专利摘要

本发明涉及作为心脏组织中纤维化的关键调节物的称作miR-29a-c的微小RNA家族的鉴定。发明人显示了miR-29家族的成员在心脏组织中响应压力而下调，且在对压力和纤维化都有抗性的小鼠的心脏组织中上调。还提供了调控miR-29 miRNA家族的表达和活性的方法，作为对纤维变性疾病，包括心脏肥大、骨骼肌纤维化、其它纤维化相关疾病和胶原丢失相关疾病的治疗。

说明书

发明领域

一般而言，本发明涉及发育生物学和分子生物学领域。更具体的说，它关注miR-29家族对成纤维细胞中的基因调控和细胞生理。此miRNA家族在胶原沉积，特别是由成纤维细胞介导的胶原沉积中发挥重要作用。

发明背景

心脏病及其表现，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心脏肥大，清楚代表了美国当今的一项重大健康风险。诊断、治疗和支持罹患这些疾病的患者的花费完全达到数十亿美元。心脏病的两项特别严重的表现是心肌梗死和心脏肥大。就心肌梗死而言，典型的是，由于动脉粥样硬化，在冠状动脉中发生急性血小板性冠状动脉闭塞，引起心肌细胞死亡。因为心肌细胞，即心脏肌肉细胞，是终末分化的且一般没有能力进行细胞分裂，所以当它们在急性心肌梗死过程期间死亡时它们一般被瘢痕组织代替。瘢痕组织没有收缩性，无助于心脏功能，而且常常通过在心脏收缩期间扩张，或通过增加心室的大小和有效半径，例如变得肥大，而在心脏功能中发挥有害作用。虽然初始的胶原沉积是梗死愈合和预防心脏破裂所需要的，但是成纤维细胞持续生成胶原在梗死缘带中的肌细胞周围和梗死心脏的远端心肌(remotemyocardium)诱发间质性纤维化。由于压力的增大，此纤维化诱发僵硬、舒张功能障碍、和心肌细胞肥大，而且还能导致心率失常(arrythmias)。

心脏肥大是心脏对实际上所有形式心脏病(包括那些源自高血压、机械负荷、心肌梗死、心脏心率失常、内分泌病症、和心脏收缩蛋白质基因中遗传突变的)的适应性应答。虽然肥大性应答最初是提高心输出量的代偿机制，但是持久的肥大能导致扩张性心肌病(DCM)、心力衰竭、和猝死。在美国，每年有大约50万人诊断出心力衰竭，死亡率接近50％。心脏肥大的前因后果已经被广泛证明，但是根本的分子机制尚未阐明。了解这些机制是心脏病的预防和治疗中的一项重大关注点，而且作为设计特异性靶向心脏肥大和心脏心力衰竭的新药物中的治疗形态会是至关重要的。

用药理学药剂进行的治疗代表了用于减轻或消除心力衰竭表现的主要机制。利尿药构成了轻度至中度心力衰竭的一线治疗。如果利尿药无效，那么可使用血管扩张药，诸如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如enalopril和lisinopril)或肌力药疗法(即通过提高心肌肌肉收缩力量来提高心输出量的药物)。不幸的是，这些标准疗法中的许多具有众多不良反应，而且在有些患者中是禁忌的。如此，当前使用的药理学药剂在特定患者群中具有严重缺陷。新的、安全的且有效的药剂的可得性无疑会惠及不能使用目前可得的药理学形态的患者或没有自那些形态获得足够缓解的患者。

心肌细胞在正常情况中由胶原纤维的精细网络所包围。响应病理性压力，心脏成纤维细胞和细胞外基质蛋白质不成比例地且过度地积累。心肌纤维化，即所有形式病理性肥大的一项特征，导致机械僵硬，这促成收缩功能障碍(Abraham等，2002)。病理性肥大和心力衰竭的另一项标志是对一组胎儿心脏基因(包括那些编码心房利钠肽(ANP)、B-型利钠肽(BNP)和收缩蛋白质胎儿同等型诸如骨骼α-肌动蛋白和β-肌球蛋白重链(MHC))的重新激活。这些基因通常在出生后受到遏制，并被一组成人心脏基因的表达替换(McKinsey和Olson，2005)。胎儿基因表达对心脏功能和重塑的后果(例如纤维化)尚未完全了解。然而，已经提出响应压力而发生的β-MHC(一种慢速ATP酶)上调和α-MHC(一种快速收缩ATP酶)下调涉及心脏功能的降低(Bartel，2004)，而且已知BNP在心脏纤维化中发挥支配性作用。

在心脏纤维化之外，有许多病症或疾患与各种组织的纤维化有关。先天性肝纤维化(一种常染色体隐性疾病)是一种影响肝和肾二者的罕见遗传病。该疾病的特征为肝异常，诸如肝大、门高血压、和遍及整个肝的纤维样结缔组织(肝纤维化)。肺纤维化(或肺瘢痕形成)源自正常肺气囊逐渐被纤维变性组织替换。当瘢痕形成时，组织变厚，引起组织运送氧进入血流的能力不可逆地丢失。最流行的想法是肺组织中的纤维变性过程是对肺微观损伤的反应(因遗传而易感)。虽然尚不知道确切的起因，但是已经得出与吸入的环境和职业污染物、吸烟、疾病(诸如硬皮病、类风湿性关节炎、狼疮和结节病)、某些药疗和治疗性辐射有关。

硬皮病是一种特征为胶原在皮肤或其它器官中过度沉积的慢性病。该疾病的局限性类型尽管使人失去能力，但不太会致命。作为心、肾、肺或肠损伤的结果，系统性类型或系统性硬化病(它是该疾病的全身性类型)会是致命的。硬皮病影响皮肤，而且在更加严重的情况中，它能影响血管和内脏器官。

骨骼肌纤维化是常常在患病或受损肌肉中发生的现象。它以纤维组织的过度生长为特征，这通常源自身体试图自损伤恢复的企图。纤维化损害肌肉功能并引起虚弱。肌肉功能丢失的程度一般随纤维化的程度而增大。肌肉营养不良(特别是贝克(Becker)肌营养不良(BMD)和更严重深入的等位基因表现，迪谢内(Duchenne)肌营养不良(DMD))的受害者随着疾病进展常常罹患日益增多的骨骼肌纤维化。已知其它病痛(诸如去神经萎缩)造成骨骼肌纤维化，以及神经肌肉疾病，诸如急性多神经炎、脊髓灰质炎、Werdig/Hoffman病、肌萎缩侧索硬化(Lou Gehrig病)、和渐进性延髓萎缩疾病。

最近提出微小RNA涉及多种生物学过程，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢、和造血细胞分化等的调节。微小RNA(miR)指自常常编码多种密切相关miRNA的多顺反子转录物、蛋白质编码基因的内含子、或各miRNA基因衍生的，长度为约18个至约25个核苷酸的小型、非蛋白质编码RNA。参见综述Carrington等(2003)。miR起靶物mRNA的阻抑物的作用，这通过促进它们的降解(当它们的序列优选互补时)或通过抑制翻译(当它们的序列含有错配时)来实现。

miRNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参见Qi等(2006)Cellular & Molecular Immunology Vol.3：411-419)转录，而且源自称作初级miRNA转录物(pri-miRNA)的初始转录物，它们一般长数千碱基。pri-miRNA在细胞核中被RNA酶Drosha加工成约70个至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。转运至细胞质后，发夹pre-miRNA被Dicer进一步加工以生成双链miRNA。然后将成熟miRNA链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在那里它通过碱基对互补性与它的靶mRNA联合。在相对罕见的、miRNA与mRNA靶物完美碱基配对的情况中，它促进mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，从而影响mRNA稳定性或抑制mRNA翻译。

跨越碱基2-8(称作“种子”区)的miRNA的5′部分对于靶物识别是尤其重要的(Krenz和Robbins，2004；Kiriazis和Kranias，2000)。种子的序列与靶序列的系统发生保守性一起构成许多当前靶物预测模型的基础。虽然可获得目益增多的用于预测miRNA及其靶物的深奥计算办法，但是靶物预测仍然是一项重大挑战，而且需要实验验证。将miRNA的功能归于对特定mRNA靶物的调节因各miRNA与数以百计的潜在的高和低亲和力mRNA靶物碱基配对的能力及使多种miRNA靶向各mRNA变得更加复杂。增强的对miRNA功能的了解无疑会揭示促成正常发育、分化、细胞间和细胞内通讯、细胞周期、血管发生、凋亡、和许多其它细胞过程的调节网络。最近，发明人报告了一种心脏特异性微小RNA，miR-208，它是由α-肌球蛋白重链(MHC)基因的内含子编码的，而且是响应心脏压力而上调β-MHC表达和遏制心脏中的快速骨骼肌基因所需要的(参见共同悬而未决的申请WO2008/016924，通过述及将其完整收入本文)。本发明详述了微小RNA在心脏以及其它组织中的参与。

发明概述

本发明基于如下的发现，即miR-29家族(其在心脏中响应压力而下调)调节胶原沉积和纤维化(包括心脏纤维化)形成。miR-29a-c表达或功能的上调导致胶原和纤维蛋白基因的表达降低，导致降低的心脏纤维化。因而，本发明提供了一种在有所需要的受试者中治疗心脏纤维化、心脏肥大、或心力衰竭的方法，包括鉴定具有心脏纤维化、心脏肥大或心力衰竭的受试者；并给所述受试者施用miR-29a-c表达或功能的激动剂。在一个实施方案中，所述miR-29a-c激动剂是包含miR-29a、miR-29b、miR-29c、或其组合的成熟序列的多核苷酸。所述miR-29a-c激动剂可以通过胃肠外施用(例如静脉内或皮下)、口服、经皮、持续释放、受控释放、延迟释放、栓剂、导管或舌下施用来施用。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用第二疗法。所述第二疗法选自下组：β-阻滞剂、肌力药、利尿药、ACE-I、AII拮抗剂、BNP、Ca⁺⁺-阻滞剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、和HDAC抑制剂。

本发明还提供了一种在有所需要的受试者中预防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括鉴定有风险发生病理性心脏肥大或心力衰竭的受试者；并提升所述受试者的心脏细胞中的miR-29a-c的表达或活性。在一个实施方案中，提升miR-29a-c的表达或活性包括对所述心脏细胞递送miR-29a-c的激动剂或编码miR-29a-c的表达载体。在另一个实施方案中，所述有风险的受试者展现出一种或多种选自下组的风险因素：长期存在的不受控制的高血压、未矫正的瓣膜病、慢性心绞痛(chronic angina)、近期的心肌梗死、对心脏病的先天性素因、和病理性肥大。在另一个实施方案中，所述有风险的受试者已经诊断为具有对心脏肥大的遗传素因。在还有一个实施方案中，所述有风险的受试者具有心脏肥大的家族史。

本发明还涵盖一种转基因的非人哺乳动物，其细胞未能表达功能性miR-29a、miR29b、和/或miR29c。在另一个实施方案中，本发明提供了一种转基因的非人哺乳动物，其细胞包含在异源启动子控制下的miR-29a-c编码区，所述异源启动子在所述非人哺乳动物的细胞中有活性。所述转基因哺乳动物可以是小鼠。

在一个实施方案中，本发明提供了一种在有所需要的受试者中治疗心肌梗死的方法，包括提升所述受试者的心脏细胞中的miR-29a-c的表达或活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种在有所需要的受试者中预防心脏肥大和扩张性心肌病的方法，包括提升所述受试者的心脏细胞中的miR-29a-c的表达或活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种在有所需要的受试者中抑制心脏肥大进展的方法，包括提升所述受试者的心脏细胞中的miR-29a-c的表达或活性。

本发明还涵盖一种在受试者中治疗或预防组织纤维化的方法，包括鉴定具有组织纤维化或有组织纤维化风险的受试者；并提高所述受试者的骨骼肌或成纤维细胞细胞中的miR-29a-c的表达和/或活性。所述组织纤维化可以是心脏纤维化、硬皮病、骨骼肌纤维化、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、或糖尿病纤维化。在一些实施方案中，提高miR-29a-c的表达和/或活性包括给所述受试者施用miR-29a-c的激动剂。miR-29a-c的激动剂可以是包含成熟miR-29a、miR-29b、和/或miR-29c序列之序列的多核苷酸。所述miR-29a-c激动剂还可以是编码miR-29a、miR-29b、和/或miR-29c的表达载体。在一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用非miR-29a-c抗纤维变性疗法。

本发明还提供了一种鉴定miR-29a-c调控物的方法，包括使细胞接触候选化合物；评估miR-29a-c活性或表达；并比较步骤(b)中的活性或表达与不存在所述候选化合物时miR-29a-c的活性或表达，其中测量得到的miR-29a-c活性或表达间的差异指示所述候选化合物是miR-29的调控物。可以在体外或在体内使所述细胞接触所述候选化合物。合适的候选化合物包括蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。

本发明还涵盖一种药物组合物，其包含miR-29a-c的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，所述药物组合物可以是为注射或局部施用而配制的。用于局部施用的配制剂可以是凝胶(gel)、乳膏(cream)、洗剂(lotion)、或软膏剂(ointment)。

本发明提供了一种在组织中诱导胶原沉积的方法，包括使所述组织接触miR-29a-c的拮抗剂。所述拮抗剂可以是miR-29a、miR-29b、或miR-29c的拮抗剂。所述拮抗剂可以是miR-29a-c的小RNA拮抗剂(antagomir)、靶向成熟miR-29a-c序列的反义寡核苷酸、或包含与成熟miR-29a-c序列相同的序列的抑制性RNA分子(诸如siRNA或shRNA)、或核酶或其它抑制性核酸。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使所述组织接触第二药剂。所述第二药剂可以是局部维生素A、局部维生素C、或维生素E。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括对所述组织进行第二处理，诸如化学脱皮、激光处理、皮肤整平(dermaplaning)、或皮肤磨削术。在另一个实施方案中，所述组织在罹患埃勒斯一当洛综合征(Ehler’s-Danlos syndrome)或维生素C缺乏病的受试者中。

发明详述

心肌和骨骼肌通过调控肌球蛋白的调节收缩效率的各同等型的表达来响应多种病理生理刺激，诸如工作负荷、甲状腺激素信号传导和损伤。最近，发明人报告了一种心脏特异性微小RNA，即miR-208，它是由α-肌球蛋白重链(MHC)基因的内含子编码的，而且是在心脏中响应心脏压力而上调β-MHC表达和遏制快速骨骼肌基因所需要的(参见共同悬而未决的申请WO2008/016924，通过述及而完整收入本文)。

在此，发明人延伸了他们早先的工作，并且显示了miR-208还下调一个相关miRNA家族，即miR-29a-c。由于miR-29a-c遍在表达，而且涉及对胶原沉积的调节，因此调节miR-29a-c表达的策略可应用于预防多种组织纤维化，包括心脏纤维化，以及骨骼肌、肝、肺、糖尿病和肾纤维化。对心脏细胞(诸如心脏成纤维细胞)中miR-29a-c的调节可用于在受试者中治疗或预防心脏肥大或心力衰竭。如此，本发明的一个方面是对miR-29a-c表达或活性的激动，任选与抑制miR-208联合。激动可涉及将外源miR-29a-c导入心脏或其它感兴趣组织，或是直接使用裸的核酸或递送媒介物(vehicle)(诸如脂质/脂质体/纳米颗粒)，或是经由基因表达，例如通过使用腺病毒载体或其它异位表达手段，以降低纤维化。还涵盖经由药物“小分子”来激活miR-29a-c的抗纤维变性功能，正如用于鉴定此类化合物的筛选。

遏制miR-29a-c表达后，例如在心肌梗死(MI)和其它压力形式后发生的胶原增多可指示miR-29a-c的另一项作用。发明人的工作的一个焦点是心脏纤维化，而且对一个关键调节基因子集(即胶原I、III、弹性蛋白和微纤维蛋白)的检查显示了这两种胶原和微纤维蛋白响应miR-29a-c下调的惊人增多，而弹性蛋白没有增多。因此，治疗性遏制miR-29a-c来增加胶原沉积为解决以胶原丢失为特征的状况(诸如在化妆品应用和瘢痕形成)呈现了一个独特选项。

微小RNA 29(miR-29)是一个微小RNA家族，由4个已知成员组成，即miR-29a、b1和2(相同的)和c。虽然miR 29b-1和29a滋生自源自人类染色体7和小鼠染色体6的相同转录物，但是含有miR 29b-2和miR 29c的miRNA簇在这两种物种中都是自染色体1转录的。下面列出了每一个人类miR-29家族成员的成熟miRNA序列：

hsa-miR-29a uagcaccaucugaaaucgguua(SEQ ID NO：18)

hsa-miR-29b-1和b-2uagcaccauuugaaaucaguguu(SEQ ID NO：19)

hsa-miR-29c uagcaccauuugaaaucgguua(SEQ ID NO：20)

这些微小RNA基于它们的序列同源性而形成家族(Yu等；2006)。由于在家族各成员间只有微小的差异，而且各成员具有100％保守的种子区(其有助于限定靶物决定)，因此它们很有可能靶向相同的mRNA靶物(图18)，而且降低这些特定靶基因的基因表达。miR-29家族的靶物决定揭示了miR-29家族显示出对靶向涉及胶原形成的基因以及其它细胞外基质蛋白质(诸如诸如弹性蛋白(ELN)、微纤维蛋白1(FBN1)、胶原I型α1和α2(COL1A1，COL1A2)胶原III型α1(COL3A1)、金属肽酶、和整联蛋白)的高度偏爱。在响应病理压力时，心脏成纤维细胞和细胞外基质蛋白质不成比例地且过度地积累。心肌纤维化(所有形式的病理性肥大的一项特征)导致机械僵硬，这促成收缩功能障碍(Berk等，2007)。由于miR-29家族在此重塑过程期间下调，因此此家族有可能在对胶原沉积的调控中发挥积极作用，并由此调节心脏纤维化和心脏收缩性，这继发地能诱导肥大和病理性重塑。

正如先前所讨论的，miR-208表现出调节miR-29表达，因为miR-29在miR-208的两个拷贝都缺失的小鼠的心脏中显著上调(见实施例1)。如此，对miR-208的调控能影响miR-29的表达以及miR-29靶基因的表达。miR-208是位于α-MHC基因内含子内的内含子miRNA。精确的内含子位置取决于具体的物种和具体的转录物。例如，在人类中，miR-208是在α-MHC基因的第28内含子内编码的，而在小鼠中，它是在第29内含子内编码的。SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17中分别提供了人类、小鼠、大鼠、和犬的miR-208的pre-miRNA编码序列。SEQ ID NO：5中提供了成熟miR-208序列。像α-MHC一样，miR-208仅仅在心脏中表达(图1)。人pre-miR-208(SEQ ID NO：14)acgggcgagc ttttggcccg ggttatacct gatgctcacgtataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a

小鼠pre-miR-208(SEQ ID NO：15)acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacgtataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a

大鼠pre-miR-208(SEQ ID NO：16)acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacgtataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a

犬pre-miR-208(SEQ ID NO：17)acgcatgagc ttttggctcg ggttatacct gatgctcacgtataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a

使用用于鉴定miRNA靶物的PicTar算法(Krek等，2005)，发明人鉴定出甲状腺激素受体相关蛋白质1(THRAP1)作为miR-208的预测靶物。SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13中分别提供了来自人类、黑猩猩、小鼠、大鼠、犬、鸡、河豚、和斑马鱼的THRAP1 3′UTR序列。

人THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：6)uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuuaauuaa aaaguugcag uaggguugc

黑猩猩THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：7)uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc

小鼠THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：8)uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc

大鼠THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：9)uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc

犬THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：10)uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc

鸡THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：11)uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag uaggguugc

河豚THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：12)uuccugcuuu aagcaauugg uugaaaauauauguauguaa uggucuuaau uaaaaaaaca aacuaagaca aa

斑马鱼THRAP1 3′UTR(SEQ ID NO：13)uuccugcuuu aaagcaauug gucuaaaauauauguaaucg ucuucauuac aaaaacgaac caucaaacg

本发明提供了在有所需要的受试者中治疗心脏纤维化、心脏肥大或心力衰竭的方法，包括鉴定具有心脏纤维化、心脏肥大或心力衰竭的受试者；并对所述受试者施用miR-29表达或功能的激动剂。所述miR-29激动剂可以是miR-29a、miR-29b和/或miR-29c的激动剂。

在一个实施方案中，miR-29a-c的激动剂可以是包含成熟miR-29a-c序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：20。在另一个实施方案中，所述miR-29a-c激动剂可以是包含miR-29a、miR-29b、和/或miR-29c之pri-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。所述包含成熟miR-29a-c、pre-miR-29a-c、或pri-miR-29a-c序列的多核苷酸可以是单链的或双链的。所述多核苷酸可含有一处或多处化学修饰，诸如锁定核酸、肽核酸、糖修饰(诸如2′-O-烃基(例如2′-O-甲基、2′-O-甲氧乙基)、2′-氟、和4′-硫修饰)、和主链修饰(诸如一个或多个硫代硫酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯连接。在一个实施方案中，所述包含miR-29a-c序列的多核苷酸偶联有胆固醇。在另一个实施方案中，所述miR-29a-c激动剂可以是不同于miR-29a-c，起提高、补充、或代替miR-29a-c功能的作用的药剂。

在另一个实施方案中，可以在体内自载体表达所述miR-29a-c激动剂。“载体”指可用于将感兴趣核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知众多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子的或两亲性的化合物有关的多核苷酸、质粒、和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、等等。表达构建体能在活细胞中复制，或者它能合成制备。为了本申请，术语“表达构建体”、“表达载体”、和“载体”可互换使用，以一般性的、例示性的意义演示本发明的应用，而且并非意图限制本发明。

在一个实施方案中，用于表达miR-29a-c的表达载体包含与编码miR-29a、miR-29b、miR-29c、或其组合的多核苷酸“可操作连接”的启动子。在另一个实施方案中，所述多核苷酸可编码miR-29b-1/miR-29a簇。在另一个实施方案中，所述多核苷酸可编码miR-29b-2/miR-29c簇。如本文中所使用的，短语

“可操作连接”或“在转录控制下”意味着启动子相对于多核苷酸处于正确的定位和取向以控制RNA聚合酶进行的转录的和多核苷酸的表达的启动。编码miR-29a-c的多核苷酸可编码一级微小RNA-29a-c序列(pri-RNA-29a-c)、前体微小RNA-29a-c序列(pre-RNA-29a-c)或成熟RNA-29a-c序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：18。在另一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：19。在还有一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：20。所述包含序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、或SEQID NO：20的多核苷酸可以是长约18个至约2000个核苷酸、长约70个至约200个核苷酸、长约20个核苷酸至约50个核苷酸、或长约18个核苷酸至约25个核苷酸。

贯穿本申请，术语“表达构建体”意图包括任何类型的遗传构建体，其包含编码基因产物的核酸，其中部分或整个核酸编码序列能够被转录。一般而言，编码基因产物的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”指受到细胞的合成机械、或导入的合成机械识别，启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。

术语启动子在本文中会用于指在RNA聚合酶的启动位点周围聚簇的一组转录控制模块。关于如何组织启动子的许多思考衍生自对数种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的。这些研究(得到最近工作的扩充)显示了启动子是由离散功能模块构成的，其中每个模块由大约7-20bp DNA组成，且含有转录激活物或阻抑物蛋白质的一个或多个识别位点。

每种启动子中的至少一个模块发挥定位RNA合成起始位点的功能。这知道得最多的例子是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的启动子中，诸如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，与起始位点自身交叠的一个离散元件有助于固定启动位置。

别的启动子元件调节转录起始的频率。典型的是，这些位于起始位点上游30-11Obp的区域中，尽管许多启动子最近显示出在起始位点下游也含有功能元件。各启动子元件间的间距通常是灵活的，使得当各元件彼此相对被倒置或移动时启动子功能得到保留。在tk启动子中，各启动子元件间的间距能增加至相距50bp，之后活性才开始下降。取决于启动子，各元件表现出能协同地或独立地发挥激活转录的功能。

在其它实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子、RNA pol III启动子、和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子可用于获得感兴趣多核苷酸的高水平表达。还涵盖本领域公知的用于实现感兴趣多核苷酸表达的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的使用，只要表达水平对于给定目的是足够的。

通过采用具有公知特性的启动子，可优化转染或转化后感兴趣多核苷酸的表达水平和样式。另外，响应特定生理学信号而受到调节的启动子的选择能容许基因产物的诱导型表达。表1和表2列举了在本发明的背景中可采用来调节感兴趣基因表达的数种调节元件。此列表并非意图是穷尽提高基因表达所涉及的所有可能的元件，但是仅仅是它们的例示。

增强子是提高来自位于同一DNA分子上不同位置处的启动子的转录的遗传元件。增强子的组织与启动子很像。也就是说，它们由许多单独的元件构成，其中每个元件结合一种或多种转录蛋白。

增强子与启动子之间的基本区别是运作。增强子区作为整体必须能够刺激远处的转录；而启动子区或其构成元件不必如此。另一方面，启动子必须具有一种或多种指导特定位点处和特定取向的RNA合成启动的元件，而增强子缺少这些特异性。启动子和增强子常常是交叠的且毗邻的，常常表现出具有非常相似地模块组构。

下文是可以在表达构建体中与编码感兴趣基因的核酸组合使用的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表(表1和表2)。另外，也可以使用任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)来驱动所述基因的表达。如果提供适宜的细菌聚合酶(或是作为递送复合物的一部分或是作为另外的基因表达构建体)的话，真核细胞能支持来自某些细菌启动子的胞质转录。在一个优选的实施方案中，编码miR-29a-c或miR-29a-c拮抗剂的多核苷酸与成纤维细胞特异性启动子可操作连接。

在采用cDNA插入物的情况中，通常会希望包括聚腺苷酸化信号来实现基因转录物的正确聚腺苷酸化。认为聚腺苷酸化信号的本质对于本发明的成功实施不是至关重要的，而且可采用任何此类序列，诸如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。作为表达盒元件还涵盖终止子。这些元件能用来增强信息水平和自该盒进入其它序列的通读最小化。

在本发明的某些实施方案中，含有本发明核酸构建体的细胞可以在体外或在体内通过在表达构建体中包括标志物来鉴定。此类标志物会赋予细胞以可鉴定的变化，容许容易地鉴定含有表达构建体的细胞。通常，包括药物选择标志物有助于克隆和选择转化体，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志。或者，可采用酶，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。还能采用免疫学标志物。认为所采用的选择标志不是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择标志的其它例子是本领域技术人员公知的。

有多种方式可将表达载体导入细胞中。在本发明的某些实施方案中，表达构建体包含病毒或自病毒基因组衍生的工程改造的构建体。某些病毒经受体介导的胞吞进入细胞、整合入宿主细胞基因组和稳定且高效表达病毒基因的能力使得它们成为将外来基因转移入哺乳动物细胞中的诱人候选(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubinstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。

用于体内递送的优选方法之一涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意图包括那些含有足以(a)支持构建体的包装和(b)表达其中克隆的多核苷酸的腺病毒序列的构建体。表达载体包含遗传工程形式的腺病毒。关于腺病毒(一种36kB，线性，双链DNA病毒)的遗传组构的知识容许用长达7kB的外来序列替代大段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒形成对比，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以附加体方式复制，没有潜在的遗传毒性。而且，腺病毒在结构上是稳定的，而且广泛扩增后没有检测到基因组重排。腺病毒能感染实际上所有上皮细胞，不管它们的细胞周期阶段。

腺病毒特别适合于用作基因转移载体，因为它有中等大小的基因组、易于操作、滴度高、靶细胞范围广且感染性高。该病毒基因组的两个末端都含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，它们是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。

在腺病毒载体是复制缺陷的或至少条件性缺陷的要求之外，认为腺病毒载体的本质对于本发明的成功实施不是至关重要的。所述腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A-F中的任一种。为了获得供本发明中使用的条件性复制缺陷型腺病毒载体，亚群C的5型腺病毒是优选的起始材料。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，关于它知道极多的生化和遗传信息，而且它在历史上用于大多数采用腺病毒作为载体的构建。

如上所述，依照本发明的典型载体是复制缺陷的，而且不会具有腺病毒E1区。如此，在消除E1编码序列的位置导入编码感兴趣基因的多核苷酸会是最方便的。然而，腺病毒序列内插入构建体的位置对于本发明不是至关重要的。也可以将编码感兴趣基因的多核苷酸插入E3置换型载体中，代替被删除的E3区，如Karlsson等(1986)所述，或者在E4区中，在这种情况中辅助细胞系或辅助病毒补足E4缺陷。

腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。最近，动物研究提示重组腺病毒可用于基因疗法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。对不同组织施用重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和定向(stereotactic)接种入脑中(Le Gal La Salle等，1993)。

逆转录病毒载体也适合于在细胞中表达本发明的多核苷酸。逆转录病毒是以在受感染细胞中通过逆转录过程将它们的RNA转变成双链DNA的能力为特征的一组单链RNA病毒(Coffin，1990)。然后所得DNA稳定整合入细胞染色体中，作为原病毒，并指导病毒蛋白质的合成。所述整合导致病毒基因序列在受体细胞及其后代中的保持。逆转录病毒基因组含有分别编码壳体蛋白、聚合酶、和包膜成分的三种基因，即gag、pol、和env。在gag基因上游找到的一段序列含有将基因组包装入病毒体中的信号。在病毒基因组的5′和3′末端存在两段长末端重复(LTR)序列。这些含有强启动子和增强子序列，而且还是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组中，代替某些病毒序到，以生成复制缺陷型病毒。为了生成病毒体，构建含有gag、pol、和env基因但没有LTR和包装构件的包装细胞系(Mann等，1983)。当含有cDNA以及逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒被导入此细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列容许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒中，然后分泌入培养物的培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染极其多种细胞类型。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。

可采用其它病毒载体作为本发明中的表达构建体。可采用自诸如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒等病毒衍生的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供数项诱人特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送入细胞中。此递送可以在体外(像用于转化细胞系的实验室规程中)或者在体内或回体(像某些疾病状态的治疗中)实现。一种递送机制是经病毒感染，其中将表达构建体包裹在感染性病毒颗粒的壳体中。

本发明还涵盖用于将表达构建体转移入培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-右旋糖苷(Gopal，1985)、电穿孔、(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接显微注射、(Harland和Weintraub，1985)、加载了DNA的脂质体(Nicolau and Sene，1982；Fraley等，1979)和Lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理(Fechheimer等，1987)、使用高速微弹进行的基因轰击(Yang等，1990)、和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中的一些可成功适应体内或回体使用。

一旦已经将表达构建体递送入细胞中，编码感兴趣基因的核酸可以在不同部位定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可以稳定整合入细胞的基因组中。此整合可以经同源重组而处于相关定位和取向(基因替代)，或者它可以以随机的、非特异性的位置整合(基因增强)。在还有一些实施方案中，核酸可以作为分开的、附加型的DNA区段在细胞中稳定维持。此类核酸区段“附加体”编码足以容许不依赖宿主细胞周期地或与宿主细胞周期同步地维持和复制的序列。如何将表达构建体递送至细胞和核酸在细胞中保持在何处取决于所采用的表达构建体的类型。

在本发明的还有一个实施方案中，表达构建体可以仅仅由裸的重组DNA或质粒组成。所述构建体的转移可以通过上文所述物理或化学透化细胞膜的任何方法来实施。这特别适用于体外转移，但是它也可应用于体内使用。Dubensky等(1984)成功地以磷酸钙沉淀物的形式将多瘤病毒DNA注射入成年和新生小鼠的肝和脾中，展现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明了直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致所转染基因的表达。也可以在体内以相似方式转移编码感兴趣基因的DNA并表达基因产物。

在本发明的还有一个实施方案中，将裸的DNA表达构建体转移入细胞中可涉及颗粒轰击。此方法依赖于将DNA包被的微弹加速至高速的能力，所述高速容许微弹穿透细胞膜并进入细胞，但不杀死它们(Klein等，1987)。已经开发了数种用于加速小颗粒的装置。一种这样的装置依赖于高压放电来产生电流，该电流继而提供原动力(Yang等，1990)。所使用的微弹由生物学惰性物质组成，诸如钨或金珠。

已经在体内轰击了大鼠和小鼠的选定器官，包括肝、皮肤、和肌肉组织(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能要求手术暴露组织或细胞，以消除枪与靶器官之间的任何居间组织，即回体处理。再次，编码特定基因的DNA可以经此方法递送，而且仍然收入本发明。

在本发明的又一个实施方案中，可以将表达构建体封装在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有多个由水介质隔开的脂质层。它们在将磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质成分在形成闭合的结构之前经历自我重排并在脂质双层间封装水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还涵盖Lipofectamine-DNA复合物。

体外脂质体介导的核酸递送和外来DNA表达已经非常成功。Wong等，(1980)在培养的鸡胚、HeLa和肝瘤细胞中证明了脂质体介导的外来DNA递送和表达的可行性。Nicolau等，(1987)在大鼠中在静脉内注射后实现了成功的脂质体介导的基因转移。

在本发明的某些实施方案中，可以将脂质体与血细胞凝集病毒(HVJ)复合。这显示出促进与细胞膜的融和和提升脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它实施方案中，可以将脂质体与细胞核中非组蛋白的染色体蛋白质(HMG-I)复合或联合采用(Kato等，1991)。在还有一些实施方案中，可以将脂质体与HVJ和HMG-I二者复合或联合采用。由于此类表达构建体已经成功用于体外和体内核酸转移和表达，所以它们适用于本发明。在DNA构建体中采用细菌启动子的情况中，还会希望在脂质体内包括适宜的细菌聚合酶。

其它能采用来将编码特定基因的核酸递送入细胞中的表达构建体是受体介导的递送媒介物。这些利用几乎在所有真核细胞中的受体介导的胞吞对高分子的选择性摄取。因为各种受体的细胞类型特异性分布，所以所述递送会是高度特异性的(Wu和Wu，1993)。

受体介导的基因靶向媒介物一般由两种成分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。数种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和运铁蛋白(Wagner等，1990)。最近，一种合成的拟糖蛋白(neoglycoprotein)(其与ASOR识别相同受体)已经用作基因递送媒介物(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而且表皮生长因子(EGF)也已经用于将基因递送至鳞癌细胞(Myers，EPO 0273085)。

在其它实施方案中，递送媒介物可包含配体和脂质体。例如，Nicolau等(1987)采用掺入脂质体中的乳糖基-神经酰胺(一种末端为半乳糖的脱唾液酸的神经节苷脂)，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加。如此，可行的是也可以通过多种受体-配体系统在有或无脂质体的情况中将编码特定基因的核酸特异性递送入某细胞类型中。例如，表皮生长因子(EGF)可用作受体，用于介导将核酸递送入展现出EGF受体上调的细胞中。甘露糖可用于靶向肝细胞上的甘露糖受体。而且，针对CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T细胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗体能类似地用作靶向模块。

在一个具体的例子中，可以与阳离子脂质组合地施用寡核苷酸。阳离子脂质的例子包括但不限于Lipofectin、DOTMA、DOPE、和DOTAP。WO/0071096(通过述及明确收入本文)的公开文本记载了不同配制剂，诸如能有效用于基因疗法的DOTAP：胆固醇或胆固醇衍生物配制剂。其它公开文本也讨论了不同脂质或脂质体配制剂，包括纳米颗粒和施用方法；这些包括但不限于美国专利公开文本20030203865，20020150626，20030032615，和20040048787，通过述及明确收入本文，其程度为它们公开了施用和递送核酸的配制剂和其它相关方面。用于形成颗粒的方法还记载于美国专利5,844,107，5,877,302，6,008,336，6,077,835，5,972,901，6,200,801，和5,972,900，那些方面通过述及而收入本文。

在某些实施方案中，可以在回体(ex vivo)条件下更容易地实施基因转移。回体基因疗法指自动物分离细胞，在体外将核酸递送入细胞中，然后将经修饰的细胞返还入动物中。这可涉及自动物手术取出组织/器官或细胞和组织的原代培养。

在本发明的一些实施方案中，希望抑制miR-29a-c的表达或活性以提高胶原沉积。例如，在一个实施方案中，本发明提供了诱导组织中的胶原沉积的方法，包括使所述组织接触miR-29a-c的拮抗剂。miR-29a-c功能的拮抗剂或抑制剂可以是针对miR-29a、miR-29b和/或miR-29c。

miRNA的功能可通过小RNA拮抗剂的施用来抑制。最初由Krutzfeldt及其同事(Krützfeldt等，2005)记载，“小RNA拮抗剂”指单链的、经化学修饰的、至少部分与miRNA序列互补的核糖核苷酸。小RNA拮抗剂会含有一个或多个经修饰的核苷酸，诸如2′-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，小RNA拮抗剂仅包含经修饰的核苷酸。小RNA拮抗剂也可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，导致部分或完全是硫代磷酸酯的主链。为了促进体内递送和稳定性，可以在其3′端将小RNA拮抗剂连接至胆固醇模块。适合于抑制miRNA的小RNA拮抗剂可以长约15个至约50个核苷酸，更优选长约18个至约30个核苷酸，且最优选长约20个至约25个核苷酸。“部分互补”指某序列与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。小RNA拮抗剂可以与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，小RNA拮抗剂可以与成熟miRNA序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在其它实施方案中，小RNA拮抗剂与成熟miRNA序列100％互补。

在一个实施方案中，miR-29a-c拮抗剂是小RNA拮抗剂。小RNA拮抗剂可包含与miR-29a、miR-29b、或miR-29c的成熟miRNA序列至少部分互补的序列。在另一个实施方案中，小RNA拮抗剂包含与序列SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、或SEQ ID NO：20至少部分互补的序列。在另一个实施方案中，小RNA拮抗剂包含与SEQ ID NO：18、SEQ ID No：19、或SEQ ID NO：20100％互补的序列。

对微小RNA功能的抑制也可以通过施用靶向成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列的反义寡核苷酸来实现。所述反义寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选的是，所述反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰。反义寡核苷酸可以包含一个或多个“锁定核酸(locked nucleic acid)”。“锁定核酸”(LNA)指经修饰核糖核苷酸，它在核糖糖模块的2′和4′碳之间含有额外桥接，导致赋予含有LNA的寡核苷酸以增强的热稳定性的“锁定”构象。或者，所述反义寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链，而非糖-磷酸酯主链。反义寡核苷酸可含有的其它化学修饰包括但不限于糖修饰，诸如2′-O-烃基(alkyl)(例如2′-O-甲基、2′-O-甲氧乙基)、2′-氟、和4′-硫修饰，及主链修饰，诸如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参加例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，通过述及而完整收入本文)。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2′-O-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5′和3′端都含有2′-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，且中央有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚物”能够触发RNA酶H依赖性的对RNA靶物的降解机制。增强稳定性和提高功效的对反义寡核苷酸的其它修饰(诸如美国专利No.6,838,283中记载的那些，通过述及而完整收入本文)是本领域已知的，而且适合于在本发明的方法中使用。对抑制微小RNA的活性有用的优选反义寡核苷酸长约19个至约25个核苷酸。反义寡核苷酸可包含至少部分与成熟miRNA序列互补的序列，例如与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸可以与成熟miRNA序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100％互补的序列。

在本发明的另一个实施方案中，miR-29a-c拮抗剂是经化学修饰的反义寡核苷酸。所述经化学修饰的反义寡核苷酸可包含与miR-29a、miR-29b、或miR-29c的成熟miRNA序列至少部分互补的序列。在又一个实施方案中，所述经化学修饰的反义寡核苷酸包含与序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：20至少部分互补的序列。在另一个实施方案中，所述经化学修饰的反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、或SEQ ID NO：20 100％互补的序列。

反义寡核苷酸可包含与miR-29a-c的前体miRNA序列(pre-miRNA)基本上互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与位于pre-miR-29a、pre-miR-29b、或pre-miR-29c序列的茎环区以外的序列基本上互补的序列。

用于抑制miR-29a-c的功能的另一种办法是施用与成熟miR-29a、miR-29b和miR-29c序列具有至少部分序列同一性的抑制性RNA分子。所述抑制性RNA分子可以是双链小干扰RNA(siRNA)或包含茎环结构的短发夹RNA分子(shRNA)。所述抑制性RNA分子的双链区可包含与成熟miRNA序列至少部分相同，例如约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。在一些实施方案中，所述抑制性RNA的双链区包含与成熟miRNA序列至少基本上相同的序列。“基本上相同”指某序列与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％相同。在其它实施方案中，所述抑制性RNA分子的双链区可以与靶miRNA序列100％相同。

在一个实施方案中，miR-29a-c的拮抗剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-29a(SEQ ID NO：18)、miR-29b(SEQ IDNO：19)、或miR-29c(SEQ ID NO：20)序列具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，miR-29a-c的拮抗剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

在另一个实施方案中，抑制性RNA分子可以是核酶。核酶指水解RNA分子之磷酸二酯键的催化性RNA。核酶可以设计成靶向miR-29a、miR-29b、和miR-29c中的一种或多种，导致它们的水解。

在某些实施方案中，采用表达载体来表达miR-29a-c的拮抗剂(例如小RNA拮抗剂、反义寡核苷酸、和抑制性RNA分子)。在一个实施方案中，用于表达miR-29a-c拮抗剂的表达载体包含与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作连接的启动子，其中所表达的反义寡核苷酸的序列与成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列至少部分互补。在又一个实施方案中，用于表达miR-29a-c抑制剂的表达载体包含与编码shRNA或siRNA的多核苷酸可操作连接的一个或多个启动子，其中所表达的shRNA或siRNA包含与成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列相同、部分相同、或基本上相同的序列。“部分相同”指某序列与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。“基本上相同”指某序列与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％相同。

心血管病症背景中的心脏肥大的当前医学管理包括使用至少两种类型的药物：肾素-血管紧张素系统的抑制剂，和β-肾上腺素能阻断剂(Bristow，1999)。用于治疗心力衰竭背景中的病理性肥大的治疗剂包括血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂和β-肾上腺素能受体阻断剂(Eichhom和Bristow，1996)。已经公开的用于治疗心脏肥大的其它药剂包括血管紧张素II受体拮抗剂(美国专利5,604,251)和神经肽Y拮抗剂(WO 98/33791)。不管当前可得的药用化合物，对心脏肥大和后续心力衰竭的预防和治疗继续呈现治疗考验。

非药理学治疗主要作为药理学治疗的辅助方法使用。非药理学治疗的一种手段涉及减少饮食中的钠。另外，非药理学治疗还需要消除某些沉淀性药物，包括负性肌力药(例如某些钙通道阻滞剂和抗心率不齐药像丙吡胺(disopyramide))、心脏毒素(例如安非他明(amphetamine)、和血容量扩充药(plasma volume expander)(例如非类固醇抗炎药和糖皮质激素)。

本发明提供了在有所需要的受试者中治疗心脏纤维化、心脏肥大或心力衰竭的方法，包括鉴定具有心脏纤维化、心脏肥大或心力衰竭的受试者；并对所述受试者施用miR-29表达或功能的激动剂。优选的是，miR-29激动剂的施用导致受试者中病理性心脏纤维化、肥大或心力衰竭的一种或多种症状的改善，或心脏肥大转变成心力衰竭延迟。所述一种或多种得到改善的症状可以是提高的运动能力、升高的心脏射血体积、降低的左心室舒张末期压、降低的肺毛细血管楔压、升高的心输出量或心指数、降低的肺动脉压、降低的左心室收缩和舒张末期内径、降低的心脏纤维化、降低的胶原在心脏肌肉中的沉积、降低的左和右心室壁压、降低的壁张力、提高的生命质量、和降低的疾病相关发病率或死亡率。另外，miR-29a-c激动剂的使用可直接或间接预防心脏肥大及其相关症状发生。

在另一个实施方案中，提供了在有所需要的受试者中预防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括鉴定有风险发生病理性心脏肥大或心力衰竭的受试者；并提高所述受试者的心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。心脏细胞包括心脏肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、和任何其它在正常情况中在心脏组织中找到的细胞类型。miR-29a-c激动剂可以是miR-29a、miR-29b和/或miR-29c的激动剂。有风险的受试者可展现出风险因素列表中的一种或多种，包括心脏纤维化、低miR-29表达、长期存在的不受控制的高血压、未矫正的瓣膜病、慢性心绞痛、近期的心肌梗死、对心脏病的先天性素因和/或病理性肥大、和/或可以诊断为具有对心脏肥大的遗传素因和/或可具有心脏肥大的家族史。

在另一个实施方案中，提供了在有所需要的受试者中治疗心肌梗死的方法，包括提高所述受试者心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。在另一个实施方案中，本发明提供了在有所需要的受试者中预防心脏肥大和扩张性心肌病的方法，包括提高所述受试者的心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。在另一个实施方案中，本发明提供了在有所需要的受试者中抑制心脏肥大进展的方法，包括提高所述受试者的心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。另一个实施方案是在具有心力衰竭或心脏肥大的受试者中提高运动耐量的方法，包括提高所述受试者的心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。另一个实施方案是在具有心力衰竭或心脏肥大的受试者中减少住院治疗的方法，包括提高所述受试者的心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。在一些实施方案中，本发明提供了在具有心力衰竭或心脏肥大的受试者中提高生命质量和降低发病率或死亡率的方法，包括提高所述受试者的心脏细胞中miR-29a-c的表达或活性。

治疗方案会随临床情形而变化。然而，长期维持在大多数情形中会是适宜的。可能还希望间歇地用miR-29a-c的激动剂治疗肥大，诸如在疾病进展期间的短暂窗口内。

另外，miR-29家族涉及对心脏纤维化的调节。由于此miR家族在成纤维细胞中与在肌细胞中相比更富集，因此有可能的是肌细胞分泌一种因子，可能是BNP，其上调成纤维细胞中的miR-29家族，并如此针对心脏纤维化的形成提供保护。此因子在miR-208KO小鼠中很高，与miR-29a-c的上调和纤维化的遏制有关联。miR-29a-c水平在普通心脏病中升高，这有可能是限制胶原沉积的一种保护效应。如此，涵盖miR-29a-c及其激动剂在遏制心脏纤维化和心脏组织中的胶原沉积中的具体用途。同样，激活miR-29家族的相应机制可应用于骨骼肌纤维化。miR-29a-c调节多种细胞外基质基因的表达，诸如微纤维蛋白1(FBN1)、胶原I型α1(COL1A1)、胶原I型α2(COL1A2)、和胶原III型α1(COL3A1)(见实施例4)。因而，本发明还提供了调节细胞中的一种或多种细胞外基质基因的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括使细胞接触miR-29a-c的激动剂。在另一个实施方案中，所述方法包括使细胞接触miR-29a-c的拮抗剂。在还有一个实施方案中，所述一种或多种细胞外基质基因包括微纤维蛋白1(FBN1)、胶原I型α1(COL1A1)、胶原I型α2(COL1A2)、和胶原III型α1(COL3A1)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞外基质基因在细胞接触miR-29a-c拮抗剂后上调。在其它实施方案中，所述一种或多种细胞外基质基因在细胞接触miR-29a-c激动剂后下调。

发明人证明了miR-29a-c表达在暴露于TGFβ的心脏成纤维细胞中降低，提示心肌梗死后的miR-29a-c降低可能受TGFβ调节(实施例5)。有趣的是，利钠肽(像B型利钠肽(BNP))显示出抑制与纤维化和肌成纤维细胞转变有关的受TGFβ调节的基因表达(Kapoun等，2004)。在这点上，发明人先前报告了心脏特异性miRNA miR-208缺失的小鼠对心脏纤维化和重塑有抗性且在基线时展现出升高的BNP表达(van Rooij等，2007)。由于已知BNP拮抗TGFβ的效果，因此发明人提出这些小鼠中升高的BNP水平可能增强miR-29a-c的表达。确实，在消除miR-208后观察到miR-29a-c表达的剂量依赖性升高，与BNP表达水平升高一致(实施例5)。这些数据指示TGFβ诱导成纤维细胞中胶原相关基因的表达，这至少部分经由降低miR-29a-c水平来进行，而miR-29a-c能通过由心肌细胞分泌的BNP来抑制。如此，本发明提供了通过施用至少一种TGFβ抑制剂在受试者中提高miR-29a-c表达和/或活性的方法。TGFβ抑制剂可包括抑制TGFβ活性的抗TGFβ抗体、TGFβ反义分子、和小分子，如美国专利No.6,509,318中所记载的，通过述及完整收入本文。TGFβ抑制剂还可与miR-29a-c激动剂联合使用，作为组合疗法用于在受试者中治疗心脏纤维化、心脏肥大、或心力衰竭。TGFβ抑制剂还可与miR-29a-c激动剂共施用，用以在受试者中治疗或预防组织纤维化。

除了在控制心脏中的纤维化中发挥重要作用之外，miR-29家族的遍在表达提示它还可能在其它纤维变性适应症中发挥作用，诸如那些涉及肾、肝和肺的。还观察到糖尿病继发的纤维化。1型和2型糖尿病患者处于升高的心肌病风险。糖尿病中的心肌病与一簇特征有关，包括降低的舒张顺应(diastoliccompliance)、间质纤维化、和肌细胞肥大。

本发明还提供了在受试者治疗或预防组织纤维化的方法。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定具有组织纤维化或有组织纤维化风险的受试者；并提高所述受试者的骨骼肌细胞或成纤维细胞中的miR-29a-c的表达和/或活性。在另一个实施方案中，所述组织纤维化是心脏纤维化、硬皮病(局限性的或系统性的)、骨骼肌纤维化、肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、或糖尿病纤维化。在一些实施方案中，提高miR-29a-c的表达和/或活性包括给所述受试者施用miR-29a-c的激动剂。在其它实施方案中，提高miR-29a-c的表达和/或活性包括给所述受试者施用编码miR-29a-c的表达载体。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用非miR-29a-c纤维变性疗法。

本发明涵盖在有所需要的受试者中治疗与一种或多种疾患或病症有关的组织纤维化的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用miR-29a-c的激动剂。在另一个实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用编码miR-29a-c的表达载体。所述与组织纤维化有关的一种或多种疾患或病症可包括但不限于先天性肝纤维化(CHF)；肾小管间质性纤维化；与自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、狼疮和结节病)有关的肺纤维化；与糖尿病心肌病有关的间质纤维化；与肌肉营养不良(例如贝克肌营养不良和迪谢内肌营养不良)有关的骨骼肌纤维化、去神经萎缩、和神经肌肉疾病(例如急性多神经炎、脊髓灰质炎、Werdig/Hoffman病、肌萎缩侧索硬化、和进行性延髓萎缩疾病)。

本发明还涵盖治疗以胶原流失、缺失、或生成不足为特征的病理/缺陷的方法。使用miR-29a-c的拮抗剂，能提高胶原的表达用以在有需要的部位替换流失的胶原或补充现有的胶原。如此，本发明提供了诱导组织中的胶原沉积的方法，包括使所述组织接触miR-29a-c的拮抗剂。所述拮抗剂可以针对miR-29a、miR-29b和/或miR-29c。在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与SEQID NO：18互补的序列。在另一个实施方案中，所述拮抗剂包含与SEQ ID NO：19互补的序列。在另一个实施方案中，所述拮抗剂包含与SEQ ID NO：20互补的序列。所述拮抗剂可以是miR-29a-c的小RNA拮抗剂、靶向成熟miR-29a-c序列的反义寡核苷酸、或包含与成熟miR-29a-c序列相同的序列的抑制性RNA分子(诸如siRNA或shRNA)、核酶或任何其它抑制性核酸。所述拮抗剂可以连接或偶联有促进所述拮抗剂进入细胞或组织的药剂。提高胶原沉积会是有益的且能通过施用miR-29a-c拮抗剂来治疗的各种疾患和病症包括但不限于埃勒斯-当洛综合征(EDS)；维生素C缺乏病(也称作坏血病)；皮肤老化(例如自然老化和由于晒伤的光老化)；和拉伸纹(stretch mark)(细沟(striae))。

埃勒斯-当洛综合征(EDS)是一组由胶原合成缺陷引起的、影响人类和家畜的罕见遗传病症。根据个体突变，疾病的严重程度可以自轻度至危及生命而变化。ADAMTS2、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A1、COL5A2、PLOD1和TNXB基因中的突变引起EDS。这些基因中的突变通常改变胶原的或与胶原相互作用的蛋白质的结构、生成、或加工。胶原缺陷能削弱皮肤、骨骼、血管、和器官中的结缔组织，导致病症的特征。如此，由本发明的miR-29a-c拮抗剂诱导的胶原沉积会起补充EDS患者中的正常胶原水平和减轻疾病症状的作用。类似地，施用miR-29a-c的拮抗剂会有益于罹患维生素C缺乏病或坏血病的受试者。维生素C缺乏病是一种源自维生素C摄取不足的疾病，而维生素C是人类中正常胶原合成所需要的。

组织中源自miR-29a-c拮抗剂施用的胶原沉积还会在各种化妆品应用中有用。由自然老化过程或过度暴露于阳光所致光损伤产生的皮肤老化的效果能通过给有所需要的受试者施用miR-29a-c拮抗剂来降低。施用miR-29a-c拮抗剂还可促进拉伸纹的消失。拉伸纹是皮肤上由真皮撕裂引起的一种瘢痕形成形式。拉伸纹是与快速生长(青春期常见)或体重增加(例如妊娠)有关的皮肤快速拉伸的结果。

本发明的方法可应用的组织包括面部组织，诸如额组织、唇、颊、颏、眉、眼睑、眼下、或口附近、手组织、颈组织、臂组织、腿组织、胃组织或乳房组织。在一些实施方案中，所述组织可包含伤口、皮肤移植物、瘢痕组织、皱纹、皮肤松垂、晒伤、化学损伤、烫伤、冻伤、和/或拉伸纹。

在本发明的另一个实施方案中，使组织接触miR-29a-c拮抗剂包括注射入所述组织中、注射入供应所述组织的脉管系统中、或局部应用。局部应用可以是软膏剂、乳膏、凝胶、油膏剂、或香膏。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括使用压迫绷带或裹覆物(dressing)。可以使miR-29a-c拮抗剂接触所述组织超过一次。在一些实施方案中，拮抗剂接触所述组织2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100次。在其它实施方案中，拮抗剂接触所述组织超过2、3、4、5、或6天，1、2、3、或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，或1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25年。

在还有一个实施方案中，所述方法进一步包括使所述组织接触第二药剂。所述第二药剂可包括但不限于局部维生素A、局部维生素C、或维生素E。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括对所述组织进行第二处理。所述第二处理可包括化学脱皮、激光处理、皮肤整平、或皮肤磨削术。在另一个实施方案中，所述组织在罹患埃勒斯-当洛综合征或维生素C缺乏病的受试者中。

本发明还涵盖miR-29a-c拮抗剂作为促纤维变性剂用于将脉管系统中的软斑转变成纤维变性组织以预防心肌梗死的用途。软斑是位于动脉壁的内皮衬里下面、主要含有胆固醇的脂质的构造。最近，认识到这些软斑倾向于破裂，导致血凝块的形成，其能潜在地阻断通过该动脉的血流并引起心脏病发作(即心肌梗死)。正是这些软斑常常负责引起没有症状的健康受试者遭受表面上出乎意料的心脏病发作。软斑破裂后，血管壁愈合而软斑变成硬斑，这罕见地引起进一步的问题。如此，使软斑转变成纤维变性组织的策略会预防软斑破裂且可能诱发的心肌梗死。

正如上文详细描述的，对miR-29a-c的抑制导致胶原沉积的和纤维变性组织形成的增加。因而，本发明提供了用于增加血管壁中的纤维变性组织形成的方法，包括将miR-29a-c的拮抗剂递送至血管壁中的一个或多个软斑部位，其中在递送所述miR-29a-c拮抗剂后，所述软斑转变成纤维变性组织。软斑可以通过本领域已知方法来鉴定，包括但不限于血管内超声和计算机断层照相术(Sahara等(2004)European Heart Journal，Vol.25：2026-2033；Budhoff(2006)J.Am.Coll.Cardiol，Vol.48：319-321；Hausleiter等(2006)J.Am.Coll.Cardiol，Vol.48：312-318)。本文所述任何miR-29a-c拮抗剂适合于在所述方法中使用。

可以通过直接注射或通过使用导管或分离冠状循环的装置将miR-29a-c拮抗剂递送至一个或多个软斑部位。在一个实施方案中，通过血管手术中使用的医学装置(诸如支架或球囊)将miR-29a-c拮抗剂递送至一个或多个软斑部位。可以将miR-29拮抗剂包被在金属支架上以形成药物洗脱支架。药物洗脱支架是保持变窄的或患病的动脉开放并释放化合物以预防细胞增殖和/或炎症的支架。可以将miR-29a-c拮抗剂应用至埋藏在薄聚合物中的金属支架以随时间释放miR-29a-c。用治疗性化合物包被支架的方法是本领域已知的。参加例如美国专利No.7,144,422；美国专利No.7,055,237；和WO 2004/004602，通过述及完整收入本文。在一些实施方案中，miR-29a-c可以与其它抗再狭窄化合物组合使用以生成用于掺入药物洗脱支架和球囊中的配制剂。适合与miR-29a-c拮抗剂组合使用的化合物包括但不限于帕利他塞(paclitaxel)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))、他克莫司(tacrolimus)、唑他莫司(zotarolimus)、依维莫司(everolimus)、多西他塞(docetaxel)、吡美莫司(pimecrolimus)、及其衍生物。

本发明还涵盖用于在治疗后清除或消除miR-29a-c激动剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用成纤维细胞特异性启动子在成纤维细胞中过表达miR-29a-c的结合位点区。所述结合位点区优选含有miR-29a-c的种子区的序列。在一些实施方案中，所述结合位点可含有来自miR-29a-c的一种或多种靶物3′UTR的序列，诸如COL1A1、COL1A2、COL1A3和/或FBN1。在另一个实施方案中，可以在miR-29a-c激动剂之后施用miR-29a-c拮抗剂以削弱或终止微小RNA的功能。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在治疗后清除或消除miR-29a-c拮抗剂的方法。所述方法可包括在施用了miR-29a-c拮抗剂的成纤维细胞或其它组织中过表达miR-20a-c拮抗剂的结合位点。

组合疗法

在另一个实施方案中，与其它用于治疗心脏肥大、心力衰竭和心肌梗死的治疗形态组合地使用miR-29a-c的激动剂。如此，还可以给受试者提供与miR-29a-c激动剂组合的更多“标准”制药学心脏疗法。其它疗法的例子包括但不限于所谓的“β-阻滞剂”、抗高血压药、强心药、抗血栓药、血管扩张药、激素拮抗剂、肌力药(iontrope)、利尿药、内皮缩血管肽受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、磷酸二酯酶抑制剂、ACE抑制剂、血管紧张素2型拮抗剂和细胞因子阻滞剂/抑制剂、和HDAC抑制剂。

可以如下实现组合，即使心脏细胞接触包括miR-29a-c的激动剂和标准药剂的单一组合物或药理学配制剂，或者使细胞同时接触两种不同组合物或配制剂，其中一种组合物包括miR-29a-c的激动剂，而另一种包括标准药剂。或者，所述使用miR-29a-c激动剂的疗法可以在另一药剂的施用之前或之后，间隔范围为数分钟至数周。在分开对细胞应用标准药剂和miR-29a-c激动剂的实施方案中，一般会确保每次递送的时间之间没有经过显著的一段时间，使得所述药剂和miR-29a-c激动剂会仍然能够有利地对细胞发挥组合效应。在此类情况中，通常会使细胞在相距约12-24小时、更优选在相距约6-12小时内接触两种形态，延迟时间最优选只有约12小时。然而，在一些情况中，可能希望显著延长治疗时间段，其中各施用间经过数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

也想得到的是会希望超过一次地施用miR-29a-c激动剂、或另一药剂。在这点上，可以采用各种组合。举例而言，在miR-29a-c激动剂为“A”而另一药剂为“B”的情况中，下列基于总共3次和4次施用的排列是例示性的：

A/B/A  B/A/B B/B/A A/A/B  B/A/A  A/B/B  B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B同样涵盖其它组合。

药理学治疗剂和施用方法、剂量、等是本领域技术人员公知的(参加例如《Phys

调控纤维化的微小RNA家族及其用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。