专利摘要

一种用脂肪酶催化制备甲基丁胺对苯醌的方法，其特征在于用固定化南极假丝酵母脂肪酶B催化丁胺于甲基对苯醌反应，制备2‑甲基‑5‑丁胺对苯醌。本发明使用的酶催化法制备2‑甲基‑5‑丁胺对苯醌，由于酶的高度空间选择性，可以避免化学合成工艺选择性差、产物分离的困难，是环境友好的高效的合成方法。

权利要求

1.一种用脂肪酶催化制备甲基丁胺对苯醌的方法，其特征在于用固定化南极假丝酵母脂肪酶B催化丁胺与甲基对苯醌反应，制备2-甲基-5-丁胺对苯醌；在棕色反应瓶中，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液，其中含3-5%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.05-0.1mM，加入固定化南极假丝酵母脂肪酶B，酶添加量5-10U/mL，反应温度38-42℃，通入N2 3-15分钟后，密闭瓶盖，搅拌，开始反应，反应时间为20-24h，反应结束后，滤出固定化酶；滤液用丙酮萃取，分离有机相，蒸出丙酮，即得到产物2-甲基-5-丁胺对苯醌，反应转化率99-100％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为94-95％，其他取代的产物产率小于2.5%。

说明书

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到使用南极加丝酵母脂肪酶B催化制备抗肿瘤活性物质2-甲基-5-丁胺对苯醌。

背景技术

2-甲基-5-丁胺对苯醌具有很强的抗肿瘤活性，可望能够对抗多种部位的肿瘤，开发成为是一种应用较广的抗肿瘤药物。从结构上看，主要是苯醌、胺基这2种有效基团使得其具有抗肿瘤活性。

采用化学法合成2-甲基-5-丁胺对苯醌，由于空间选择性差，将产生3位、6位取代的丁胺产物，而不是仅仅5位取代的丁胺产物，可能得到以下不同取代的产物：（1）3，5位取代的双丁胺产物，（2）3，5，6位取代的三丁胺产物，（3）3，6位取代的二丁胺产物，（4）2-甲基-5-丁胺对苯醌，仅仅这种取代是本发明所要的产物。上述多种产物将形成混合物，且多种产物的分离纯化较为困难，使得2-甲基-5-丁胺对苯醌的分离成本高，收率低。本发明使用的酶催化法制备2-甲基-5-丁胺对苯醌，由于酶的高度空间选择性，特异性的生成2-甲基-5-丁胺对苯醌，不生成其它取代的产物，所以采用酶催化反应，可以避免化学合成工艺选择性差、产物分离的困难，是环境友好的高效的合成方法。

发明内容

本发明采用脂肪酶进行催化反应，具体的，是使用诺和诺德公司生产的固定化南极假丝酵母脂肪酶B，商品名Novozme 435( Candida antarctica lipase B，即CALB），作为催化剂，催化丁胺与甲基对苯醌反应，生成2-甲基-5-丁胺对苯醌，反应式如下：

酶的催化活性与pH有很大关系，本发明所用脂肪酶的最适pH为7.0-9.0，为保持酶的催化活性，必须使反应体系的pH处于最适宜范围，所以要选择适宜的缓冲液，同时要考虑，加入的正丁胺会对影响体系的pH。实验了多种缓冲液，包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸钠缓冲液等，实验结果表明，pH7.0的柠檬酸缓冲液的效果最佳，加入相应浓度丁胺后，pH处于7.0-9.0范围，所以，本发明采用柠檬酸缓冲液进行实验。

底物甲基苯醌不溶于水，所以要采用非水介质进行酶催化反应。非水介质包括水-有机溶剂单相体系、水-有机溶剂2相体系、有机溶剂单相体系、微溶液、离子液体等。选用最佳的反应介质是酶催化反应的重要环节，经过大量实验，结果表明，只有在水-有机溶剂单相体系反应，效果较好。具体的采用水-甲醇单相体系效果最好，甲醇浓度为3-5%，此时，甲基苯醌可以溶解在介质中，对酶的抑制很小。

本发明将采用脂肪酶进行水解反应。脂肪酶是一种用途非常广泛三酸甘油酯水解酶，脂肪酶种类很多，包括动物来源、植物来源、微生物来源的脂肪酶。例如假单胞菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、荧光假单胞菌脂、肪酶猪胰脂肪酶、青霉脂肪酶洋葱假单胞菌脂肪酶、圆柱假丝酵母脂肪酶、曲霉脂肪酶、产碱杆菌脂肪酶等。各种脂肪酶的催化特性不同，所以，要选择催化效果最佳的脂肪酶进行催化反应。经过大量实验，结果表明，多种脂肪酶均可催化本反应，但是，曲霉脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶B效果较好，但是，固定化的南极假丝酵母脂肪酶B效果最好。

酶添加量5-10U/mL，反应温度38-42℃，反应时间为20-24h。

酶催化反应制备2-甲基-5-丁胺对苯醌的过程如下：搅拌反应器，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液，其中含3-5%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.05-0.1mM，加入诺和诺德公司生产的固定化南极假丝酵母脂肪酶B，商品名Novozme 435( Candidaantarctica lipase B，即CALB），酶添加量5-10U/mL，反应温度38-42℃，通入N₂，开始反应，反应时间为20-24h。反应结束后，取样做液相色谱分析，滤出固定化酶，固定化酶可以重复使用。滤液用丙酮萃取，分离有机相，蒸出丙酮，即得到产物2-甲基-5-丁胺对苯醌，反应转化率99-100％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为94-95％，其他取代的产物产率小于2.5%。

液相检测条件：安捷伦1200液相色谱仪，C18反相柱，250mm，流动相：甲醇/水=80/20，产物保留时间4.35分钟。

分离纯化后产物2-甲基-5-丁胺对苯醌的¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.07 (m,1H), 5.74 (m,1H), 4.94 (m,1H),3.41 (m,2H), 2.46 (d,J = 0.4 Hz,3H),1.51 (d,J =7.7 Hz, 2H), 1.39 (d,J = 3.5 Hz, 2H), 0.98 (d,J = 6.4 Hz,3H). ¹³C NMR (125MHz,CDCl₃) δ 188.58 (s,1H), 172.84 (s,1H),153.25 (s, 1H), 121.22 (s, 1H),110.63 (s,1H),105.95 (s, 1H), 45.20 (s, 7H), 30.87 (s, 7H), 20.23 (s, 7H),14.02 (s, 9H), 10.46 (s,3H)。

具体实施方式

实施例1

10ml棕色反应瓶，磁子搅拌，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液2ml，其中含3-5%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.05-0.1mM，加入固定化南极假丝酵母脂肪酶B，Novozme 435，酶添加量5-10U/mL，反应温度38-42℃，通入N₂ 3分钟后，密闭瓶盖，开始反应，反应时间为20-24h。反应结束后，取样做液相色谱分析，液相检测结果：反应转化率99-100％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为94-95％，其他取代的产物产率小于2.5%。

液相检测条件：安捷伦1200液相色谱仪，C18反相柱，250mm，流动相：甲醇/水=80/20，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌保留时间4.35分钟。

实施例2

100ml棕色反应瓶，磁子搅拌，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液20ml，其中含3-5%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.05-0.1mM，加入固定化南极假丝酵母脂肪酶B，Novozme 435，酶添加量5-10U/mL，反应温度38-42℃，通入N₂ 5分钟后，密闭瓶盖，开始反应，反应时间为20-24h。反应结束后，取样做液相色谱分析，滤出固定化酶，固定化酶可以重复使用。滤液用丙酮萃取，分离有机相，蒸出丙酮，即得到产物2-甲基-5-丁胺对苯醌，液相检测结果：反应转化率99-100％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为94-95％，其他取代的产物产率小于2.5%。

液相检测条件同实施例1。

实施例3

1000ml棕色反应瓶，磁子搅拌，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液500ml，其中含3%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.05mM，加入固定化南极假丝酵母脂肪酶B，Novozme 435，酶添加量5U/mL，反应温度42℃，通入N₂ 15分钟后，密闭瓶盖，开始反应，反应时间为20h。反应结束后，取样做液相色谱分析，滤出固定化酶，固定化酶可以重复使用。滤液用丙酮萃取，分离有机相，蒸出丙酮，即得到产物2-甲基-5-丁胺对苯醌，液相检测结果：反应转化率99％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为94％，其他取代的产物产率小于2.5%。

液相检测条件同实施例。.

分离纯化后产物2-甲基-5-丁胺对苯醌的¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.07 (m,1H),5.74 (m,1H), 4.94 (m,1H),3.41 (m,2H), 2.46 (d,J = 0.4 Hz,3H),1.51 (d,J = 7.7Hz, 2H), 1.39 (d,J = 3.5 Hz, 2H), 0.98 (d,J = 6.4 Hz,3H). ¹³C NMR (125 MHz,CDCl₃) δ 188.58 (s,1H), 172.84 (s,1H),153.25 (s, 1H), 121.22 (s, 1H),110.63(s,1H),105.95 (s, 1H), 45.20 (s, 7H), 30.87 (s, 7H), 20.23 (s, 7H), 14.02 (s,9H), 10.46 (s,3H)。

实施例4

1000ml棕色反应瓶，磁子搅拌，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液500ml，其中含5%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.1mM，加入固定化南极假丝酵母脂肪酶B，Novozme 435，酶添加量10U/mL，反应温度40℃，通入N₂ 15分钟后，密闭瓶盖，开始反应，反应时间为22h。反应结束后，取样做液相色谱分析，滤出固定化酶，固定化酶可以重复使用。滤液用丙酮萃取，分离有机相，蒸出丙酮，即得到产物2-甲基-5-丁胺对苯醌，液相检测结果：反应转化率100％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为94％，其他取代的产物产率小于2.5%。

液相检测条件同实施例1。核磁数据同实施例3。

实施例5

1000ml棕色反应瓶，磁子搅拌，加入pH7.0的柠檬酸缓冲液500ml，其中含4%的甲醇，甲基对苯醌与丁胺等摩尔投料，丁胺浓度为0.075mM，加入固定化南极假丝酵母脂肪酶B，Novozme 435，酶添加量7.5U/mL，反应温度38℃，通入N₂ 15分钟后，密闭瓶盖，开始反应，反应时间为24h。反应结束后，取样做液相色谱分析，滤出固定化酶，固定化酶可以重复使用。滤液用丙酮萃取，分离有机相，蒸出丙酮，即得到产物2-甲基-5-丁胺对苯醌，液相检测结果：反应转化率99％，产物2-甲基-5-丁胺对苯醌产率为95％，其他取代的产物产率小于2.5%。

液相检测条件同实施例1。

一种用脂肪酶催化制备甲基丁胺对苯醌的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。