专利摘要

本发明公开了一种利用赖氨酸芽孢杆菌控制白酒中氨基甲酸乙酯的方法，属于酒类酿造以及食品安全领域。本发明将一株同时具有降解EC及其前体尿素的球形赖氨酸芽孢杆菌CGMCCNO.13046应用于白酒酿造，能显著抑制白酒生产中EC及其前体尿素的含量，最终降低白酒中的EC含量，属于食品微生物学技术领域。球形赖氨酸芽孢杆菌CGMCCNO.13046来源于白酒酿造过程中，能够耐高温，耐酸，耐乙醇，同时产生醇类、酸类挥发性物质，应用于白酒生产中，可以有效控制白酒中的EC含量，从根本上控制不同香型白酒中的EC含量，且提高白酒品质。 CGMCCNO.13046 20160926

权利要求

1.一株能够降解尿素和EC的球形赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述球形赖氨酸芽孢杆菌已于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13046。

2.一种利用权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌降低酒类产品中氨基甲酸乙酯和/或尿素的方法，其特征在于，所述方法是将球形赖氨酸芽孢杆菌添加到酒类产品的制备过程中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酒类产品包括酿造酒、蒸馏酒。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酒类产品为白酒。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是将CGMCC NO.13046菌株以液体培养物或固体培养物形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵酒醅中；菌株以单独接种或与其他微生物按不同混合比例接种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌株液体培养物总接种量为0.1％～20％(v/w)，菌株固体培养物总接种量为0.1％～20％(w/w)。

7.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述的CGMCC NO.13046菌株。

8.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有CGMCC NO.13046菌体的活细胞、冷冻干燥得到的CGMCC NO.13046干菌体、固定化的CGMCC NO.13046细胞、CGMCC NO.13046的液体菌剂、CGMCC NO.13046的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的CGMCC NO.13046菌株。

9.根据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任何能够应用于食品或者食品制备的任意种属的菌株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用赖氨酸芽孢杆菌控制白酒中氨基甲酸乙酯的方法，属于酒类酿造以及食品安全领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(EC)具有遗传毒性和致癌性，为2A类致癌物。EC广泛存在于多种发酵食品(面包、酸奶、酱、醋、奶酪)和酒精饮料(如黄酒、啤酒、葡萄酒、清酒等酿造酒；威士忌、白兰地、巴西甘蔗酒等蒸馏酒)中，为人们的日常饮食带来了极大的安全隐患。

白酒是我国特有的一种蒸馏酒，并深得消费者喜爱。年产量达到1300万吨左右。白酒作为我国特色的传统发酵食品，其EC控制的问题还有待于深入开展，也缺乏限量标准。目前，欧美主要国家粮食蒸馏酒威士忌限量标准为150μg/L。研究报道我国不同白酒中均存在EC，且部分白酒EC含量在150μg/L左右。因此，中国白酒EC问题严重，亟待控制解决。

发酵食品中的EC普遍被认为来源于氨甲酰类化合物与乙醇的反应，主要有四种途径：(1)由尿素途径生成EC；(2)由氰化物途径生成EC；(3)瓜氨酸等前体物质醇解生成EC；(4)添加剂途径生成EC。白酒发酵过程中尿素是EC产生的主要前体。

已有报道采用能够同时降解尿素和氨基甲酸乙酯的耐乙醇双功能酶在黄酒生产中的应用，但是由于黄酒酒度较低，而白酒酒度一般在46％(v/v)以上，即使低度酒酒度也在30％(v/v)以上，任何酶分子属于蛋白，蛋白在该体系中都会失活，因此该方法无法应用于白酒中。

酵母是尿素产生的关键微生物。目前通过低产尿素酵母的选育与应用，降低了白酒生产中EC的产生。但是，白酒发酵由于为群体发酵过程，多种酵母均能代谢产生尿素，因此单一改造某一种酵母难以实现对尿素产生的控制，因此直接采用国际现有控制酵母低产的方法仍难以进行有效控制，而采用尿素降解的方式则更有有利。但是由于白酒属于群体发酵，且发酵环境恶劣，常规的尿素降解菌由于无法耐受恶劣环境而发挥作用；同时，由于白酒属于嗜好性食品，风味是影响产品品质的关键特点。常规的尿素降解菌可能会对白酒产品的风味品质有所影响，而造成不利因素。

目前有关于采用纺锤形赖氨酸芽孢杆菌降解酱油中EC的应用报道，但是该菌来源于小鼠肠道，仅能耐受15％NaCl的高渗环境，而无法应用于白酒酿造中的高酸、高醇和高温的环境，无法保证在白酒生产中有效降低EC浓度，同时该菌的风味特征也不清晰，无法保证对白酒品质不造成负向影响，并且该菌的安全性无法保证。

发明内容

为了解决上述问题，本发明从白酒酿造酒醅中筛选到一株能够耐受白酒酿造恶劣环境，同时产生有利风味物质的球形赖氨酸芽孢杆菌，该菌能够有效降解尿素以及EC，将该菌在白酒酿造中应用，可以有效降解白酒酒醅中的尿素和EC的含量，最终降低白酒中的EC的含量。

本发明的第一个目的是提供一株能够降解尿素和EC的球形赖氨酸芽孢杆菌，来源于中国白酒高温大曲，其分类命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，已于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13046。

所述球形赖氨酸芽孢杆菌菌株的特征是：

(1)耐高温(60℃)，耐酸(pH 3.4)，耐乙醇(10％)，能够在白酒酿造过程中的胁迫条件(制曲最高温度达50～60℃；发酵酒醅pH 3.5～4.0之间；乙醇最高达7％左右)生长，可发酵麸皮、大麦、小麦、高粱一种或其组合制成的液体和固态培养基，产生醇类、酸类等风味成分。

(2)应用于中国白酒酿造中，生产白酒品质提高。

(3)应用于中国白酒酿造中，可使白酒发酵酒醅中尿素含量降低20％-50％，EC含量降低10％-30％，白酒中EC浓度降低20％-50％。

本发明的第二个目的是提供含有所述CGMCC NO.13046菌株的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有CGMCC NO.13046菌体的活细胞、冷冻干燥得到的CGMCC NO.13046干菌体、固定化的CGMCC NO.13046细胞、CGMCC NO.13046的液体菌剂、CGMCC NO.13046的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的CGMCC NO.13046菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品或者食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品的载体。

本发明第三个目的是提供所述菌株在降低酒类产品中EC和/或尿素的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将球形赖氨酸芽孢杆菌添加到酒类产品的制备过程中。

在一种实施方式中，所述酒类产品包括酿造酒、蒸馏酒。

在一种实施方式中，所述酒类产品为白酒；所述方法是将CGMCC NO.13046菌株以液体培养物或固体培养物形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵酒醅中；菌株以单独接种或与其他微生物按不同混合比例接种。

在一种实施方式中，固体培养物是固体菌剂。

在一种实施方式中，菌株液体培养物总接种量为0.1％～20％(v/w)，菌株固体培养物总接种量为0.1％～20％(w/w)。

本发明的有益效果：

本发明对白酒酒醅中分离、筛选获得一株耐高温(60℃)，耐酸(pH 3.4)，耐乙醇(10％)，能够在白酒酿造过程中的胁迫条件(制曲最高温度达50～60℃；发酵酒醅pH 3.5～4.0之间；乙醇最高达7％左右)下生存并发挥功能的球形赖氨酸芽孢杆菌CGMCC NO.13046，这株球形赖氨酸芽孢杆菌能够同时降解尿素和EC，从而降低白酒中EC的含量，同时又能够促进白酒风味。

本发明针对中国白酒酿造中存在的主要问题，获得了同时降解尿素与EC的球形赖氨酸芽孢杆菌，并提供了功能菌株在中国白酒中的应用工艺。不但对于实现白酒行业技术水平与行业竞争力的提升具有重要的意义，而且对于白酒品质安全，促进白酒的可持续性发展具有明显的应用价值。

生物材料保藏

球形赖氨酸芽孢杆菌，分类学命名为球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus，于2016年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13046。

具体实施方式

实施例1球形赖氨酸芽孢杆菌降解尿素能力

液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环CGMCC NO.13046菌株于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100mL高粱混合浸出液体培养基(额外添加尿素，使其初始尿素浓度为500mg/L)的250mL摇瓶中，37℃静置培养5d。结果显示，5d后尿素浓度从初始的500mg/L降为10mg/L，降解率为98％。

其中：

种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌20min。

高粱混合浸出液体培养基：高粱200g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。过滤取上清液，pH6.2。1×10⁵Pa灭菌20min。

实施例2球形赖氨酸芽孢杆菌降解EC能力

液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环CGMCC NO.13046菌株于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100mL高粱混合浸出液体培养基(在培养基中额外添加EC，使其初始EC浓度为200ug/L)的250mL摇瓶中，37℃静置培养6d。结果显示，发酵末期EC浓度降为46ug/L，降解率为63％。

其中：

种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌20min。

高粱混合浸出液体培养基：高粱200g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。过滤取上清液，pH6.2。1×10⁵Pa灭菌20min。

实施例3球形赖氨酸芽孢杆菌风味代谢能力

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环CGMCC NO.13046菌株于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌20min。

步骤2：一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100mL大麦和小麦混合浸出液体培养基的250mL摇瓶中，37℃静置培养6d。

大麦和小麦混合浸出液体培养基：大麦和小麦分别100g，加水800mL，于100℃蒸煮10min。过滤取上清液，pH6.2。1×10⁵Pa灭菌20min。

步骤3：对CGMCC NO.13046菌株的发酵产物进行分析：取步骤2得到的发酵液以8000rpm离心8分钟。8mL上清液进行HS-SPME和GC-MS分析，产生乙偶姻、2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、己酸、辛酸等。其中酸类物质是白酒中重要的风味成分，可增加白酒的柔和性，其中己酸是浓香型白酒的主体香己酸乙酯的前体。乙偶姻呈奶油香气，2,3-丁二醇也是白酒中重要香气成分。

实施例4球形赖氨酸芽孢杆菌单独在芝麻香型白酒生产中的应用

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环CGMCC NO.13046菌于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：将一级液体种子培养物以10％接种量接种于装有2L液体种子培养基的5L摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌20min。

步骤2：二级液体种子培养物以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养10d，制成固态麸曲。

麸皮固体培养基：采用粉碎后的麸皮，添加40％的水，100℃蒸煮30min。

步骤3：将上述固态麸曲混在经过蒸酒后的酒醅和新粮、高温大曲粉中进行堆积发酵。用曲量为投料量的20％，堆积时间2d。

步骤4：芝麻香堆积酒醅入窖发酵35d。

以未添加菌株的芝麻香型白酒正常发酵生产过程为对照，发酵35d后，对照酒醅(芝麻香型白酒正常发酵酒醅)中尿素为207mg/kg，EC浓度为146μg/kg；试验样品酒醅(添加由CGMCC NO.13046固体麸曲生产的酒醅)中尿素为128mg/kg，EC浓度为96μg/kg，尿素降低38％，EC降低34％。

实施例5球形赖氨酸芽孢杆菌混合菌株在浓香型白酒生产工艺中的应用

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下用接种环挑1-2环CGMCC NO.13046菌于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：10％接种量接种于装有2l液体种子培养基的5l摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/L)：牛肉膏10，葡萄糖10，NaCl 5，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌20min。

步骤2：球形赖氨酸芽孢杆菌的二级液体种子培养物以相同比例，总接种量1％(v/w)的共同接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养10d，制成固态麸曲。

麸皮固体培养基：采用粉碎后的麸皮，添加40％的水，100℃蒸煮30min。

步骤3：将固体麸曲按照5％的接种量均匀拌入到大茬酒醅中，入窖发酵60d。

以未添加菌株的浓香型白酒发酵生产为对照，

发酵60d后，对照大茬酒醅(浓香型白酒正常发酵的大茬酒醅)中尿素为134mg/kg，EC浓度为124μg/kg；试验样品大茬酒醅(添加由CGMCC NO.13046制成固体麸曲生产的大茬酒醅)中尿素为81mg/kg，EC浓度为84μg/kg，尿素降低40％，EC降低32％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一种利用赖氨酸芽孢杆菌控制白酒中氨基甲酸乙酯的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。