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    α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法

    α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法

    IPC分类号 : C12N15/70,C12N1/21,C12P17/00,C12R1/19

    申请号
    CN201310425941.5
    可选规格
    • 专利类型: 发明专利
    • 法律状态: 有权
    • 申请日: 2013-09-17
    • 公开号: 104450762A
    • 公开日: 2015-03-25
    • 主分类号: C12N15/70
    • 专利权人: 中国科学院广州生物医药与健康研究院

    专利摘要

    本发明公开了一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法,所述生物合成方法为:克隆大肠杆菌lipD基因、lplA基因、metK基因和lipA硫辛酸合成酶基因;构建硫辛酸结构域蛋白过量表达载体;将lplA串联克隆到高效表达结构域蛋白的载体上,保证结构域蛋白完全辛酰化;构建lipA或与metK串连表达载体;将上述4种载体转化到合适的大肠杆菌菌株内,调节和比较培养基成分及培养条件,促进辛酰化结构域蛋白向硫辛酰化转变。本发明所述的α-硫辛酸制备方法具有采用低价值化学原料与纯生物生产方法结合,生产过程中有毒物质少,对环境污染小,其合成硫辛酸安全性高,产量高;所制得的α-硫辛酸活性高。

    权利要求

    1.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

    A、扩增tac启动子基因:以质粒pGSS331为模板,用引物PCR扩增得tac启动子基因;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以步骤(3)中A所述的tac启动子基因和B所述的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增,得连接片段tac-lplA并纯化,连接至载体pMD19-T中,得表达载体pMD19-T-tac-lplA;

    D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切,并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-tac-lplA;

    (4)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得pMD19-T-lipA;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切连接,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、将步骤(4)中B所得的pBAD34-lipA与步骤(3)中D所得的pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21,得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    2.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得构建表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

    A、扩增tac启动子基因:以质粒pGSS331为模板,用引物PCR扩增得tac启动子基因;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增,得连接片段tac-lplA并纯化,连接至载体pMD19-T中,得表达载体pMD19-T-tac-lplA;

    D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切,并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-tac-lplA;

    (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

    A、表达载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因和metK基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、以步骤(4)中B中所述的表达载体pBAD34-lipA为模板,用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段,将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切,得pSU18-lipA-SD,再将pSU18-lipA-SD和pBAD24经EcoRI和PstI双酶切,得pBAD24-lipA-SD;

    D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切,用连接酶连接,得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK;

    E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK分别经Nsi和SalI双酶切并纯化回收,得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(4)中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    3.根据权利要求1或2所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,步骤(3)中A所述的引物为:

    Ptacpromoter up上游引物:GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT;

    Ptacpromoter down下游引物:

    GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG;

    步骤(3)中B所述的引物为:

    Promoter-lplA up上游引物:

    CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC;

    T7下游引物:GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG;

    步骤(3)中C所述的引物为:

    Ptacpromoter up上游引物:GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT;

    T7下游引物:GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG。

    4.根据权利要求2所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,步骤(4)中C所述的引物为:

    上游引物:GAACACGCACGTCATGAGTAAAC;

    下游引物:

    GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG。

    5.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备

    A、扩增lipD基因片段:以重组载体pET28-lipD为模板,用引物PCR扩增得lipD基因片段;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以步骤(3)中A所得的lipD基因片段和B所得的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段,进行TA克隆,并转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA;将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NcoI和BamHI双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-lplA;

    (4)重组载体pBAD34-lipA的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因,TA克隆连接至载体pMD19-T,通过PstI和BspHI双酶切克隆至pBAD34载体,构建重组载体pBAD34-lipA;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(3)中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤(4)所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21中,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    6.一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经NcoI和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备

    A、扩增lipD基因片段:以重组载体pET28-lipD为模板,用引物PCR扩增得lipD基因片段;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以步骤(3)中A所得的lipD基因片段和B所得的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段,进行TA克隆,并转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA;将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NcoI和BamHI双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-lplA;

    (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

    A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因和metK基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所得的克隆载体pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切连接,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、以步骤(4)中B所得的表达载体pBAD34-lipA为模板,用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段,将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切,得pSU18-lipA-SD,再将pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切,得pBAD24-lipA-SD;

    D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切,用连接酶连接,得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK;

    E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收,得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(4)中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    7.根据权利要求5或6所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,步骤(3)中A所述的引物为:

    pET28forward上游引物:TAATACGACTCACTATAGGGG;

    lipD-lplANdeI下游引物:

    GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC;

    步骤(3)中B所述的引物为:

    lipD-lplANdeI上游引物:

    GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC;

    lplADown下游引物:CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC;

    步骤(3)中C所述的引物为:

    pET28forward上游引物:TAATACGACTCACTATAGGGG;

    lplADown下游引物:CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC。

    8.根据权利要求6所述的生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,其特征在于,步骤(4)中C所述的引物为:

    上游引物:GTAAGTAATTACTGCAGGATTAC;

    下游引物:

    GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCATCCC TTTCG。

    9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    10.一种α-硫辛酸的制备方法,其特征在于,将权利要求9所制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株于LB培养基、2YT+Fe培养基或2YT培养基中培养5-7h后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h,即可。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及生物方法合成活性物质领域,特别是涉及一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法。

    背景技术

    α-硫辛酸是一种具有生物活性的天然物质,其化学名称是1,2-二硫戊环-3-戊酸,结构式如式Ⅰ。它作为一种辅助因子广泛地存在于生物体中,通常与蛋白质分子中赖氨酸的ε-氨基共价结合,以酰胺键形式存在。硫辛酸具有旋光性,R-(+)-α-硫辛酸(右旋)是人体内硫辛酸的天然形式,S-(+)-α-硫辛酸在人体内不具有活性。

    α-硫辛酸可以作为食品口服,生物组织很易吸收利用,并能透过血脑屏障发挥多功能的所谓“通用性抗氧化剂”的作用,其毒性很低。因此,α-硫辛酸是一种安全有效的强氧化剂,被誉为“万能抗氧化剂”。其优良的抗氧化性质表现在三方面:清除自由基和活性氧;螯合金属离子;再生其它抗氧化剂(VE,VC,谷胱甘肽等)。另外,硫辛酸具有氧化型(LA)和还原型(DHLA)两种形式,它既溶于水又溶于脂质,抗氧化的能力是脂溶性维生素VE的100倍。

    由于硫辛酸具有缓解肌体过度疲劳,延缓衰老,预防记忆力衰退等功效,而人体内含量非常少,且随着年龄的增长而减少,因此,在美国已成为热销的功能食品之一,日本也修改了食品药品区分标准,规定硫辛酸不仅作为医药品,也可当食品使用。另外,硫辛酸不但具有美容养颜的功效,同时还可以达到减肥的目的。因此,硫辛酸在健康食品和化妆品领域的用途值得关注,其市场前景也十分看好。

    同时,α-硫辛酸也应用于下列疾病的预防与治疗中:糖尿病及糖尿病慢性并发症、脑和神经退化性疾病、辐射损伤、缺血再灌注损伤和艾滋病等。德国已批准α-硫辛酸作为糖尿病多发神经病的治疗药。

    目前硫辛酸主要通过化学合成生产,根据原料的不同分为两种:己二酸法和环己酮法(蔡怀勋等,2003;刘宇,2005)。其中,己二酸法为:氯化铝催化乙烯和氯酰基己二酸一甲酯缩合,得到氯酮体,再经还原、卤化、二硫酚化和水分解得到二硫代羧酸体,最后经碘氧化得到目的产物硫辛酸。环己酮法为:以环己酮为起始原料,经烯胺化、加成、过氧化、取代、氧化共5步反应得到硫辛酸。

    化学合成生产硫辛酸的缺点:步骤繁琐,工艺复杂,且均采用化工原料,并在合成过程中大量使用有毒催化剂,产品的安全性受到严重的质疑。同时对环境造成严重的污染,是环境非友好型工艺。另外,化学合成的硫辛酸是等量R-(+)-α-硫辛酸和S-(+)-α硫辛酸构成的混合体,需进一步拆分,才能得到有生物活性的R-(+)-α-硫辛酸。目前混旋硫辛酸的市场报价在550元/公斤,而R-硫辛酸达到2000-3000元/公斤,价格相差巨大。硫辛酸生产目前处于R-硫辛酸(右旋)取代混旋硫辛酸的过程之中,细菌转生产的硫辛酸是R-硫辛酸,因此,这将给细菌转化生产硫辛酸带来巨大的市场机遇。

    发明内容

    基于此,本发明的目的在于提供一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法。

    解决上述技术问题的具体技术方案如下:

    一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

    A、扩增tac启动子基因:以质粒pGSS331为模板,用引物PCR扩增得tac启动子基因;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以等量的步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增,得连接片段tac-lplA并纯化,连接至载体pMD19-T中,得表达载体pMD19-T-tac-lplA;

    D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切,并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-tac-lplA;用热激法,将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,得大肠杆菌重组转化子lipD-tac-lplA/BL21;

    (4)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得pMD19-T-lipA;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切连接,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、将pBAD34-lipA与pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21,得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备

    A、扩增tac启动子基因:以质粒pGSS331为模板,用引物PCR扩增得tac启动子基因;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以等量的步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增,得连接片段tac-lplA并纯化,连接至载体pMD19-T中,得表达载体pMD19-T-tac-lplA;

    D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切,并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-tac-lplA;用热激法,将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,得大肠杆菌重组转化子lipD-tac-lplA/BL21;

    (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

    A、表达载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因和metK基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、以步骤(4)中B中所述的表达载体pBAD34-lipA为模板,用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段,将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切,得pSU18-lipA-SD,再将pSU18-lipA-SD和pBAD24经EcoRI和PstI双酶切,得pBAD24-lipA-SD;

    D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切,用连接酶连接,得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK;

    E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK分别经Nsi和SalI双酶切并纯化回收,得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(4)中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    在其中一些实施例中,步骤(3)中A所述的引物为:

    上游引物(Ptacpromoter up):

    GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT;

    下游引物(Ptacpromoter down):

    GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG;

    步骤(3)中B所述的引物为:

    上游引物(Promoter-lplA up):

    CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC;

    T7下游引物(T7):GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG;

    步骤(3)中C所述的引物为:

    上游引物(Ptacpromoter up):

    GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT;

    下游引物(T7):GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG。

    在其中一些实施例中,步骤(4)中C所述的引物为:

    上游引物:GAACACGCACGTCATGAGTAAAC;

    下游引物:

    GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG。

    本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备

    A、扩增lipD基因片段:以重组载体pET28-lipD为模板,用引物PCR扩增得lipD基因片段;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以等量的步骤(3)中A所述的lipD基因片段和B所述的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段,进行TA克隆,并转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA;将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NocI和BamHI双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-lplA;

    (4)重组载体pBAD34-lipA的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因,并与pBAD34载体连接,构建重组载体pBAD34-lipA;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(3)中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤(4)所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21中,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD;

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备

    A、扩增lipD基因片段:以重组载体pET28-lipD为模板,用引物PCR扩增得lipD基因片段;

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,用引物PCR扩增得lplA基因片段;

    C、以等量的步骤(3)中A所述的lipD基因片段和B所述的lplA基因片段为模板,用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段,进行TA克隆,并转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA;将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NocI和BamHI双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-lplA;

    (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建

    A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因和metK基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(5)中A中所述的克隆载体pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、以表达载体pBAD34-lipA为模板,用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段,将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切,得pSU18-lipA-SD,再将pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切,得pBAD24-lipA-SD。所述引物包括lipA的3’末端序列(23bp)XbalI位点、载体pBAD43的SD序列(14bp)、Ndel和BamHI位点;

    D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切,用连接酶连接,得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK;

    E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收,得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(4)中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    在其中一些实施例中,步骤(3)中A所述的引物为:

    上游引物(pET28forward):TAATACGACTCACTATAGGGG;

    下游引物(lipD-lplANdeI):

    GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC;

    步骤(3)中B所述的引物为:

    上游引物(lipD-lplANdeI):

    GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC;

    下游引物(lplADown):CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC;

    步骤(3)中C所述的引物为:

    上游引物(pET28forward):TAATACGACTCACTATAGGGG;

    下游引物(lplADown):CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC;

    在其中一些实施例中,步骤(4)中C所述的引物为:

    上游引物:GAACACGCACGTCATGAGTAAAC;

    下游引物:

    GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG;

    根据上述的制备方法制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株。

    本发明还提供一种α-硫辛酸的制备方法,将上述制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株于LB培养基、2YT+Fe培养基或2YT培养基中培养5-7h后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h,即可。

    本发明所述的α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法的原理如下:

    硫辛酸的合成是在Apo-lipD上进行的,为了提高硫辛酸的产量,本发明通过测定Apo-lipD的表达量,筛选出表达量最高的载体,以其为基础作进一步研究;为了使表达过量的Apo-lipD完全辛酰基化,首次使用克隆有大肠杆菌lplA基因的pSU18(pYS1)质粒转化菌株pSU18-lplA(YS17),在含有IPTG和辛酸的LB培养基中诱导结构域蛋白表达,并通过非变性凝胶电泳检测apo domain蛋白的辛酰基化程度,结果表明在BL21(DE3)菌株同时表达lipD和lplA基因能使apo domain蛋白完全转化为辛酰基化结构域蛋白octanoylated domain。为了减少质粒载体的使用和便于下一步操作,本研究尝试采用串连lipD和lplA的方式,完成apo domain蛋白的辛酰基化。为此构建了两种辛酰化载体,一种是将两个基因直接串联,另一种是先在lplA前连接一个tac启动子,后与lipD串连。为了使lplA和lipD的表达量达到最佳平衡,本研究尝试在lplA之前增加一个稍弱的启动子。通过比较本实验室所有载体的启动子,最终选择tac启动子做进一步的实验,因为该启动子与T7启动子同属IPTG诱导,但表达效率比T7低。通过softberry网站在线的启动子预测软件分析得到ptac85的启动子区域,根据ptac85的启动子序列设计了引物。

    又由于lipA是将octanoylated-lipoyl domain转变为lipoylated-lipoyl domain的关键基因,本发明在初步实验中,将lipA基因克隆到pBAD34载体上与辛酰化质粒pET28-lipD-lplA导入同一个BL21(DE3)宿主菌,发现octanoylated-lipoyl domain能转化成lipoylated-lipoyl domain;获得菌株lipD-lplA&lipA/BL21、菌株lipD-tac-lplA&lipA/BL21;

    另外,由于lipA在将两个硫原子插入到硫辛酸的6和8位碳原子上,需要S-腺苷甲硫氨酸协助作用(Cicchillo,Iwig et al.2004),为了补充细胞中S-腺苷甲硫氨酸的量,因此,本实验将S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK基因前增加一个SD序列,后与lipA采用两种方法串联表达,获得菌株lipD-lplA&lipA-SD-metK/BL21、菌株lipD-tac-lplA&lipA-SD-metK/BL21。即采用辛酸为底物,硫辛酸结构域为合成载体,通过共同导入lplA和lipA或共同导入lplA、lipA与metK,获得高效硫辛酸生产菌株。

    通过比较上述4种菌株apo-lipD的表达量,筛选出表达量最高的菌株。

    本发明所述的α-硫辛酸的制备方法和生物合成α-硫辛酸的工程菌株及其制备方法具有如下优点和有益效果:

    (1)本发明所述α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法,采用生物制法,将硫辛酸结构域lipD大量表达,从而为大量合成α-硫辛酸奠定基础,继而以硫辛酸结构域lipD为基础,经大量实验,构建和比较不同的表达载体,发现将lipD与lplA,lipA共同表达,或将硫辛酸结构域lipD与lplA,lipA及metK共同表达,获得可合成R-(+)-α-硫辛酸的工程菌株。

    (2)本发明所制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株,其生产R-(+)-α-硫辛酸的产量比野生大肠杆菌的产量高上百倍的菌株,其产生的α-硫辛酸最高达500ng/mg细胞干重,产量比野生型高200倍以上。

    (3)本发明所述α-硫辛酸的制备方法,生产过程中有毒物质少,对环境无污染,其合成硫辛酸安全性高,无毒且均为有活性的R-(+)-α-硫辛酸。

    附图说明

    图1-A为质粒pGSS331构建示意图;

    图1-B为重组载体pET28-lipD构建示意图;

    图1-C为lipD基因结构图;

    图2为质粒pBAD24-lipD和质粒pET15-lipD构建示意图;

    图3为重组载体pET28-lipD-lplA构建示意图;

    图4为重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建示意图;

    图5为重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建示意图;

    图6为实施例1制得的菌种YS56和野生型大肠杆菌BL21生产制得的硫辛酸样品测定HPLC图,其中,A:YS56处理样品与标样比较图;B:BL21的处理样品与标样比较图;

    图7为实施例5中不同培养基中4种菌株的硫辛酸产量。

    具体实施方式

    为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。

    本发明所述丙酮酸脱氢酶E2亚基硫辛酸结构域基因,英文名称为apo-lipoyl domain,简称Apo-lipD或lipD;

    所述硫辛酸蛋白连接酶基因,简称lplA;

    所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,简称metK;

    所述硫辛酸合成酶基因,简称lipA;

    所述辛酰化结构域蛋白,英文名称为octanoylated-lipoyl domain;

    所述硫辛酰化结构域蛋白,英文名称为lipoylated-lipoyl domain。

    本发明选用的质粒pGSS331由美国伊利诺斯大学Cronan教授馈赠;所述质粒pGSS331可按本领域的常规方法,由ptac85在其Nco I和Sal I酶切位点之间克隆丙酮酸脱氢酶E2亚基lipD基因构建而成(Ali,S.T.,Guest,J.R.,1990,Isolation And Characterization Of Lipoylated And Unlipoylated Domains Of the E2p Subunit Of the Pyruvate-Dehydrogenase Complex Of Escherichia-Coli,271,1,139-145),参见图1-C;

    本发明选用的表达载体pET28、大肠杆菌DH5α、野生型大肠杆菌MG1655、大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、表达载体pBAD34、质粒pSU18、表达载体pMD19-T或表达载体pBAD24均为市售产品;

    本发明所述的TM136的硫辛酸代谢突变菌株由美国伊利诺斯大学Cronan教授馈赠;(Morris,T.W.,Reed,K.E.,Cronan,J.E.,1995.Lipoic Acid Metabolism In Escherichia-Coli-the Lpla And Lipb Genes Define Redundant Pathways for Ligation Of Lipoyl Groups To Apoprotein,177,1,1-10);

    LB培养基:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化钠(NaCl)10g/L;

    2YT+Fe培养基:2YT培养基添加50μM FeCl3,20μM CaCl2,10μM的MnCl2和ZnSO4,2μM的CoCl2、CuCl2、NiCl2、Na2MoO4、Na2SeO3和H3BO3

    2YT培养基:细菌蛋白胨16g;酵母提取物5g;NaCl5g;H2O800ml调整pH=7.2加H2O到1L,高压灭菌。

    实施例1

    一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建

    将含有lipD的质粒pGSS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD,参见图1-A和图1-B;

    重组载体pET28-lipD经Nco I和Sal I双酶切检测,表明pET28-lipD携带的lipD基因片段与pGSS331上的一致。经DNA测序和DNAstar软件分析表明lipD编码的蛋白包括丙酮酸脱氢酶E2亚基的N末端33个氨基酸残基(1-33)和中部52个氨基酸残基(238-289)共85个氨基酸残基组成,为一个杂合硫辛酸结构域(Miles and Guest1987);在该DNA片段的3’端还有部分编码丙酮酸脱氢酶E3-binding结构域的序列,参见图1-C;经实验证明,该部分序列对lipD的表达、结构和功能没有影响。

    用Nco I和Sal I酶切pET28-lipD,将lipD连接到pBAD24上,得质粒pBAD24-lipD;用Nco I和Xho I酶切pET28-lipD,将lipD连接到pET15上,得到质粒pET15-lipD,载体构建过程如下图2所示。

    将上述重组载体pET28-lipD、质粒pBAD24-lipD和质粒pET15-lipD转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,分析不同菌株apo domain表达量,结果显示:携带pET28-lipD质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,积累的apo domain蛋白最多,因此选取pET28-lipD质粒作为后续改造的初始载体。

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建

    克隆大肠杆菌lplA基因,经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收,用连接酶连接至载体pSU18,得表达载体pSU18-lplA;

    (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备

    A、扩增lipD基因片段:用pfuDNA聚合酶,以重组载体pET28-lipD为模板,pET28forward和lipD-lplANdeI为引物,PCR扩增300bp的lipD基因片段;

    其中,pET28forward为上游引物:TAATACGACTCACTATAGGGG(SEQ ID NO.1);

    lipD-lplANdeI(下游引物):

    GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC(SEQ ID NO.2);

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,lipD-lplANdeI和lplADown为引物,PCR扩增lplA基因片段;

    lipD-lplANdeI(上游引物):

    GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC(SEQ ID NO.3);

    lplADown(下游引物):CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC(SEQ ID NO.4);

    C、纯化上述步骤(3)中A所述的lipD和B所述的lplA基因片段,以等量的lipD和lplA基因片段为模板,以pET28forward和lplADown为引物,PCR扩增连接lipD和lplA基因片段,纯化连接片段,并在TaqDNA聚合酶作用下,在片段3’端加尾,再次纯化片段,进行TA克隆,并转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA;

    将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NoclI和BamHI双酶切并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-lplA(参见图3);重组载体pET28-lipD-lplA转至大肠杆菌表达菌株BL21中,得大肠杆菌转化子lipD-lplA/BL21。

    (4)重组载体pBAD34-lipA的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因,TA克隆连接至载体pMD19-T,通过PstI和BspHI双酶切克隆至pBAD34载体,构建重组载体pBAD34-lipA;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(3)中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤(4)所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS56)。

    一种α-硫辛酸的制备方法,具体为:将上述生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS56)的诱导表达:将步骤(5)所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS56)于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h,即得R-(+)-α-硫辛酸,产量参见图7。

    实施例2

    一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建:参见实施例1步骤(1);

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建:参见实施例1步骤(2);

    (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备

    A、扩增lipD基因片段:参见实施例1步骤(3)中A;

    B、扩增lplA基因片段:参见实施例1步骤(3)中B;

    C、参见实施例1步骤(3)中C;

    (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建(参见图4)

    A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因和metK基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、以表达载体pBAD34-lipA为模板,

    SEQ ID NO.5:GTAAGTAATTACTGCAGGATTAC为上游引物;

    SEQ ID NO.6:

    GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCAT CCCTTTCG为下游引物(该下游引物包括lipA的3’末端序列(23bp)、XbaI位点、载体pBAD43的SD序列(14bp)、NdeI和BamHI位点),PCR扩增得lipA-SD基因片段,将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切,得载体pSU18-lipA-SD,再将载体pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切,得pBAD24-lipA-SD;

    D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切,用连接酶连接,得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK;

    E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收,得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK;

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(4)中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA,共同导入BL21,得生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS59);

    一种α-硫辛酸的制备方法,具体为:将上述步骤(5)所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS59)于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时,即得R-(+)-α-硫辛酸,其产量能达到340ng/mg细胞干重,参见图7。

    实施例3

    一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建:参见实施例1步骤(1);

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建:参见实施例1步骤(2);

    (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建

    为使lplA和lipD的表达量达到最佳平衡,本实施例在lplA之前增加一个tac启动子。

    A、扩增tac启动子基因:以pfuDNA为聚合酶,质粒pGSS331为模板,Ptacpromoter down和Ptacpromoter up为引物,PCR扩增得105bp的tac启动子基因;

    Ptacpromoter up(上游引物):

    GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT(SEQ ID NO.7);

    Ptacpromoter down(下游引物):

    GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG(SEQ ID NO.8);

    B、扩增lplA基因片段:以重组载体pSU18-lplA为模板,Promoter-lplA up和T7为下游引物,PCR扩增得1.4kb的lplA基因片段;

    Promoter-lplA up(上游引物):

    CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC(SEQ ID NO.9);

    T7下游引物:GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG(SEQ ID NO.10);

    C、以等量的步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板,用Ptacpromoter up和T7作为引物,用pfuDNA聚合酶将tac启动子PCR连接到lplA基因前,纯化连接片段tac-lplA,在TaqDNA聚合酶作用下,于tac-lplA基因片段加3’端加尾,并进行TA克隆,转化大厂杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并连接至载体pMD19-T中,得表达载体pMD19-T-tac-lplA;

    Ptacpromoter up上游引物:GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT(SEQ ID NO.7);

    T7下游引物:GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG(SEQ ID NO.10)。

    D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切,并纯化回收,用连接酶连接,得重组载体pET28-lipD-tac-lplA(参见图5);用热激法,将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,得大肠杆菌转化子lipD-tac-lplA/BL21;

    (4)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建

    以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板,PCR扩增得到lipA基因,并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T,得pMD19-T-lipA;

    B、表达载体pBAD34-lipA的构建

    将表达载体pBAD34和步骤(5)中A中所述的pMD19-T-lipA,经PstI和BspHI双酶切连接,得表达载体pBAD34-lipA;

    C、将pBAD34-lipA与pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21,得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS61);

    一种α-硫辛酸的制备方法,具体为:将步骤(4)中C所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株BL21/pET28-lipD-tac-lplA&pBAD34-lipA(YS61)于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h,即得R-(+)-α-硫辛酸,产量能达到520ng/mg细胞干重,具体参见图7。

    实施例4

    一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法,包括如下步骤:

    (1)原核表达载体pET28-lipD的构建:参见实施例1步骤(1);

    (2)表达载体pSU18-lplA的构建:参见实施例1步骤(2);

    (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建

    A:扩增tac启动子基因:参见实施例3步骤(3)中A;

    B、扩增lplA基因片段:参见实施例3步骤(3)中B;

    C、表达载体pMD19-T-tac-lplA的构建:参见实施例3步骤(3)中C;

    D、参见实施例3步骤(3)中D;

    (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建:参见实施例2步骤(4);

    (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备

    将步骤(4)中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中,即得生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS58)。

    一种α-硫辛酸的制备方法,具体为:将上述步骤(5)制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS58)转接至LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6小时后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时,得出硫辛酸的产量能达到350ng/mg细胞干重,具体参见图7。

    实施例5

    将实施例1制得的菌株YS56、实施例2制得的菌株YS59,实施例3制得的菌株YS61和实施例4制得的菌株YS58分别转接至LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6小时后,以辛酸为底物,IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时,通过HPLC和生物学方法测定了各菌株硫辛酸的产量,结果参见图7。

    其中,HPLC的测定方法为:

    用0.45μM微孔滤膜过膜处理的KH2PO3(pH为2.0,浓度25mM)和HPLC级甲醇以25:75的体积比混合液做为流动相,流速每分钟1ml,进样10μl,采用Waters公司的C18柱在330nm紫外吸收光波长处测定硫辛酸的含量。具体操作:

    (1)过夜洗柱平衡色谱柱:先以100%甲醇平衡30min,后25:75体积比的水与甲醇平衡60min,再用25:75体积比的KH2PO3与甲醇洗柱平衡60min,最后用25:75体积比的KH2PO3与甲醇低流速平衡过夜;

    (2)样品测定:用25:75体积比的KH2PO3与甲醇平衡色谱柱20min,用330nm紫外波长检测基线成一条直线后,开始进样测定:进样10μl,25:75体积比的KH2PO3与甲醇做为流动相,1ml/min恒流测定样品;

    (3)测定样品后洗柱:采用25:75体积比的KH2PO3与甲醇平衡洗柱30min,然后用25:75体积比的水与甲醇平衡30min,最后用100%甲醇60min处理色谱柱。

    标样的测定,分别配制了0.01mg/ml、0.025mg/ml、0.0500mg/ml、0.075mg/ml、0.1000mg/ml、0.2mg/ml的硫辛酸标样,然后根据各标样吸收面积测出硫辛酸的面积浓度比标准曲线,得到其线性回归方程,再根据方程推算出样品硫辛酸浓度。

    从图6可知:实施例1制得的菌株YS56的产量明显高于野生型大肠杆菌BL21。

    从图7中可知:2YT培养基培养所产生硫辛酸,产量远高于其它培养基,其中,实施例1制得的菌株YS56的产量为1.56mg/L、实施例2制得的菌株YS59的产量为1.06mg/L,实施例3制得的菌株YS61的产量达2.1mg/L、实施例4制得的菌株YS58的产量为1.44mg/L。

    而在LB和2YT添加微量元素Fe的培养基中,硫辛酸的最高产量也未超过1.4mg/ml。初步表明2×YT是一种适合积累硫辛酸的培养基。采用同样的方法测定了大肠杆菌BL21(DE3)和MG1655的硫辛酸产量,约为0.005mg/L。这表明菌株lipD-tac-lplA-lipA/BL21生物合成硫辛酸的量是野生大肠杆菌的100倍以上。

    实施例6硫辛酸活性测定

    使用TM136的硫辛酸代谢突变菌株进行定性鉴定。该突变株在添加活性硫辛酸的基础培养基上能正常生长,而在不添加硫辛酸的基础培养基上不能正常生长。分别在基础培养基中添加500ng/ml硫辛酸标准样品或水解萃取的1ml硫辛酸样品25μl,同时做基础培养基空白对照。划线接种TM136于每种培养基平板,在37℃同样的条件培养过夜,检测其生长情况。

    结果表明:实施例1-4所述的发酵菌株在添加活性硫辛酸的基础培养基上正常生长,且生产的硫辛酸具有很高的生物活性。

    以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

    α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法专利购买费用说明

    专利买卖交易资料

    Q:办理专利转让的流程及所需资料

    A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。

    1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

    2:按规定缴纳著录项目变更手续费。

    3:同时提交相关证明文件原件。

    4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

    Q:专利著录项目变更费用如何缴交

    A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

    Q:专利转让变更,多久能出结果

    A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。

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