专利摘要

本发明公开了一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法，所述生物合成方法为：克隆大肠杆菌lipD基因、lplA基因、metK基因和lipA硫辛酸合成酶基因；构建硫辛酸结构域蛋白过量表达载体；将lplA串联克隆到高效表达结构域蛋白的载体上，保证结构域蛋白完全辛酰化；构建lipA或与metK串连表达载体；将上述4种载体转化到合适的大肠杆菌菌株内，调节和比较培养基成分及培养条件，促进辛酰化结构域蛋白向硫辛酰化转变。本发明所述的α-硫辛酸制备方法具有采用低价值化学原料与纯生物生产方法结合，生产过程中有毒物质少，对环境污染小，其合成硫辛酸安全性高，产量高；所制得的α-硫辛酸活性高。

权利要求

1.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

A、扩增tac启动子基因：以质粒pGSS331为模板，用引物PCR扩增得tac启动子基因；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以步骤（3）中A所述的tac启动子基因和B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增，得连接片段tac-lplA并纯化，连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；

D、将步骤（3）中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤（1）所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA；

（4）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（4）中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切连接，得表达载体pBAD34-lipA；

C、将步骤（4）中B所得的pBAD34-lipA与步骤（3）中D所得的pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21，得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

2.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得构建表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

A、扩增tac启动子基因：以质粒pGSS331为模板，用引物PCR扩增得tac启动子基因；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以步骤（3）中A所述的tac启动子基因和步骤（3）中B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增，得连接片段tac-lplA并纯化，连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；

D、将步骤（3）中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤（1）所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA；

（4）重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

A、表达载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（4）中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；

C、以步骤（4）中B中所述的表达载体pBAD34-lipA为模板，用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得pSU18-lipA-SD，再将pSU18-lipA-SD和pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD；

D、将步骤（4）中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；

E、将质粒pBAD34、步骤（4）中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK分别经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（4）中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤（3）中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA，共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

3.根据权利要求1或2所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤（3）中A所述的引物为：

Ptacpromoter up上游引物：GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT；

Ptacpromoter down下游引物：

GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG；

步骤（3）中B所述的引物为：

Promoter-lplA up上游引物：

CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC；

T7下游引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG；

步骤（3）中C所述的引物为：

Ptacpromoter up上游引物：GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT；

T7下游引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG。

4.根据权利要求2所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤（4）中C所述的引物为：

上游引物：GAACACGCACGTCATGAGTAAAC；

下游引物：

GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG。

5.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-lplA的制备

A、扩增lipD基因片段：以重组载体pET28-lipD为模板，用引物PCR扩增得lipD基因片段；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以步骤（3）中A所得的lipD基因片段和B所得的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NcoI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA；

（4）重组载体pBAD34-lipA的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，TA克隆连接至载体pMD19-T，通过PstI和BspHI双酶切克隆至pBAD34载体，构建重组载体pBAD34-lipA；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（3）中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤（4）所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

6.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经NcoI和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-lplA的制备

A、扩增lipD基因片段：以重组载体pET28-lipD为模板，用引物PCR扩增得lipD基因片段；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以步骤（3）中A所得的lipD基因片段和B所得的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NcoI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA；

（4）重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（4）中A中所得的克隆载体pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切连接，得表达载体pBAD34-lipA；

C、以步骤（4）中B所得的表达载体pBAD34-lipA为模板，用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得pSU18-lipA-SD，再将pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD；

D、将步骤（4）中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；

E、将质粒pBAD34、步骤（4）中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（4）中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤（3）中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA，共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

7.根据权利要求5或6所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤（3）中A所述的引物为：

pET28forward上游引物：TAATACGACTCACTATAGGGG；

lipD-lplANdeI下游引物：

GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC；

步骤（3）中B所述的引物为：

lipD-lplANdeI上游引物：

GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC；

lplADown下游引物：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC；

步骤（3）中C所述的引物为：

pET28forward上游引物：TAATACGACTCACTATAGGGG；

lplADown下游引物：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC。

8.根据权利要求6所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤（4）中C所述的引物为：

上游引物：GTAAGTAATTACTGCAGGATTAC；

下游引物：

GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCATCCC TTTCG。

9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

10.一种α-硫辛酸的制备方法，其特征在于，将权利要求9所制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株于LB培养基、2YT+Fe培养基或2YT培养基中培养5-7h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即可。

说明书

技术领域

本发明涉及生物方法合成活性物质领域，特别是涉及一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法。

背景技术

α-硫辛酸是一种具有生物活性的天然物质，其化学名称是1，2-二硫戊环-3-戊酸，结构式如式Ⅰ。它作为一种辅助因子广泛地存在于生物体中，通常与蛋白质分子中赖氨酸的ε-氨基共价结合，以酰胺键形式存在。硫辛酸具有旋光性，R-(+)-α-硫辛酸（右旋）是人体内硫辛酸的天然形式，S-(+)-α-硫辛酸在人体内不具有活性。

α-硫辛酸可以作为食品口服，生物组织很易吸收利用，并能透过血脑屏障发挥多功能的所谓“通用性抗氧化剂”的作用，其毒性很低。因此，α-硫辛酸是一种安全有效的强氧化剂，被誉为“万能抗氧化剂”。其优良的抗氧化性质表现在三方面：清除自由基和活性氧；螯合金属离子；再生其它抗氧化剂（V_E，V_C，谷胱甘肽等）。另外，硫辛酸具有氧化型(LA)和还原型(DHLA)两种形式，它既溶于水又溶于脂质，抗氧化的能力是脂溶性维生素V_E的100倍。

由于硫辛酸具有缓解肌体过度疲劳，延缓衰老，预防记忆力衰退等功效，而人体内含量非常少，且随着年龄的增长而减少，因此，在美国已成为热销的功能食品之一，日本也修改了食品药品区分标准，规定硫辛酸不仅作为医药品，也可当食品使用。另外，硫辛酸不但具有美容养颜的功效，同时还可以达到减肥的目的。因此，硫辛酸在健康食品和化妆品领域的用途值得关注，其市场前景也十分看好。

同时，α-硫辛酸也应用于下列疾病的预防与治疗中：糖尿病及糖尿病慢性并发症、脑和神经退化性疾病、辐射损伤、缺血再灌注损伤和艾滋病等。德国已批准α-硫辛酸作为糖尿病多发神经病的治疗药。

目前硫辛酸主要通过化学合成生产，根据原料的不同分为两种：己二酸法和环己酮法（蔡怀勋等，2003；刘宇，2005）。其中，己二酸法为：氯化铝催化乙烯和氯酰基己二酸一甲酯缩合，得到氯酮体，再经还原、卤化、二硫酚化和水分解得到二硫代羧酸体，最后经碘氧化得到目的产物硫辛酸。环己酮法为：以环己酮为起始原料，经烯胺化、加成、过氧化、取代、氧化共5步反应得到硫辛酸。

化学合成生产硫辛酸的缺点：步骤繁琐，工艺复杂，且均采用化工原料，并在合成过程中大量使用有毒催化剂，产品的安全性受到严重的质疑。同时对环境造成严重的污染，是环境非友好型工艺。另外，化学合成的硫辛酸是等量R-(+)-α-硫辛酸和S-(+)-α硫辛酸构成的混合体，需进一步拆分，才能得到有生物活性的R-(+)-α-硫辛酸。目前混旋硫辛酸的市场报价在550元/公斤，而R-硫辛酸达到2000-3000元/公斤，价格相差巨大。硫辛酸生产目前处于R-硫辛酸（右旋）取代混旋硫辛酸的过程之中，细菌转生产的硫辛酸是R-硫辛酸，因此，这将给细菌转化生产硫辛酸带来巨大的市场机遇。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法。

解决上述技术问题的具体技术方案如下：

一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

A、扩增tac启动子基因：以质粒pGSS331为模板，用引物PCR扩增得tac启动子基因；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以等量的步骤（3）中A所述的tac启动子基因和步骤（3）中B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增，得连接片段tac-lplA并纯化，连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；

D、将步骤（3）中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤（1）所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA；用热激法，将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌重组转化子lipD-tac-lplA/BL21；

（4）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（4）中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切连接，得表达载体pBAD34-lipA；

C、将pBAD34-lipA与pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21，得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

A、扩增tac启动子基因：以质粒pGSS331为模板，用引物PCR扩增得tac启动子基因；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以等量的步骤（3）中A所述的tac启动子基因和步骤（3）中B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增，得连接片段tac-lplA并纯化，连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；

D、将步骤（3）中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤（1）所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA；用热激法，将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌重组转化子lipD-tac-lplA/BL21；

（4）重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

A、表达载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（4）中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；

C、以步骤（4）中B中所述的表达载体pBAD34-lipA为模板，用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得pSU18-lipA-SD，再将pSU18-lipA-SD和pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD；

D、将步骤（4）中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；

E、将质粒pBAD34、步骤（4）中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK分别经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（4）中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤（3）中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA，共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

在其中一些实施例中，步骤（3）中A所述的引物为：

上游引物（Ptacpromoter up）：

GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT；

下游引物（Ptacpromoter down）：

GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG；

步骤（3）中B所述的引物为：

上游引物（Promoter-lplA up）：

CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC；

T7下游引物（T7）：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG；

步骤（3）中C所述的引物为：

上游引物（Ptacpromoter up）：

GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT；

下游引物（T7）：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG。

在其中一些实施例中，步骤（4）中C所述的引物为：

上游引物：GAACACGCACGTCATGAGTAAAC；

下游引物：

GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG。

本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-lplA的制备

A、扩增lipD基因片段：以重组载体pET28-lipD为模板，用引物PCR扩增得lipD基因片段；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以等量的步骤（3）中A所述的lipD基因片段和B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NocI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA；

（4）重组载体pBAD34-lipA的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并与pBAD34载体连接，构建重组载体pBAD34-lipA；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（3）中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤（4）所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-lplA的制备

A、扩增lipD基因片段：以重组载体pET28-lipD为模板，用引物PCR扩增得lipD基因片段；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；

C、以等量的步骤（3）中A所述的lipD基因片段和B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NocI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA；

（4）重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（5）中A中所述的克隆载体pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；

C、以表达载体pBAD34-lipA为模板，用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得pSU18-lipA-SD，再将pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD。所述引物包括lipA的3’末端序列（23bp）XbalI位点、载体pBAD43的SD序列（14bp）、Ndel和BamHI位点；

D、将步骤（4）中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；

E、将质粒pBAD34、步骤（4）中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（4）中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤（3）中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

在其中一些实施例中，步骤（3）中A所述的引物为：

上游引物（pET28forward）：TAATACGACTCACTATAGGGG；

下游引物（lipD-lplANdeI）：

GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC；

步骤（3）中B所述的引物为：

上游引物（lipD-lplANdeI）：

GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC；

下游引物（lplADown）：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC；

步骤（3）中C所述的引物为：

上游引物（pET28forward）：TAATACGACTCACTATAGGGG；

下游引物（lplADown）：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC；

在其中一些实施例中，步骤（4）中C所述的引物为：

上游引物：GAACACGCACGTCATGAGTAAAC；

下游引物：

GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG；

根据上述的制备方法制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

本发明还提供一种α-硫辛酸的制备方法，将上述制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株于LB培养基、2YT+Fe培养基或2YT培养基中培养5-7h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即可。

本发明所述的α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法的原理如下：

硫辛酸的合成是在Apo-lipD上进行的，为了提高硫辛酸的产量，本发明通过测定Apo-lipD的表达量，筛选出表达量最高的载体，以其为基础作进一步研究；为了使表达过量的Apo-lipD完全辛酰基化，首次使用克隆有大肠杆菌lplA基因的pSU18（pYS1）质粒转化菌株pSU18-lplA（YS17），在含有IPTG和辛酸的LB培养基中诱导结构域蛋白表达，并通过非变性凝胶电泳检测apo domain蛋白的辛酰基化程度，结果表明在BL21（DE3）菌株同时表达lipD和lplA基因能使apo domain蛋白完全转化为辛酰基化结构域蛋白octanoylated domain。为了减少质粒载体的使用和便于下一步操作，本研究尝试采用串连lipD和lplA的方式，完成apo domain蛋白的辛酰基化。为此构建了两种辛酰化载体，一种是将两个基因直接串联，另一种是先在lplA前连接一个tac启动子，后与lipD串连。为了使lplA和lipD的表达量达到最佳平衡，本研究尝试在lplA之前增加一个稍弱的启动子。通过比较本实验室所有载体的启动子，最终选择tac启动子做进一步的实验，因为该启动子与T7启动子同属IPTG诱导，但表达效率比T7低。通过softberry网站在线的启动子预测软件分析得到ptac85的启动子区域，根据ptac85的启动子序列设计了引物。

又由于lipA是将octanoylated-lipoyl domain转变为lipoylated-lipoyl domain的关键基因，本发明在初步实验中，将lipA基因克隆到pBAD34载体上与辛酰化质粒pET28-lipD-lplA导入同一个BL21（DE3）宿主菌，发现octanoylated-lipoyl domain能转化成lipoylated-lipoyl domain；获得菌株lipD-lplA&lipA/BL21、菌株lipD-tac-lplA&lipA/BL21；

另外，由于lipA在将两个硫原子插入到硫辛酸的6和8位碳原子上，需要S-腺苷甲硫氨酸协助作用(Cicchillo,Iwig et al.2004)，为了补充细胞中S-腺苷甲硫氨酸的量，因此，本实验将S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK基因前增加一个SD序列，后与lipA采用两种方法串联表达，获得菌株lipD-lplA&lipA-SD-metK/BL21、菌株lipD-tac-lplA&lipA-SD-metK/BL21。即采用辛酸为底物，硫辛酸结构域为合成载体，通过共同导入lplA和lipA或共同导入lplA、lipA与metK，获得高效硫辛酸生产菌株。

通过比较上述4种菌株apo-lipD的表达量，筛选出表达量最高的菌株。

本发明所述的α-硫辛酸的制备方法和生物合成α-硫辛酸的工程菌株及其制备方法具有如下优点和有益效果：

（1）本发明所述α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法，采用生物制法，将硫辛酸结构域lipD大量表达，从而为大量合成α-硫辛酸奠定基础，继而以硫辛酸结构域lipD为基础，经大量实验，构建和比较不同的表达载体，发现将lipD与lplA，lipA共同表达，或将硫辛酸结构域lipD与lplA，lipA及metK共同表达，获得可合成R-(+)-α-硫辛酸的工程菌株。

（2）本发明所制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株，其生产R-(+)-α-硫辛酸的产量比野生大肠杆菌的产量高上百倍的菌株，其产生的α-硫辛酸最高达500ng/mg细胞干重，产量比野生型高200倍以上。

（3）本发明所述α-硫辛酸的制备方法，生产过程中有毒物质少，对环境无污染，其合成硫辛酸安全性高，无毒且均为有活性的R-(+)-α-硫辛酸。

附图说明

图1-A为质粒pGSS331构建示意图；

图1-B为重组载体pET28-lipD构建示意图；

图1-C为lipD基因结构图；

图2为质粒pBAD24-lipD和质粒pET15-lipD构建示意图；

图3为重组载体pET28-lipD-lplA构建示意图；

图4为重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建示意图；

图5为重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建示意图；

图6为实施例1制得的菌种YS56和野生型大肠杆菌BL21生产制得的硫辛酸样品测定HPLC图，其中，A：YS56处理样品与标样比较图；B：BL21的处理样品与标样比较图；

图7为实施例5中不同培养基中4种菌株的硫辛酸产量。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所述丙酮酸脱氢酶E2亚基硫辛酸结构域基因，英文名称为apo-lipoyl domain，简称Apo-lipD或lipD；

所述硫辛酸蛋白连接酶基因，简称lplA；

所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，简称metK；

所述硫辛酸合成酶基因，简称lipA；

所述辛酰化结构域蛋白，英文名称为octanoylated-lipoyl domain；

所述硫辛酰化结构域蛋白，英文名称为lipoylated-lipoyl domain。

本发明选用的质粒pGSS331由美国伊利诺斯大学Cronan教授馈赠；所述质粒pGSS331可按本领域的常规方法，由ptac85在其Nco I和Sal I酶切位点之间克隆丙酮酸脱氢酶E2亚基lipD基因构建而成(Ali,S.T.,Guest,J.R.,1990,Isolation And Characterization Of Lipoylated And Unlipoylated Domains Of the E2p Subunit Of the Pyruvate-Dehydrogenase Complex Of Escherichia-Coli,271,1,139-145)，参见图1-C；

本发明选用的表达载体pET28、大肠杆菌DH5α、野生型大肠杆菌MG1655、大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）、表达载体pBAD34、质粒pSU18、表达载体pMD19-T或表达载体pBAD24均为市售产品；

本发明所述的TM136的硫辛酸代谢突变菌株由美国伊利诺斯大学Cronan教授馈赠；(Morris,T.W.,Reed,K.E.,Cronan,J.E.,1995.Lipoic Acid Metabolism In Escherichia-Coli-the Lpla And Lipb Genes Define Redundant Pathways for Ligation Of Lipoyl Groups To Apoprotein,177,1,1-10)；

LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L；

2YT+Fe培养基：2YT培养基添加50μM FeCl₃，20μM CaCl₂，10μM的MnCl₂和ZnSO₄,2μM的CoCl₂、CuCl₂、NiCl₂、Na₂MoO₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃

2YT培养基：细菌蛋白胨16g;酵母提取物5g;NaCl5g;H₂O800ml调整pH=7.2加H₂O到1L，高压灭菌。

实施例1

一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建

将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD，参见图1-A和图1-B；

重组载体pET28-lipD经Nco I和Sal I双酶切检测，表明pET28-lipD携带的lipD基因片段与pGSS331上的一致。经DNA测序和DNAstar软件分析表明lipD编码的蛋白包括丙酮酸脱氢酶E2亚基的N末端33个氨基酸残基（1-33）和中部52个氨基酸残基（238-289）共85个氨基酸残基组成，为一个杂合硫辛酸结构域(Miles and Guest1987)；在该DNA片段的3’端还有部分编码丙酮酸脱氢酶E3-binding结构域的序列，参见图1-C；经实验证明，该部分序列对lipD的表达、结构和功能没有影响。

用Nco I和Sal I酶切pET28-lipD，将lipD连接到pBAD24上，得质粒pBAD24-lipD；用Nco I和Xho I酶切pET28-lipD，将lipD连接到pET15上，得到质粒pET15-lipD，载体构建过程如下图2所示。

将上述重组载体pET28-lipD、质粒pBAD24-lipD和质粒pET15-lipD转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，分析不同菌株apo domain表达量，结果显示：携带pET28-lipD质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌株，积累的apo domain蛋白最多，因此选取pET28-lipD质粒作为后续改造的初始载体。

（2）表达载体pSU18-lplA的构建

克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；

（3）重组载体pET28-lipD-lplA的制备

A、扩增lipD基因片段：用pfuDNA聚合酶，以重组载体pET28-lipD为模板，pET28forward和lipD-lplANdeI为引物，PCR扩增300bp的lipD基因片段；

其中，pET28forward为上游引物：TAATACGACTCACTATAGGGG（SEQ ID NO.1）；

lipD-lplANdeI（下游引物）：

GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC（SEQ ID NO.2）；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，lipD-lplANdeI和lplADown为引物，PCR扩增lplA基因片段；

lipD-lplANdeI（上游引物）：

GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC（SEQ ID NO.3）；

lplADown（下游引物）：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC（SEQ ID NO.4）；

C、纯化上述步骤（3）中A所述的lipD和B所述的lplA基因片段，以等量的lipD和lplA基因片段为模板，以pET28forward和lplADown为引物，PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，纯化连接片段，并在TaqDNA聚合酶作用下，在片段3’端加尾，再次纯化片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；

将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NoclI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA（参见图3）；重组载体pET28-lipD-lplA转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌转化子lipD-lplA/BL21。

（4）重组载体pBAD34-lipA的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，TA克隆连接至载体pMD19-T，通过PstI和BspHI双酶切克隆至pBAD34载体，构建重组载体pBAD34-lipA；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（3）中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤（4）所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS56）。

一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将上述生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS56）的诱导表达：将步骤（5）所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS56）于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即得R-(+)-α-硫辛酸，产量参见图7。

实施例2

一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建：参见实施例1步骤（1）；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建：参见实施例1步骤（2）；

（3）重组载体pET28-lipD-lplA的制备

A、扩增lipD基因片段：参见实施例1步骤（3）中A；

B、扩增lplA基因片段：参见实施例1步骤（3）中B；

C、参见实施例1步骤（3）中C；

（4）重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建（参见图4）

A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（4）中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；

C、以表达载体pBAD34-lipA为模板，

SEQ ID NO.5：GTAAGTAATTACTGCAGGATTAC为上游引物；

SEQ ID NO.6：

GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG为下游引物（该下游引物包括lipA的3’末端序列（23bp）、XbaI位点、载体pBAD43的SD序列（14bp）、NdeI和BamHI位点），PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得载体pSU18-lipA-SD，再将载体pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD；

D、将步骤（4）中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；

E、将质粒pBAD34、步骤（4）中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（4）中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤（3）中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA，共同导入BL21，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS59）；

一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将上述步骤（5）所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS59）于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时，即得R-(+)-α-硫辛酸，其产量能达到340ng/mg细胞干重，参见图7。

实施例3

一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建：参见实施例1步骤（1）；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建：参见实施例1步骤（2）；

（3）重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建

为使lplA和lipD的表达量达到最佳平衡，本实施例在lplA之前增加一个tac启动子。

A、扩增tac启动子基因：以pfuDNA为聚合酶，质粒pGSS331为模板，Ptacpromoter down和Ptacpromoter up为引物，PCR扩增得105bp的tac启动子基因；

Ptacpromoter up（上游引物）：

GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT（SEQ ID NO.7）；

Ptacpromoter down（下游引物）：

GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG（SEQ ID NO.8）；

B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，Promoter-lplA up和T7为下游引物，PCR扩增得1.4kb的lplA基因片段；

Promoter-lplA up（上游引物）：

CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC（SEQ ID NO.9）；

T7下游引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG（SEQ ID NO.10）；

C、以等量的步骤（3）中A所述的tac启动子基因和步骤（3）中B所述的lplA基因片段为模板，用Ptacpromoter up和T7作为引物，用pfuDNA聚合酶将tac启动子PCR连接到lplA基因前，纯化连接片段tac-lplA，在TaqDNA聚合酶作用下，于tac-lplA基因片段加3’端加尾，并进行TA克隆，转化大厂杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；

Ptacpromoter up上游引物：GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT（SEQ ID NO.7）；

T7下游引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG（SEQ ID NO.10）。

D、将步骤（3）中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤（1）所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA（参见图5）；用热激法，将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌转化子lipD-tac-lplA/BL21；

（4）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建

以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA；

B、表达载体pBAD34-lipA的构建

将表达载体pBAD34和步骤（5）中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切连接，得表达载体pBAD34-lipA；

C、将pBAD34-lipA与pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21，得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS61）；

一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将步骤（4）中C所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株BL21/pET28-lipD-tac-lplA&pBAD34-lipA（YS61）于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即得R-(+)-α-硫辛酸，产量能达到520ng/mg细胞干重，具体参见图7。

实施例4

一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）原核表达载体pET28-lipD的构建：参见实施例1步骤（1）；

（2）表达载体pSU18-lplA的构建：参见实施例1步骤（2）；

（3）重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建

A：扩增tac启动子基因：参见实施例3步骤（3）中A；

B、扩增lplA基因片段：参见实施例3步骤（3）中B；

C、表达载体pMD19-T-tac-lplA的构建：参见实施例3步骤（3）中C；

D、参见实施例3步骤（3）中D；

（4）重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建：参见实施例2步骤（4）；

（5）生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

将步骤（4）中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤（3）中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA，共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，即得生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS58）。

一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将上述步骤（5）制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株（YS58）转接至LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6小时后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时，得出硫辛酸的产量能达到350ng/mg细胞干重，具体参见图7。

实施例5

将实施例1制得的菌株YS56、实施例2制得的菌株YS59，实施例3制得的菌株YS61和实施例4制得的菌株YS58分别转接至LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6小时后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时，通过HPLC和生物学方法测定了各菌株硫辛酸的产量，结果参见图7。

其中，HPLC的测定方法为：

用0.45μM微孔滤膜过膜处理的KH₂PO₃（pH为2.0，浓度25mM）和HPLC级甲醇以25：75的体积比混合液做为流动相，流速每分钟1ml，进样10μl，采用Waters公司的C18柱在330nm紫外吸收光波长处测定硫辛酸的含量。具体操作：

（1）过夜洗柱平衡色谱柱：先以100%甲醇平衡30min，后25：75体积比的水与甲醇平衡60min，再用25：75体积比的KH₂PO₃与甲醇洗柱平衡60min，最后用25：75体积比的KH₂PO₃与甲醇低流速平衡过夜；

（2）样品测定：用25：75体积比的KH₂PO₃与甲醇平衡色谱柱20min，用330nm紫外波长检测基线成一条直线后，开始进样测定：进样10μl，25：75体积比的KH₂PO₃与甲醇做为流动相，1ml/min恒流测定样品；

（3）测定样品后洗柱：采用25：75体积比的KH₂PO₃与甲醇平衡洗柱30min，然后用25：75体积比的水与甲醇平衡30min，最后用100%甲醇60min处理色谱柱。

标样的测定，分别配制了0.01mg/ml、0.025mg/ml、0.0500mg/ml、0.075mg/ml、0.1000mg/ml、0.2mg/ml的硫辛酸标样，然后根据各标样吸收面积测出硫辛酸的面积浓度比标准曲线，得到其线性回归方程，再根据方程推算出样品硫辛酸浓度。

从图6可知：实施例1制得的菌株YS56的产量明显高于野生型大肠杆菌BL21。

从图7中可知：2YT培养基培养所产生硫辛酸，产量远高于其它培养基，其中，实施例1制得的菌株YS56的产量为1.56mg/L、实施例2制得的菌株YS59的产量为1.06mg/L，实施例3制得的菌株YS61的产量达2.1mg/L、实施例4制得的菌株YS58的产量为1.44mg/L。

而在LB和2YT添加微量元素Fe的培养基中，硫辛酸的最高产量也未超过1.4mg/ml。初步表明2×YT是一种适合积累硫辛酸的培养基。采用同样的方法测定了大肠杆菌BL21（DE3）和MG1655的硫辛酸产量，约为0.005mg/L。这表明菌株lipD-tac-lplA-lipA/BL21生物合成硫辛酸的量是野生大肠杆菌的100倍以上。

实施例6硫辛酸活性测定

使用TM136的硫辛酸代谢突变菌株进行定性鉴定。该突变株在添加活性硫辛酸的基础培养基上能正常生长，而在不添加硫辛酸的基础培养基上不能正常生长。分别在基础培养基中添加500ng/ml硫辛酸标准样品或水解萃取的1ml硫辛酸样品25μl，同时做基础培养基空白对照。划线接种TM136于每种培养基平板，在37℃同样的条件培养过夜，检测其生长情况。

结果表明：实施例1-4所述的发酵菌株在添加活性硫辛酸的基础培养基上正常生长，且生产的硫辛酸具有很高的生物活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。