专利摘要

本发明提供了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQIDNO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括T7C+S47C位点。具有上述突变位点的转氨酶突变体，其酶活性和/或稳定性大大提高，能够在相对极端的环境中应用。而且，具有上述突变位点的转氨酶突变体可以进一步通过固定化技术制备成固定化酶，且其固定化酶的活力和稳定性较高，能够被多次回收再利用，适合应用于填充床连续流反应。

权利要求

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体在SEQ ID NO: 1所示序列基础上发生氨基酸突变，所述氨基酸突变为：T7C+S47C，T7C+S47C+M356L、T7C+S47C+F364L、T7C+S47C+C404L、T7C+S47C+M430L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+R405A、T7C+S47C+K90G、 T7C+S47C+K219T、T7C+S47C+K304D、T7C+S47C+K51R、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+E368P、T7C+S47C+Q346E、T7C+S47C+H333K、T7C+S47C+D371G、T7C+S47C+E246A、T7C+S47C+C328A、T7C+S47C+N412G、T7C+S47C+T402P、T7C+S47C+T107F、T7C+S47C+T107A、T7C+S47C+G110P、T7C+S47C+K69N、T7C+S47C+G201C、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+K193I、T7C+S47C+I297L、T7C+S47C+R305H、T7C+S47C+F111Y、T7C+S47C+K190E或T7C+S47C+A286T。

2.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体在SEQ ID NO: 1所示序列基础上发生氨基酸突变，所述氨基酸突变为：T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+A95P、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286T、 T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C或T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A + A286T。

3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2所述的转氨酶突变体。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求3所述的DNA分子。

5.一种固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶包括权利要求1或2所述的转氨酶突变体。

6.根据权利要求5所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体的转氨酶交联酶聚集体。

7.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述转氨酶突变体经沉淀得到转氨酶聚集体，所述转氨酶聚集体中游离的氨基、酚基、咪唑基或巯基通过与交联剂交联得到所述转氨酶交联酶聚集体，其中，所述交联剂选自戊二醛、N, N-亚甲基双丙烯酰胺、双马来酰亚胺及右旋糖苷中的任意一种。

8.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述转氨酶交联酶聚集体为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上发生如下氨基酸突变的转氨酶突变体的交联酶聚集体：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A + A286T、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A或T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L。

9.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述右旋糖苷的分子量为6 KDa~200 KDa。

10.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述转氨酶突变体经乙醇沉淀得到所述转氨酶聚集体。

11.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述转氨酶聚集体中游离的氨基与戊二醛交联得到所述转氨酶交联酶聚集体。

12.根据权利要求5所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为转氨酶包埋-交联固定化酶。

13.根据权利要求12所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述转氨酶包埋-交联固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上发生如下氨基酸突变的转氨酶突变体的包埋-交联固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、或T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L。

14.根据权利要求12所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述转氨酶突变体中游离氨基与戊二醛形成席夫碱交联得到转氨酶交联酶，所述转氨酶交联酶包埋至聚丙烯酰胺凝胶网格中得到所述转氨酶包埋-交联固定化酶。

15.根据权利要求5所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体与载体共价连接的共价固定化酶。

16.根据权利要求15所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述共价固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上发生如下氨基酸突变的转氨酶突变体的共价固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+ R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A或T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。

17.根据权利要求15所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述载体为壳聚糖载体或树脂载体。

18.根据权利要求17所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述壳聚糖载体通过羟基和/或氨基与所述转氨酶突变体共价结合形成所述共价固定化酶。

19.根据权利要求17所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述树脂载体包括基质及与所述基质连接的官能团，所述基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与所述基质连接的官能团选自C2短链氨基、C4中链氨基、C6长链氨基或环氧基。

20.根据权利要求17所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述树脂载体选自ECR8309、ECR8315、EC-HFA、LX-1000HA、LX-1000EA、ECR8409、ECR8415、EC-EP、EC EP403、EXE119、LX-1000EP、Immobead-150A、Immobead-150P、Immobead350A、ECR8206、ECR8209、ECR8215或ECR8285。

21.根据权利要求5所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体与载体经金属离子螯合而成的螯合固定化酶。

22.根据权利要求21所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述螯合固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上发生如下氨基酸突变的转氨酶突变体的螯合固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C或T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。

23.根据权利要求21所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述载体为多孔玻璃载体。

24.根据权利要求23所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述多孔玻璃载体为EziG-101、EziG-102或EziG-103。

25.根据权利要求5所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述固定化转氨酶为所述转氨酶突变体与载体经物理吸附结合的吸附固定化酶。

26.根据权利要求25所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述吸附固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上发生如下氨基酸突变的转氨酶突变体的吸附固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、

T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、

T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、

T7C+S47C+ R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、

T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T或T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C。

27.根据权利要求26所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述载体为树脂载体。

28.根据权利要求27所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述树脂载体包括基质及与所述基质连接的官能团，所述基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与所述基质连接的官能团为十八烷基。

29.根据权利要求27所述的固定化转氨酶，其特征在于，

所述树脂载体选自ECR8806、ECR1030、ECR1090、ECR1061、ECR1091、ECR8804、Immobead-EC1、Immobead-S60S、Immobead-S861、X17S0409、EXE120或Diaion HP2MG。

30.一种生产手性胺的方法，包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1或2所述的转氨酶突变体或权利要求5至29中任一项所述的固定化转氨酶。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1或2所述的转氨酶突变体，所述方法为批次反应。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述批次反应的反应体系为水相反应体系。

33.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述转氨酶为权利要求5至29中任一项所述的固定化转氨酶，所述方法为连续化反应。

34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述连续化反应的反应体系为有机相反应体系。

35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为，其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基或C6～C10芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基或C5～C10碳环基，所述C5～C10杂环基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C6～C10芳基中的芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，R1和R2各自独立地为C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10杂芳基中的杂芳基未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代。

37.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为、、或，其中转氨基反应的产物为、、或。

38.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，氨基供体为异丙胺。

说明书

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

背景技术

ω-转氨酶(ω-TA)属于转移酶类，同其他的转氨酶类一样，催化一个氨基与酮基互换的过程。大部分情况下ω-转氨酶是指一类酶，只要某个酶催化的转氨反应中，反应的底物或产物中不含有α-氨基酸，就可以称该酶为ω-转氨酶。ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。对映体手性胺是具有广泛生物活性的许多药物化合物的关键中间体(ChemBioChem.9，2008，363-365，Chem.Commun.46，2010，5569-5571，Biotechnol.Bioeng.108，2011，1479-1493)。因其底物相对廉价、产物纯度高的特点，受到研究人员越来越多的关注(Green Chemistry,2017,19，2:333-360.)。并且转氨酶已经显现出应用于生产手性胺的希望(Organic Process Research&Development,2010,14,234-237)。

尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在放大生产应用中存在很多问题。如酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；易受反应体系中有机溶剂的影响而变性失活等。

另外，在分离产品胺的过程中，只能通过使酶变性失活形成沉淀后除去并丢弃，无法再利用；或将产品用有机溶剂从水溶液中萃取出，酶继续存在于水溶液中，但此时由于pH及溶剂等众多苛刻条件的影响使酶失活，无法再利用。

现有技术中有报道通过固定化技术将酶进行固定化以提高酶的回收再利用的问题。然而，目前固定化技术在脂肪酶、青霉素酰化酶、淀粉酶等领域的研究较多，因为这些酶相比其他酶有更好的稳定性，固定化后酶活性的损失较低。而对于大部分转氨酶而言，其稳定性较差，尤其是当体系中存在有机相时，固定化操作过程中容易引起酶活损失，因而，对转氨酶的固定化的研究较少，适合连续化反应的固定化的转氨酶的研究更少。

对于能够催化下列底物1和底物2进行氨基转换反应的转氨酶而言，如果用游离的转氨酶催化该反应，游离酶不能回收，只能使用一次。且由于反应体系中酶蛋白的存在使得后处理乳化现象极其严重，产物分离困难。

若将所用转氨酶固定化后，理论上可以实现酶的回收利用，但现有的用于催化底物1或底物2的转氨酶固定化后的酶活回收率依旧很低。而且，由于现有的底物酮(氨基受体)大多都水溶性不好，无法在纯水相中进行连续化反应。若要实现连续化反应，则需要加入足够的有机助溶剂使底物溶解，但现有的转氨酶对温度、pH及有机溶剂的耐受性差，有机溶剂易使其失活。因而也难以实现其固定化处理。

因此，需要对现有的能够催化上述底物的转氨酶进行改进，以改善其在有机溶剂等极端环境中稳定性差而应用受限的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种转氨酶突变体及其应用，以解决现有技术中的转氨酶活性在极端环境中耐受性差而使得应用受限的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括T7C+S47C位点。

进一步地，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：M356L、F364L、C404L、M430L、R405E/A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F/A、G110P、K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E以及A286T，其中“/”表示“或”。

进一步地，发生氨基酸突变的位点还包括如下任一种组合突变位点：K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286TR405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368PR405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种转氨酶突变体。

根据本发明的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述任一种DNA分子。

根据本发明的第四个方面，提供了一种固定化转氨酶，该固定化转氨酶包括上述任一种转氨酶突变体。

进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体的转氨酶交联酶聚集体；优选地，转氨酶突变体经沉淀得到转氨酶聚集体，转氨酶聚集体中游离的氨基、酚基、咪唑基或巯基进一步与交联剂交联得到的转氨酶交联酶聚集体，其中，交联剂选自戊二醛、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、双马来酰亚胺及右旋糖苷中的任意一种；优选地，转氨酶交联酶聚集体为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的交联酶聚集体：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L；优选地，右旋糖苷的分子量为6KDa～200KDa；优选地，转氨酶聚集体为转氨酶突变体经乙醇沉淀得到；优选地，转氨酶聚集体中游离的氨基与戊二醛交联得到转氨酶交联酶聚集体。

进一步地，固定化转氨酶为转氨酶包埋-交联固定化酶；优选地，转氨酶包埋-交联酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的包埋-交联固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L；优选地，转氨酶突变体中游离氨基与戊二醛形成席夫碱交联得到转氨酶交联酶，转氨酶交联酶包埋至聚丙烯酰胺凝胶网格中得到转氨酶包埋-交联固定化酶。

进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体与载体共价连接的共价固定化酶；优选地，共价固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的共价固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T；优选地，载体为壳聚糖载体、树脂载体；更优选地，壳聚糖载体通过羟基和/或氨基与转氨酶突变体共价结合形成共价固定化酶；更优选地，树脂载体包括基质及与基质连接的官能团，基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与基质连接的官能团选自C2短链氨基、C4中链氨基、C6长链氨基或环氧基；进一步优选地，树脂载体选自ECR8309、ECR8315、EC-HFA、LX-1000HA、LX-1000EA、ECR8409、ECR8415、EC-EP、EC EP403、EXE119、LX-1000EP、Immobead-150A、Immobead-150P、Immobead350A、ECR8206、ECR8209、ECR8215或ECR8285。

进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体与载体经金属离子螯合而成的螯合固定化酶；优选地，螯合固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的螯合固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T；优选地，载体为多孔玻璃载体；进一步优选地，多孔玻璃载体为EziG-101、EziG-102或EziG-103。

进一步地，固定化转氨酶为转氨酶突变体与载体经物理吸附结合的吸附固定化酶；优选地，吸附固定化酶为在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上含有如下氨基酸突变位点的转氨酶突变体的共价固定化酶：T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T及T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C；优选地，载体为树脂载体；更优选地，树脂载体包括基质及与基质连接的官能团，基质选自苯乙烯和甲基丙烯酸酯共聚物、聚苯乙烯树脂以及聚甲基丙烯酸酯树脂中的任意一种，与基质连接的官能团为十八烷基；进一步优选地，树脂载体选自ECR8806、ECR1030、ECR1090、ECR1061、ECR1091、ECR8804、Immobead-EC1、Immobead-S60S、Immobead-S861、X17S0409、EXE120或Diaion。

根据本发明的第五个方面，提供了一种生产手性胺的方法，包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体或上述任一种固定化转氨酶。

进一步地，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体，上述方法为批次反应；优选批次反应的反应体系为水相反应体系。

进一步地，转氨酶为上述任一种固定化转氨酶，上述方法为连续化反应；优选连续化反应的反应体系为有机相反应体系。

进一步地，酮类化合物为 其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C6～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，酮类化合物为 转氨基反应产物为 优选地，氨基供体为异丙胺。

应用本发明的技术方案，通过对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的转氨酶进行定向进化，筛选得到了一系列其酶活性和/或稳定性大大提高的转氨酶突变体，这些突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的基础上发生突变的氨基酸序列，其中突变的氨基酸位点包括T7C+S47C位点。包含上述突变位点的转氨酶突变体，能够在相对极端的环境中应用。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

名称解释：

定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

利用全质粒PCR引入定点突变是简单有效，且目前使用较多的手段。其原理是：一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。突变质粒转化至宿主细胞，诱导表达出目标蛋白。

易错PCR：意为易错条件下的PCR,即容易使复制出的DNA序列出现错误的PCR技术，又称错配PCR或倾向错误PCR。具体是指通过利用低保真度TaqDNA聚合酶和改变PCR反应条件，降低DNA复制的保真度，在新DNA链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。

易错PCR是目前最简单、有效的基因体外随机诱变技术，其原理是：碱基的异构为错配提供了可能，组成DNA的4种碱基都有互变异构体存在，其中鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)3种含氧碱基有酮式和烯醇式两种互变异构体。腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶两种含氮碱基，有胺式、亚胺式两种互变异构体。G、C和T主要以酮式结构存在，烯醇式结构的比率极低，A和T两种含氮碱基上的氮原子主要以氨基(NH2)状态存在，以亚胺基(NH)状态存在的比率极低。不同同分异构体之间氢原子位置的不同及同一位置电子云偏离方向的不同，可使得碱基的配对形式发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错配。例如当胸腺嘧啶以酮式结构存在时，与腺嘌呤配对，而以烯醇式结构存在时，与鸟嘌呤配对，这样就出现了A能配上C，T能配上G的不稳定碱基对，从而造成错配。

在已知的几种耐热DNA聚合酶中，TaqDNA聚合酶的错配率最高。Taq DNA聚合酶是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，具有5'-3'外切酶活性，不具3'-5'外切酶活性，因此在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能，所以比有3'-5'校对活性的DNA聚合酶发生错配的概率较高。DNA聚合酶的保真性可以通过多种方法来降低，包括使用4种浓度不同dNTP、添加Mn2+、提高Mg2+浓度等。几种诱变方法导致扩增DNA链碱基变异的机理各不相同。MnC12是DNA聚合酶的诱变因子，加入Mn2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率；4种dNTPs浓度的不平衡可以提高碱基错误掺入的概率，实现错配；Mg2+具有激活Taq酶的作用，增加Mg2+浓度，使之超过正常用量，能稳定非互补的碱基对；提高TaqDNA聚合酶用量、增加每个循环延伸时间，可以增加错配终端延伸的概率；降低起始模板浓度，会使后面PCR循环的变异模板比例增加。

固定化酶：是指在一定的空间范围内，其催化作用能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶固定化之后，一般稳定性增加，易从反应体系中分离，易于控制，能多次使用，便于运输和储存，有利于自动化生产，但活性降低，使用范围减小。

固定化酶载体基质：指形成固定化酶载体骨架的材料。

本申请中，所涉及到的1wt均指转化1g底物需要1g转氨酶突变体重组湿细胞。

本申请中，所涉及的1V等于反应体系的体积/底物的质量。

本申请为了解决现有技术中的转氨酶活性在极端环境中耐受性差而使得应用受限的问题，本申请一种典型的实施方式对来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的R416T位点发生突变的转氨酶进行了定向进化，得到了一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体具有SEQID NO:1所示的序列发生氨基酸突变的序列，其中，发生氨基酸突变的位点包括T7C+S47C位点。在相对极端的环境下，R416T+T7C+S47C位点发生突变的转氨酶突变的转氨酶活性较R416T突变体有明显提高。

以下将结合试验对上述技术方案和技术效果进行说明。

一、对极端环境耐受性提高的突变体的筛选

本申请对来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的氨基转移酶进行改造，得到酶活性提高的R416T突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该酶活性好，但是稳定性还不理想，为了提高该酶的稳定性，又以R416T突变体为模板，设计了五组双点突变，Q78C+A330C，V137C+G313C，A217C+Y252C，T7C+S47C，L295C+328C，引物序列是利用QuikChange Primer Design网页设计得到。通过全质粒PCR的方式在突变体R416T上引入突变位点，以pET-22b(+)为表达载体，获得新的突变位点的突变质粒。

将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在25℃，0.1mM IPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。将突变菌株表达的酶液在45-50℃，pH9.5，20％DMSO的极端环境下处理1h后，加入底物1或底物2，使用1wt的酶量继续在此条件下反应16h后检测转化率。利用此方式筛选出稳定性提高的突变体，其中T7C+S47C位点的突变体(R416T+T7C+S47C)活性较R416T突变体有明显提高，在此条件下，R416T催化的转化率为15％，而突变体R416T+T7C+S47C催化的转化率为72％。

进一步地，以R416T+T7C+S47C突变体为母本，设计了33对定点突变(具体引物采用QuikChange Primer Design网页设计得到)(M356L、W360L、F364L、C404L、M430L、M438L、C445A、F449V、R405E、R405A、K90G、K190R、K219T、K304D、K51R、W187Y、K193E、K143R、N151M、S8P、A33P、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P)，经QuikChange Primer Design网页设计引物序列，利用定点突变手段，以pET-22b(+)为表达载体获得带有目的基因的突变质粒。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，并在25℃、0.1mM IPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。

将突变菌株表达的酶液在30-45℃、pH 9.5-10、50％DMSO的极端环境下处理1h后、加入底物1或底物2、继续在此条件下反应16h后检测转化率。以此方式筛选出温度、pH及有机溶剂耐受性增强的突变体。筛选结果为：突变位点在M356L、F364L、C404L、M430L、R405E、R405A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P的突变体、对30℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高8％-40％。某些突变体对45℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高1.7倍～2.1倍、某些突变体对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高3.7倍～3.9倍。

以R416T+T7C+S47C突变体为母本，定点突变所筛选到的分别在不同极端环境下耐受性得到提高的具体突变体见下表1和表2。

表1：定点突变所获的对30℃、pH 9.5、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。

表2：定点突变所获的对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。

为简单有效地筛选出更理想的突变体、本申请还采用易错PCR技术对R416T+T7C+S47C突变体进行随机突变。

本申请经易错PCR方法，将获得目的基因片段连接至pET-22b载体上，获得带有目的基因的突变质粒。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，并在25℃、0.1mMIPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜。最后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。

将突变菌株表达的酶液在30-45℃、pH9-10、有机溶剂浓度为50％DMSO或35％MeOH的极端环境下处理1h后，加入底物1或2，继续在此条件下反应16h后检测转化率。以此方式筛选出对温度、pH及有机溶剂耐受性增强的突变体。筛选结果显示：突变位点在K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E、A286T的突变体对30℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高16％-45％、某些突变体对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性较R416T+T7C+S47C突变体提高117％～537％、某些突变体对30℃、pH8、35％MeOH环境的耐受性较母本提高233％～649％。

以R416T+T7C+S47C突变体为母本，易错PCR所筛选到的分别在不同极端环境下耐受性得到提高的具体突变体见下表3至表5。

表3：易错PCR所获对30℃、pH9.5、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。

突变位点耐受性提高程度突变位点耐受性提高程度R416T+T7C+S47C无K193I38％F111Y16％K190E31％Q380L41％R305H43％I297L42％A286T45％K69N24％G201C28％

表4：易错PCR所获对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性提高的单点突变体。

突变位点耐受性提高程度突变位点耐受性提高程度R416T+T7C+S47C无Q380L509％K190E191％K193I312％F111Y238％I297L537％R305H174％K190E191％K69N124％G201C117％

表5：易错PCR所获对30℃、pH 8、35％MeOH环境的耐受性提高的单点突变体。

突变位点耐受性提高程度突变位点耐受性提高程度R416T+T7C+S47C无R305H497％F111Y233％I297L576％K190E403％K193I579％A286T623％Q380L649％K69N288％G201C294％

为进一步进化出稳定性和耐受性更好的转氨酶，本申请将这些转氨酶稳定性和耐受性提高的位点进行多点组合突变，然后通过定向筛选的方法获得稳定性和耐受性进一步提高的多点突变体。

进行组合突变的突变位点来自于K51R、W187Y、R405E、K90G、A95P、K304D、Q380L、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P、I297L、K69N、G201C、A286T。

该组合突变是对这些位点进行任意组合。具体而言，包括但不限于如下突变组合：K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286T、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T。

将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在25℃、0.1mMIPTG的转氨酶诱导表达最佳条件下诱导过夜。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。

在更极端的条件下、如45℃、pH9.5-10、含50％DMSO或35％MeOH的环境下将酶液处理1h后、加入底物1、继续在此条件下反应16h、检测转化率。某些组合突变体对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性较母本提高231％～610％、某些组合突变体对30℃、pH8、35％MeOH环境的耐受性较母本提高213％～990％、某些组合突变体对45℃、pH8、40％MeOH环境的耐受性较母本提高3000％之多。具体的耐受性提高的组合突变体见下表6至表8。

表6：对40℃、pH10、50％DMSO环境的耐受性提高的组合突变体。

表7：对30℃、pH8、35％MeOH环境的耐受性提高的组合突变体。

表8：对45℃、pH8、40％MeOH环境的耐受性提高的组合突变体。

二、对本申请的转氨酶突变体进行固定化

2.1转氨酶交联酶聚集体(CLEAs)的制备

本申请中，分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行交联法固定，制备转氨酶交联酶聚集体。

一般地，交联酶聚集体的制备主要分两步进行：(1)酶蛋白聚集沉淀体的形成；(2)沉淀体之间的交联。

酶蛋白可以通过盐析法、等电点沉淀法、重金属盐沉淀法或有机溶剂沉淀法等方法凝聚沉淀，得到酶蛋白沉淀体(Aggregates)。一般情况下，这种酶蛋白沉淀为可逆沉淀，能重新在水溶液中溶解。

在蛋白沉淀后、加入交联剂使蛋白沉淀体间进一步通过共价键相连、形成水不溶性沉淀-交联酶聚集体。使用的交联剂为双功能或多功能试剂，双功能试剂有戊二醛、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、双马来酰亚胺等、多功能试剂右旋糖苷(分子量为6KDa～200KDa)。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

制备固定化酶液的缓冲液中含有0.4-1mg/mL的PLP、酶液pH为7.0-8.0。制备酶蛋白沉淀所用的沉淀剂为乙醇、异丙醇和/或硫酸铵，沉淀剂终浓度为90％。制备酶蛋白的交联聚集体所用的交联剂为25％戊二醛溶液，戊二醛终浓度为200mM-500mM。

制备的交联酶聚集体、可以直接使用过滤得到的含水交联酶在水相进行催化反应、或将含水的交联酶冻干得到干粉后再应用。冻干粉还可以应用于有机溶剂相中的反应。交联酶聚集体使用一次后、可以通过离心或过滤等方式回收后再使用，在与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，交联酶聚集体在水相反应中应用，与游离酶相比，活力回收＞80％，母本R416T+T7C+S47C可重复使用3次，而在母本基础上的单点突变体和/或组合突变体的重复使用次数较母本明显提高，其中最好的突变体的重复使用次数可达13次。

某些突变体的交联酶在含35％甲醇的体系中反应可重复使用至少6次。突变体游离酶活性稳定性提高，固定化后酶活回收及重复使用次数也提高。

使用交联酶催化反应，反应后处理从水相中用有机溶剂萃取产品，乳化现象明显减轻。制备交联酶无需载体、成本低、使用交联酶催化反应、重复使用次数多、综合使用次数、酶用量减少、使用成本较游离酶低。交联酶冻干粉在100％的有机相溶剂中反应，母本重复使用第二次时，其活性与第一次相比损失＞10％。而某些突变体的重复使用可达5次，活性与第一次相比损失＜5％。

2.2转氨酶的包埋-交联固定化方法

CLEAs无载体支撑，固定化酶颗粒小(＜10μm)，机械强度较差，过滤回收酶的过程中，酶容易板结，下次使用时不能很好地分散在反应体系中。为解决这一问题，可以结合交联和包埋两种技术先采用戊二醛作为交联剂，在含有酶液、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合液中，滴加戊二醛使其和自由酶形成希夫碱制得交联酶聚集体，加入引发剂过硫酸铵形成聚丙烯酰胺凝胶，而交联酶聚集体便被包埋至聚丙烯酰胺凝胶矩阵中，从而得到稳定的固定化酶。

本申请中，分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行包埋-交联法固定，制备包埋-交联酶。

制备的包埋-交联酶，酶活回收＞80％，水相反应使用一次后、经过滤等方式极易回收后再使用，在与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，母本R416T+T7C+S47C可重复使用8次，而在母本基础上的单点突变体和/或组合突变体的重复使用次数较母本明显提高，其中最好的突变体的重复使用次数可达18次。

某些突变体的包埋-交联酶在含35％甲醇的体系中反应可重复使用至少12次。后处理从水相中用有机溶剂萃取产品，乳化现象明显减轻。

2.3转氨酶的吸附固定化方法

酶分子与水不溶性载体通过静电作用、氢键、疏水作用等方式吸附结合可制备得到吸附固定化酶。该方法条件温和，不易引起酶的变性，但在水溶液中酶很容易与载体脱离，无法回收再利用，因此吸附法制备的固定化酶主要应用于有机溶剂中的反应。

可用于吸附固定化酶的载体分为无机载体和高分子载体两大类。无机载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；高分子载体有淀粉、谷蛋白、大孔型合成树脂、陶瓷等。

本申请所用载体为大孔合成树脂载体，包括基质以及可选的修饰该基质的官能团，其中，基质包括但不限于聚苯乙烯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂或苯乙烯与甲基丙烯酸酯的共聚物。除此之外，各类载体可经十八烷基官能团修饰。下表9所列为适用于本申请中转氨酶吸附固定化的载体。

表9.吸附型载体

载体名称基质官能团Diaion聚甲基丙烯酸酯无X17S0401聚甲基丙烯酸酯无ECR8806聚甲基丙烯酸酯无EXE120聚甲基丙烯酸酯十八烷基ECR-1030聚甲基丙烯酸酯无ECR-1090聚苯乙烯无

本申请将转氨酶与大孔树脂载体直接通过疏水键、氢键等物理方式结合。

分别对母本R416T+T7C+S47C突变体、在母本突变体基础上筛选得到的单点突变体及组合突变体的转氨酶进行物理吸附结合法固定。

制备酶液所用的缓冲液中含有0.4-1mg/mL的PLP、缓冲液pH为7.0-8.0、缓冲盐为Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-Cl或硼酸-氢氧化钠。

制备得到的吸附固定化酶可以通过氮气吹干、真空干燥、冷冻干燥等方式进行干燥处理。

本申请将转氨酶以吸附的方式结合至上述载体，活力回收＞80％；在有机溶剂中反应，固定化酶经过滤或注射器吸出液体等方式回收，可重复使用。与第一次使用相比，活力损失＜5％的范围内统计重复使用次数，对于某些突变体的固定化酶，可重复使用6次，活性损失＜5％。

2.4转氨酶的共价固定化方法

酶的共价固定化，是酶蛋白的非必需基团与水不溶性载体通过共价键形成不可逆的连接，在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。与载体共价结合的基团，通常不能是酶表现活力所必需的基团。

2.4.1共价固定化的酶载体

固定化酶载体可以是无机材料的如二氧化硅、玻璃、矿物质及硅藻土等、也可以是天然有机材料、如羧甲基纤维素、右旋糖苷、琼脂糖、果胶、壳聚糖等、还有非天然有机合成聚合物如聚苯乙烯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂、或苯乙烯与甲基丙烯酸酯的共聚物。这些载体还可以进一步官能团化、以利于同蛋白分子的结合、如在载体上加入氨基、羟基、环氧基、十八烷基等官能团。其中氨基和羟基官能团化的载体可以和酶蛋白分子通过离子键结合、氨基型载体还可以与酶蛋白共价结合、环氧基官能团的载体主要和酶蛋白通过共价键相连、十八烷基官能团的载体与酶分子通过疏水作用结合。载体可以采用任何形状或形式、如薄膜、管、片、珠、颗粒、芯片、光纤等。

本申请所用载体为壳聚糖、树脂以及多孔玻璃。

壳聚糖因其生物相容性好、形状可塑性高(可以做成凝胶、薄膜、纤维等形状)、无毒、、以及易于被化学修饰等特点、可以作为酶固定化的载体(ProcessBiochem,2005；40:2833–40)。壳聚糖本身可溶于水、需要先将其制备成水不溶性的载体颗粒、制备方法有溶剂蒸发法、乳化法、以及凝聚法等(MacromolBiosci,2003；3:511–20)。乳化法制得的载体颗粒较小且均一、通常为首选。壳聚糖分子中有活泼的羟基和氨基等、可将酶通过离子键、氢键和范德华力等作用吸附结合、但吸附作用弱、酶易脱落、常用交联剂甲醛、戊二醛等活化后再与酶共价结合。

本申请所用树脂载体，包括基质以及修饰该基质的官能团，其中，基质包括但不限于聚苯

转氨酶突变体及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。