专利摘要

本发明公开了一种副地衣芽孢杆菌以及制备富生物纳米硒益生菌的方法。副地衣芽孢杆菌，命名为BacillusparalicheniformisZJUSE‑1，于2017年3月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCCNo.13908，发酵后得到富生物纳米硒益生菌。生物纳米硒被含多糖及蛋白特征基团的分泌物包被，具有抗氧化活性，能够清除DPPH自由基、超氧阴离子。生物纳米硒与益生菌发挥协同作用，能够有效修复机体氧化损伤，缓解幼仔因断奶导致的氧化应激，提高养殖生产的经济效益。

权利要求

1.一种副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）ZJUSE-1，其特征在于，于2017年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.13908，发酵后得到富生物纳米硒益生菌。

2.一种采用如权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）ZJUSE-1制备富生物纳米硒益生菌的方法，其特征在于，

包括以下步骤：

1）活化的菌接种于发酵培养基中，加入亚硒酸钠溶液；

2）振荡培养；

3）收集发酵液，离心后收集沉淀，加入PBS清洗；

所述的发酵培养基：葡萄糖 20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠5g/L，无水硫酸镁1.5g/L；初始pH=7.0。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的培养基中亚硒酸钠终浓度为5mM。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中培养温度为37℃，转速为250rpm，培养时间为72小时。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述发酵液中亚硒酸钠未检出，活菌数含量为6-8亿/mL。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述沉淀为Bacillus paralicheniformis ZJUSE-1及其合成的生物纳米硒复合物，称为富生物纳米硒益生菌。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及制备富生物纳米硒益生菌及其抗氧化应用。

背景技术

硒是动物和人所必需的微量元素，参与机体多个主要代谢途径，对健康至关重要。研究表明，硒具有抗癌抗氧化、提高免疫力、防治克山病、大骨节病、调节机体新陈代谢等多种功能。

近年来，纳米硒作为一种高生物学活性、高安全性的新型硒添加形式引起了广泛的关注。但是，纳米硒的合成往往通过化学方法，即利用抗坏血酸、硫代硫酸钠等还原剂，在额外添加牛血清白蛋白等稳定剂的条件下，还原硒酸盐或亚硒酸盐制备而成。该过程不仅耗费资源，并且易向终产物中掺入化学品残留，造成潜在毒性。

以细菌或真菌进行纳米硒生物制备，不受季节环境等因素的制约，具有生产力强等优点，能有效改善化学制备存在的不足。如CN105602997A公开了Enterobacter cloacae制备生物纳米单质硒的方法及应用，制备的生物纳米单质硒或者复合物添加至猪饲料中替代亚硒酸钠。

益生菌作为对宿主健康有促进作用的微生物活体，具有提高机体免疫力、维持肠道菌群平衡，抗肿瘤等生物学功能。近年来利用益生菌还原生成纳米硒-益生菌复合物，能有效兼顾两者的优点，加强产物抗氧化功能，可能成为未来硒添加的一种新型、安全、高效的方法。

CN105420280A所公开的利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法中，亚硒酸钠还原率仅能达到80%左右，产物具有潜在毒性。CN105285327A所公开的利用乳酸菌制备富硒乳酸菌生物饲料添加剂的方法中，所涉及的制备过程需严格厌氧，对发酵工艺及设备要求较高。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种副地衣芽孢杆菌以及制备富生物纳米硒益生菌的方法。

一种副地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus paralicheniformis ZJUSE-1，于2017年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号：CGMCC No. 13908，发酵后得到富生物纳米硒益生菌。

所述的生物纳米硒被含多糖及蛋白特征基团的分泌物包被，具有抗氧化活性，能够清除DPPH自由基、超氧阴离子。

一种采用所述的副地衣芽孢杆菌制备富生物纳米硒益生菌的方法，

包括以下步骤：

1）活化的菌接种于发酵培养基中，加入亚硒酸钠溶液；

2）振荡培养；

3）收集发酵液，离心后收集沉淀，加入PBS清洗；

所述的发酵培养基：葡萄糖 20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠5g/L，无水硫酸镁1.5g/L；初始pH=7.0。

步骤1）所述的培养基中亚硒酸钠终浓度为5mM。

步骤2）中培养温度为37℃，转速为250rpm，培养时间为72小时。

步骤3）所述发酵液中亚硒酸钠未检出，活菌数含量为6-8亿/mL。

步骤3）所述沉淀为Bacillus paralicheniformis ZJUSE-1及其合成的生物纳米硒复合物，称为富生物纳米硒益生菌。

本发明的有益效果是：

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis SR14ZJUSE-1，具有完全还原高浓度亚硒酸钠，并生成生物纳米硒的能力。在发酵过程中，B. paralicheniformis ZJUSE-1通过分泌多糖等活性物质包被纳米硒，发酵产物的抗氧化活性得到提高，具有高效清除DPPH自由基、超氧阴离子的能力。生物纳米硒与益生菌发挥协同作用，能够有效修复机体氧化损伤，缓解幼仔因断奶导致的氧化应激，提高养殖生产的经济效益。

附图说明

图1是富生物纳米硒益生菌场扫描电镜图片；

图2是富生物纳米硒益生菌傅里叶红外变换光谱结果；

图3 是富生物纳米硒益生菌透射电镜图片；

图4 是富生物纳米硒益生菌清除DPPH自由基结果；

图5 是富生物纳米硒益生菌清除超氧阴离子结果。

具体实施方式

实施例1以B. paralicheniformis ZJUSE-1和亚硒酸钠制备富生物纳米硒益生菌

1. 培养基配制

LB平板培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂20g，去离子水1L，121℃高温灭菌21min。

种子培养基：葡萄糖 15g，胰蛋白胨4g，酵母提取物6g，NaCl 10g，去离子水1L，121℃高温灭菌21min。

发酵培养基：葡萄糖 20g，胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，K2HPO4 1g，NaCl 5g，MgSO4 15g，去离子水1L，初始pH为7.0，115℃高温灭菌30min。

2. 菌种活化

将冻存于-80℃的B. paralicheniformis ZJUSE-1菌种常温解冻，取一环在LB平板培养基划线，于37℃培养12h。

从平板培养基挑取单菌落接种于种子培养基中，于37℃，250rpm培养12小时作为种子液。

3. 发酵与产物收集

将活化的B. paralicheniformis ZJUSE-1种子液以PBS稀释至OD600=1.0，以1%接种量接种至含5mM亚硒酸钠的发酵培养基中。于37℃，250 rpm培养72小时。培养结束后，取发酵液于5000× g， 离心15分钟，沉淀以PBS清洗3次，得到富生物纳米硒益生菌产物。

经涂板计数，产物活菌数为6.0-7.3亿/mL。

参照国标GB/T 13883-2008对产物总硒含量进行测定，结果表明，产物硒含量为13000-20000mg/kg。

4. 亚硒酸钠残留量检测

参照国标GB 1903.9-2015对发酵液中亚硒酸钠残留量进行检测，结果表明：发酵液中亚硒酸钠未检出，即B. paralicheniformis ZJUSE-1已将5mM亚硒酸钠完全还原。另进行亚硒酸钠还原能力实验，结果表明B. paralicheniformis ZJUSE-1无法将10mM亚硒酸钠完全还原，还原效率为65%。

实施例2 B. paralicheniformis ZJUSE-1对亚硒酸钠的耐受能力分析

1. 培养基配置

配置含梯度浓度（0, 5, 10,15,20mM）亚硒酸钠的LB平板培养基。

2. 菌种活化

将冻存于-80℃的B. paralicheniformis ZJUSE-1菌种常温解冻，取一环在各含硒LB平板培养基上划线，于37℃培养24h。

3. 结果分析

培养结束后，结果表明B. paralicheniformis ZJUSE-1可在最高含15mM亚硒酸钠的LB平板培养基生长。

亚硒酸钠属6.1类剧毒化学品。在纳米硒生产中，若产物中存在亚硒酸钠残留，极易对后续生产应用造成危害。

CN1706459A所公开的利用富硒乳酸菌制剂制备方法中，乳酸菌未能完全还原无机硒，需要用水洗涤沉淀物，从而除去未还原的无机硒，其发酵产物可能存在无机硒残留，具有潜在毒性。CN105420280A所公开的利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法中，亚硒酸钠还原率仅能达到80%左右，产物具有潜在毒性。本发明中B. paralicheniformis ZJUSE-1对高浓度亚硒酸钠还原率达到100%，可以有效简化制备步骤，同时降低应用风险。

实施例3富生物纳米硒益生菌特征分析

1. 场扫描电镜结果

取实施例1中的富生物纳米硒益生菌产物，以2.5%戊二醛固定12小时。依次通过PBS清洗，1%锇酸固定，酒精梯度脱水，乙酸异戊酯处理，临界点干燥后，镀膜，在场发射扫描电镜下观察。

结果如图1所示：B. paralicheniformis ZJUSE-1将亚硒酸钠还原生成生物纳米硒，分泌有机物将生物纳米硒包裹并释放至胞外。箭头所指即为生物纳米硒。

2. 傅里叶红外变换光谱结果

取实施例1中的富生物纳米硒益生菌产物，于60℃烘箱干燥12小时。取干燥的产物，通过傅里叶红外变换光谱仪检测B. paralicheniformis ZJUSE-1合成的生物纳米硒表面的活性物质组成。

结果如图2所示：产物中生物纳米硒表面包被由益生菌B. paralicheniformis ZJUSE-1分泌的含多糖及蛋白特征基团的活性物质。

3. 透射电镜结果

取实施例1中的富生物纳米硒益生菌产物，以2.5%戊二醛固定12小时后。依次通过PBS清洗，预包埋处理，1%锇酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察。

结果如图3所示：产物中生物纳米硒，呈单分散均匀球状，粒径在150 nm左右，由B. paralicheniformis ZJUSE-1释放至胞外。

本发明通过场扫描电镜、透射电镜及傅里叶变换红外光谱分析，确定了产物为生物纳米硒，并由B. paralicheniformis ZJUSE-1合成的含多糖及蛋白特征基团的分泌物包被，提高了产物的稳定性及生物学活性。

此外，研究表明，将益生菌与纳米硒存在协同作用，可改善肠道菌群，缓解肠道氧化应激，因此富生物纳米硒益生菌具有广阔的应用前景。

实施例4富生物纳米硒益生菌抗氧化功能检测

1. 富生物纳米硒益生菌清除DPPH自由基结果

DPPH是一种人工合成的自由基，易溶于无水乙醇，呈紫色，在517nm处有一强吸收峰。DPPH存在单电子，可与抗氧化剂配对，其褪色程度与接受的电子数量成定量关系，因此可用分光光度计进行快速的定量分析，从而评价生物式样的体外抗氧化功能。

取实施例1中的富生物纳米硒益生菌产物重悬于PBS中，并稀释至0.1、0.2、0.25、0.5、1和2mM梯度浓度。

（1）取不同浓度的富生物纳米硒益生菌悬液各100微升于96孔板，每孔加入0.2mMDPPH乙醇溶液100微升，避光反应30分钟后，于517nm测定吸光度A。

（2）取各浓度悬液100微升，每孔加入无水乙醇溶液100微升，避光反应30分钟后，于517nm测定吸光度B。

（3）取0.2mM DPPH乙醇溶液100微升，加入无水乙醇100微升，避光反应30分钟后，于517nm测定吸光度C。

DPPH清除率（%）=[A-B]/C*100%

结果如图4所示：富生物纳米硒益生菌对DPPH自由基具有显著的清除作用。随着富生物纳米硒益生菌悬液浓度升高，其对DPPH自由基的清除率逐渐增加。

2. 富生物纳米硒益生菌清除超氧阴离子结果

超氧阴离子是一种生物体所产生的自由基，一旦其过量产生，会对机体造成氧化损伤。可通过测定生物式样的清除超氧阴离子能力，评价其体外抗氧化功能。

取实施例1中的富生物纳米硒益生菌产物重悬于PBS中，并稀释至0.1、0.2、0.25、0.5、1和2mM梯度浓度。通过模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化镁反应系统，产生超氧阴离子，加入不同浓度的富生物纳米硒益生菌悬液、电子传递物及显色剂，最终液体呈紫红色，于550nm处测定吸光度。

结果如图5所示：富生物纳米硒益生菌对超氧阴离子具有显著的清除作用。随着富生物纳米硒益生菌悬液浓度升高，其对超氧阴离子的清除率逐渐增加。

一种副地衣芽孢杆菌以及制备富生物纳米硒益生菌的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。