌素可以抑制MPT。由环胞菌素A所致的MPT阻断可以抑制多种细胞类型的凋亡，包括经历局部缺血，缺氧，Ca2+过载和氧化应激的细胞(Kroemer et a1.，Annu Rev Physiol.60：619-642，1998)。
然而，环胞菌素A作为抗坏死性和凋亡性细胞死亡的治疗药物不是最好的。例如，环胞菌素A不能特异性地靶向线粒体。另外，它很难被递送到脑部。而且，由于它的免疫抑制活性减少了环胞菌素A的应用范围。
四肽[Dmt1]DALDA(2’，6’-二甲基酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2；SS-02)分子量为640，并且在生理pH下带有3个净正电荷。[Dmt1]DALDA以非能量依赖的方式很容易穿过许多哺乳动物细胞类型的质膜(Zhao et a1.，J Pharmacol Exp.Ther.304：425-432，2003)并且穿过血脑屏障(Zhao et al.，J Pharmacol Exp.Ther.302：188-196，2002)。尽管[Dmt1]DALDA已经显示出是一种潜在的μ-阿片样物质(μ-类鸦片，opioid)受体激动剂，但它的应用还没有扩展到包括抑制MPT的方面。
因此，在如局部缺血-再灌注、缺氧症、低血糖症以及由于线粒体膜通透性改变(线粒体渗透性转变)所导致的病理改变的其它的疾病和病症的情况下，需要抑制MPT。这样的疾病和病症包括多种常见的神经退行性疾病或病症。
发明内容发明内容
本发明提供一种用于在有需要的任何哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法，这些目的和其它目的可以通过本发明来实现。该方法包括给予该哺乳动物有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少3个氨基酸；
(c)最多约20个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
在另一具体实施例中，本发明提供一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少3个氨基酸；
(c)最多约20个氨基酸；
(d)净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中，2a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
在又一具体实施例中，本发明提供一种在有需要的哺乳动物中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该哺乳动物有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少3个氨基酸；
(c)最多约20个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
在更进一步的具体实施例中，本发明提供一种在哺乳动物的离体器官中减少经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量或防止线粒体通透性改变的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的具有以下特征的芳香族阳离子肽：
(a)至少一个净正电荷；
(b)最少3个氨基酸；
(c)最多约20个氨基酸；
(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；以及
(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中，3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当a是1时，pt也可以是1。
附图说明附图说明
图1：线粒体中[Dmt1]DALDA(SS-02)的细胞内化和聚集。(A)用荧光分光光度计测量SS-19的线粒体摄入(ex/em＝320/420)。加入经分离的小鼠肝脏线粒体(0.35mg/ml)导致SS-19荧光强度快速淬灭(灰线)。用FCCP(1.5μM)预处理的线粒体减少淬灭＜20％(黑线)。(B)经分离的线粒体用[3H]SS-02于37℃孵育(温育)2分钟。于4℃离心(16000×g)5分钟中止摄入，测定沉淀中的放射性。用FCCP预处理的线粒体抑制[3H]SS-02摄入～20％。数据用平均值±标准误差表示；n＝3，*，采用Student’s t-检验的P＜0.05。(C)由丙甲甘肽诱导的线粒体肿胀使经分离的线粒体摄入的TMRM丢失，而摄入的SS-19则保持在高浓度。黑线为TMRM；红线为SS-19。(D)如通过TMRM荧光测定的，在经分离的线粒体中加入SS-02(200μM)不改变线粒体电位。加入FCCP(1.5μM)引起快速去极化，而Ca2+(150μM)导致去极化和MPT渐进开始。
图2.[Dmt1]DALDA(SS-02)保护线粒体免受Ca2+过载和3-硝基丙酸(3NP)诱导的线粒体通透性改变(MPT)。(A)经分离的线粒体用10μM的SS-02预处理(用下箭头表示加入)阻止了由Ca2+过载诱导的MPT的发生(上箭头)。黑线为缓冲液；红线为SS-02。(B)经分离的线粒体用SS-02预处理增加了在MPT发生前成倍加入Ca2+的线粒体耐受性。箭头指示加入缓冲液或SS-02。线1为缓冲液；线2为50μM的SS-02；线3为100μM的SS-02。(C)SS-02剂量依赖性地延缓由1mM 3NP诱导的MPT的发生。箭头表示加入缓冲液或SS-02。线1为缓冲液，线2为0.5μM的SS-02；线3为5μM的SS-02；线4为50μM的SS-02。
图3.[Dmt1]DALDA(SS-02)抑制线粒体肿胀和细胞色素C释放。(A)将经分离的线粒体用SS-02预处理，其剂量依赖性地抑制了由200μM的Ca2+以剂量依赖方式诱导的线粒体肿胀。通过在540nm处的吸光度来测量肿胀。(B)SS-02抑制经分离的线粒体中由Ca2+诱导的细胞色素C的释放。细胞色素C的释放量用线粒体中总细胞色素C的百分数表示。数据用平均值±标准误差表示，n＝3。(C)SS-02也能抑制由MPP+(300μM)诱导的线粒体肿胀。
图4.D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(SS-31)抑制线粒体肿胀和细胞色素C释放。(A)经分离的线粒体用SS-31(10μM)预处理阻止了由Ca2+诱导的MPT的发生。灰线为缓冲液；红线为SS-31。(B)线粒体用SS-31(50μM)预处理抑制了由200mM的Ca2+诱导的线粒体肿胀。通过测量在570nm处的光散射来测量肿胀。(C)SS-02和SS-31与环胞菌素(CsA)在抑制由Ca2+诱导的线粒体肿胀和细胞色素C释放的比较。细胞色素C释放量用线粒体中总细胞色素C的百分数表示。数据用平均值±标准误差表示，n＝3。
图5.[Dmt1]DALDA(SS-02)和D-精氨酸-Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(SS-31)在经灌注的离体豚鼠心脏的局部缺血-再灌注过程中保护心肌收缩力。心脏用缓冲液或含有SS-02(100nM)或SS-31(1nM)的缓冲液灌注30分钟，然后经受30分钟的全心(global)缺血。用同样的灌注溶液进行再灌注。发现在3个治疗组中存在显著的差异(双因素方差分析，P＜0.001)。
图6.向心脏停搏液中加入[Dmt1]DALDA显著增强了经灌注的离体豚鼠心脏在延长的缺血之后的收缩功能。稳定30分钟后，心脏用St.Thomas心脏停搏液(CPS)或含有100nM的[Dmt1]DALDA的CPS灌注3分钟。通过完全阻断冠状动脉灌注90分钟来引发全心失血。随后用氧化的Krebs-Henseleit溶液进行60分钟再灌注。在接受[Dmt1]DALDA的组中缺血后收缩力被显著提高(P＜0.001)。
具体实施方式具体实施方式
本发明是基于发明人的惊人发现：某些芳香族阳离子肽显著地减少了经历线粒体通透性改变(MPT)的线粒体数量，甚至完全阻止了MPT。减少经历MPT的线粒体数量以及阻止MPT是很重要的，因为MPT与哺乳动物中多种常见的疾病和病症相关。另外，哺乳动物的离体器官容易发生MPT。这些疾病和病症具有特殊的临床意义，因为在生命的某些阶段它们影响很大比例的人群。
肽
本发明中有用的芳香族阳离子肽是水溶性和高极性的。尽管有这些性质，但这些肽能够很容易穿过细胞膜。
本发明中有用的芳香族阳离子肽包括最少3个通过肽键共价连接的氨基酸，并且优选包括最少4个通过肽键共价连接的氨基酸。
本发明的芳香族阳离子肽中的氨基酸最大数目为通过肽键共价连接的约20个氨基酸。优选的氨基酸的最大数目为约12个，更优选为约9个，并且最优选为约6个。最佳的状况是，存在于该肽中的氨基酸数目为4。
本发明中有用的芳香族阳离子肽中的氨基酸可以是任何氨基酸。术语“氨基酸”在本文中是指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。优选地，至少一个氨基位于相对于羧基的α位。
这些氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如在哺乳动物蛋白质中自然发现的20种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
其它天然存在的氨基酸包括例如在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，在产生尿的过程中哺乳动物代谢合成的鸟氨酸和瓜氨酸这些氨基酸。
本发明中可用的肽可以含有一个或多个非天然存在的氨基酸。这些非天然存在的氨基酸可以是左旋(L)、右旋(D)或它们的混合物。最佳的状况是该肽不含有天然存在的氨基酸。
非天然存在的氨基酸是那些通常不是在生物体正常代谢过程中合成，并且不是在蛋白质中天然存在的氨基酸。另外，本发明中优选的可用的非天然存在的氨基酸也不被普通的蛋白酶识别。
非天然存在的氨基酸可以出现在该肽的任何位置。例如，该非天然存在的氨基酸可以位于N-末端，C-末端或在N-末端和C-末端之间的任何位置。
例如，该非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基或烷芳基这些基团。烷基氨基酸的一些例子包括：α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯乙酸，和γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括如向天然存在的氨基酸上添加一个或多个化学基团。
例如，一个或多个化学基团可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’或6’位中的一个或多个位置上，或色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’或7’位中的一个或多个位置上。该基团是可以添加到芳香环上的任何化学基团。这些基团的一些例子包括支链或直链的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，C1-C4烃氧基(即烷氧基)，氨基，C1-C4烷基胺和C1-C4二烷基胺(例如甲胺、二甲胺)，硝基，羟基，卤素(即氟基、氯基、溴基或碘基)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊例子包括正缬氨酸(Nva)，正亮氨酸(Nle)和羟脯氨酸(Hyp)。
本发明的方法中在有用肽中的氨基酸修饰的另一个例子是该肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基衍生化。衍生化的一个例子是用氨或用如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺这些伯胺或仲胺酰胺化。衍生化的另一个例子包括用如甲醇或乙醇酯化。
另外一种这样的修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基衍生化。例如，这些氨基可以被酰化。一些合适的酰基包括，例如包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷酰基，如乙酰基或丙酰基。
优选的是非天然存在的氨基酸对普通蛋白酶是稳定的，更优选的是对其不敏感。对蛋白酶稳定或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-型非天然存在的氨基酸。D-氨基酸不是正常存在于蛋白质中的，尽管在某些抗菌肽中发现过它们，但它们是通过除细胞正常的核糖体蛋白合成器以外的工具合成的。本文中所使用的这些D-氨基酸可以认为是非天然存在的氨基酸。
为了使对蛋白酶的敏感性降到最低，本发明的方法中有用的肽应该具有少于5个，优选少于4个，更优选少于3个，且最优选少于2个毗邻的可以被普通蛋白酶识别的L-氨基酸，无论这些氨基酸是否是天然存在的或非天然存在的。最佳的情况是，该肽仅含有D-氨基酸，而不含有L-氨基酸。
如果该肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，则至少这些氨基酸中的一个优选为非天然存在的D-氨基酸(右旋精氨酸)，从而提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的例子包括容易被普通蛋白酶如肽链内切酶和胰蛋白酶切开的两个或多个毗邻的碱性氨基酸。碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
在生理pH下该芳香族阳离子肽具有相对于该肽中氨基酸残基总数的最小数目的净正电荷是很重要的。生理pH下净正电荷的最小数目下文中表示为(pm)。该肽中氨基酸残基总数下文中表示为(r)。
下文讨论的净正电荷的最小数目都是在生理pH条件下。术语“生理pH”在本文中是指哺乳动物身体的组织和器官细胞中的正常pH。例如人的生理pH通常约为7.4，但是哺乳动物中正常的生理pH可以是从约7.0到约7.8之间的任意pH。
“净电荷”本文中是指由存在于该肽中的氨基酸所携带的正电荷数和负电荷数的差值。在本说明书中，应当理解为净电荷是在生理pH下测量的。在生理pH下具有正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。在生理pH下具有负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有一个正电荷的N-末端氨基和一个负电荷的C-末端羧基。在生理pH下电荷彼此抵消。作为计算净电荷的一个例子，肽：酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一个负电荷氨基酸(即，谷氨酸)和四个正电荷氨基酸(即，两个精氨酸残基，一个赖氨酸和一个组胺酸)。因此上述肽含有3个净正电荷。
在本发明的一个实施例中，该芳香族阳离子肽在生理pH下净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为：其中3Pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系如下：
在另一实施例中，该芳香族阳离子肽在净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为：其中2pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系如下：
在一个实施例中，净正电荷最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)相等。在另一实施例中，该肽含有3或4个氨基酸残基并且具有最少一个净正电荷，优选为最少2个净正电荷以及更优选为最少3个净正电荷。
该芳香族阳离子肽具有相对于净正电荷总数(pt)最少量的芳香基团也很重要。芳香基的最小数目在下文中表示为(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这些氨基酸。例如，六肽：赖氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸含有2个净正电荷(由赖氨酸和精氨酸残基贡献)和3个芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基贡献)。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽在芳香基最小数目(a)和生理pH下净正电荷总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除非当pt是1，a也可以是1。在该实施例中，芳香基的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系如下：
在另一个实施例中，该芳香族阳离子肽在芳香基最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数。在该实施例中，芳香族氨基酸残基的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系如下：
在另一个实施例中，芳香基数目(a)和净正电荷总数(pt)是相等的。
羧基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，优选用例如氨进行酰胺化形成C-末端酰胺。另一种可选的方案是，C-末端氨基酸的末端羧基可以用任何伯胺或仲胺酰胺化。该伯胺或仲胺可以是，例如烷基，尤其是支链或直链C1-C4烷基、或芳基胺。相应地，该肽C-末端的氨基酸可以转化成酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。
即使天冬酰胺残基、谷酰胺残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基的自由羧基基团不位于本发明的芳香族阳离子肽的C-末端，不论它们位于该肽的任何位置都可以被酰胺化。这些内部位置的酰胺化可以用氨或任何上述的伯胺或仲胺进行。
在一个实施例中，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽是一种具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在一个具体的实施例中，本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽是一种具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
本发明的方法中有用的芳香族阳离子肽包括但不限于下述肽的实例：
赖氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Lys-D-Arg-Tyr-NH2)，
苯丙氨酸-右旋精氨酸-组氨酸(Phe-D-Arg-His)，
右旋酪氨酸-色氨酸-赖氨酸-NH2(D-Tyr-Trp-Lys-NH2)，
色氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2)，
酪氨酸-组氨酸-右旋甘氨酸-蛋氨酸(Tyr-His-D-Gly-Met)，
苯丙氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-天冬氨酸(Phe-Arg-D-His-Asp)，
酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2)，
蛋氨酸-酪氨酸-右旋赖氨酸-苯丙氨酸-精氨酸(Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg)，
右旋组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸(D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg)，
赖氨酸-右旋谷氨酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2(Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2)，
苯丙氨酸-右旋精氨酸-赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-组氨酸(Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His)，
甘氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2)，
缬氨酸-右旋赖氨酸-组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2)，
色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸(Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys)，
赖氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-NH2(Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2)，
苏氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸(Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys)，
天冬氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-赖氨酸-NH2(Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2)，
右旋组氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋组氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2(D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2)，
丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋色氨酸-组氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe)，
酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸(Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe)，
苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-NH2(Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2)，
苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-组氨酸-右旋赖氨酸-右旋赖氨酸-谷氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-苏氨酸(Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr)，
酪氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-右旋酪氨酸-组氨酸-赖氨酸(Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys)，
谷氨酸-精氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-右旋缬氨酸-苯丙氨酸-右旋组氨酸-色氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋蛋氨酸-NH2(Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2)，
精氨酸-右旋亮氨酸-右旋酪氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-右旋苯丙氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-甘氨酸(Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly)，
右旋谷氨酸-精氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋缬氨酸-酪氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2)，
天冬氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe)，
组氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-丙氨酸-精氨酸-半胱氨酸-右旋酪氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-NH2(His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2)，
甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-谷氨酸-精氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-色氨酸-组氨酸-右旋赖氨酸-天冬氨酸(Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp)，
以及
苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-右旋组氨酸-精氨酸-酪氨酸-NH2(Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-NH2)。
在一个实施例中，本发明的方法中有用的肽具有μ-阿片样物质受体激动剂活性(即，激活μ-阿片样物质受体)。μ-阿片样物质受体的激活通常具有止痛作用。
在一些情况下，优选的是具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽。例如，在如急性疾病和病症这样的短期治疗过程中，使用可激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽是有益的。这些急性疾病和病症通常与中度或重度疼痛相关。在这些情况下，该芳香族阳离子肽的止痛作用在对病人或其它哺乳动物的治疗方案中是有益的，尽管其不能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽，但是也可以根据临床需要与或不与止痛剂结合使用。
在其它情况下，另一种可选方案优选的是不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽。例如，在如慢性疾病和病症这样的长期治疗过程中，使用能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽可能是禁忌的。在这些情况下，该芳香族阳离子肽潜在的副作用或成瘾作用可能会妨碍具有μ-阿片样物质受体激活作用的芳香族阳离子肽在对病人或其它哺乳动物的治疗方案中的使用。
潜在的副作用可以包括镇静、便秘和呼吸抑制。在这些情况下，不能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽可能是一种恰当的治疗药物。
急性病症的实例包括：心脏病发作、中风(脑卒中)和外伤。外伤可以包括脑外伤和脊髓外伤。
慢性疾病和病症的例子包括：如下所述的冠状动脉疾病和任何神经退行性疾病。
本发明的方法中有用的具有μ-阿片样物质受体活性的肽通常是的含有酪氨酸残基或酪氨酸N-末端(即，第一个氨基酸位置)衍生物的那些肽。优选的酪氨酸衍生物包括：2’-甲基酪氨酸(Mmt)；2’，6’-二甲基酪氨酸(2’6’Dmt)；3’，5’-二甲基酪氨酸(3’5’Dmt)；N，2’，6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；以及2’-羟基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在一特别优选的实施例中，具有μ-阿片样物质受体活性的肽具有分子式为：酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(为了方便以首字母缩写表示为：DALDA，在本文中称作SS-01)。DALDA具有由酪氨酸、精氨酸和赖氨酸这些氨基酸提供的3个净正电荷，以及由苯丙氨酸和酪氨酸提供的2个芳香基团。DALDA的酪氨酸可以是被修饰的酪氨酸衍生物如2’，6’-二甲基酪氨酸，从而生成具有分子式为2’，6’-二甲基酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Dmt1-DALDA，在本文中称作SS-02)的化合物。
不具有μ-阿片样物质受体活性的肽通常在N-末端(即，氨基酸的位置1)不含有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物。在N-末端的氨基酸可以是除酪氨酸以外的任意天然存在的或非天然存在的氨基酸。
在一个实施例中，N-末端氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。优选的苯丙氨酸衍生物包括：2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’，6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2’，6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2’-羟基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。
另一种不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽的分子式为：苯丙氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Phe1-DALDA，在本文中称作SS-20)。可选替换地，该N-末端苯丙氨酸可以是苯丙氨酸的衍生物如2’，6’-二甲基苯丙氨酸(2’6’Dmp)。在氨基酸位置1含有2’，6’-二甲基苯丙氨酸的DALDA的分子式为2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(2’，6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，2’6’Dmp1-DALDA)。
在一优选实施例中，Dmt1-DALDA(SS-02)的氨基酸序列是重新排列的，使得Dmt不位于N-末端。这样不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽的例子具有的分子式为：右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2)(在本说明书中称作SS-31)。
DALDA、Phe1-DALDA、SS-31、和它们的衍生物可以进一步包括功能类似物。如果该类似物具有与DALDA、Phe1-DALDA或SS-31类似的功能，则该肽被称作是DALDA、Phe1-DALDA或SS-31的功能类似物。例如，该类似物可以是DALDA、Phe1-DALDA或SS-31的取代变体，在该取代变体中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代。
DALDA、Phe1-DALDA或SS-31适宜的取代变体包括保守的氨基酸取代。氨基酸按照它们的物理化学性质可以分组如下：
(a)非极性氨基酸：丙氨酸(A)丝氨酸(S)苏氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G)(Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G))；
(b)酸性氨基酸：天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q)(Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q))；
(c)碱性氨基酸：组氨酸(H)精氨酸(R)赖氨酸(K)(His(H)Arg(R)Lys(K))；
(d)疏水性氨基酸：甲硫氨酸(M)亮氨酸(L)异亮氨酸(I)缬氨酸(V)(Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V))；以及
(e)芳香族氨基酸：苯丙氨酸(F)酪氨酸(T)色氨酸(W)组氨酸(H)(Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H))。
肽中的一个氨基酸被同组的另一个氨基酸取代称作保守取代，并且这种可以保留原始肽的物理化学性质。相反，肽中的一个氨基酸被不同组的另一个氨基酸取代一般更有可能改变原始肽的性质。
在本发明的实践中，能激活μ-阿片样物质受体有用的类似物的例子包括但不限于表1中所示的芳香族阳离子肽。
表1
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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