专利摘要

本发明公开了一种非脱羧勒克菌在降解正十六烷过程产表面活性剂的提取及定性方法。该方法基于对非脱羧勒克菌降解正十六烷过程中的发酵液进行粗提‑纯化得到表面活性剂纯品，同时对细菌发酵液进行排油圈、乳化性实验并对纯品做薄层层析、傅立叶变换红外光谱分析初步鉴定该菌在代谢正十六烷过程中产生了磷脂类表面活性剂。正十六烷是一类油状石油烃，难溶于水，而表面活性剂可增大水‑正十六烷的界面张力，增大菌体与正十六烷接触的比表面积，提高生物有效性。该菌适用于受直链石油污染的环境的修复。

权利要求

1.一种通过非脱羧勒克菌降解正十六烷制备表面活性剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将OD600值为0.6~0.8的非脱羧勒克菌富集菌液接至体积浓度为0.3%的正十六烷的无机盐培养基中（MSM），菌株富集液与培养基的体积比为1：9，在37℃，160rpm摇床中培养；

（2）培养16d后，将培养液离心以去除菌体，离心条件为：4℃，8000r/min，5min；取上清液，用浓度为6mol/L 的盐酸溶液调pH至2，有絮状物产生；

（3）4℃静置12h，再次在8000r/min下离心5min，得到沉淀；

（4）将得到的沉淀连续酸洗-碱洗后得到淡黄色表面活性剂粗品，粗品经乙酸乙酯萃取后于-55℃真空冷冻干燥，得到表面活性剂纯品；

所述MSM中pH为5~9，成分包含KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1g/L，NH4Cl 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.01g/L，NaCl 5~150g/L，微量元素液 1vol%，所述微量元素液的组分如下：CaCl20.01g/L，FeCl3 0.5g/L，CuSO4 0.38g/L，ZnSO4 1.15g/L，MnSO4 1.69g/L，溶剂为水。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过非脱羧勒克菌降解正十六烷制备表面活性剂的方法。

背景技术

随着我国石油工业的不断发展，遭受石油污染的环境不断扩大，污染程度也日益严重。直链烷烃在石油烃中比重较大，具有化学性质稳定，有毒及疏水性强的特点，利用微生物降解此类物质是当前主流的方法。然而，微生物表面通常呈现为亲水性，极性的差异会导致菌体污染物利用率低，影响微生物对污染物的降解。为促进微生物对烷烃的利用率，人为添加化学类表面活性剂可提高石油烃的乳化性，降低其与水的界面张力，增大其与菌体的比表面积，提高烷烃的生物有效性。相比与化学表面活性剂，具有成本高，毒性强的特点，生物表面活性剂具有广谱环境适应性、生物可降解性、环境友好性及高效性等特征。因此，找到产生物表面活性剂又能高效降解正十六烷的微生物，对实用于受石油污染环境的修复具有重要意义。

截至目前，已发现能产生表面活性剂的石油降解微生物主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌(Rhodococcus)、诺卡式菌属(Nocardia)、黑粉菌属(Ustilago)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Archrobacter)、硫杆菌属(Thaobacaldar)等。

生物表面活性剂的类型按化学结构可分为糖脂类生物表面活性剂、中性脂类生物表面活性剂、含氨基酸类脂生物表面活性剂、磷脂类生物表面活性剂及聚合类生物表面活性剂。

非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)为肠杆菌科的一种，有关其在修复受石油污染环境的研究较少。该菌在代谢正十六烷过程中可产生磷脂类生物表面活性剂。同时，此类表面活性剂对石油烃具有较强排油性及乳化性，可促进微生物对其利用率。上述发现之前均未有报道过。

发明内容

本发明的旨在克服现有技术的不足，提供一种通过非脱羧勒克菌降解正十六烷制备表面活性剂的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种通过非脱羧勒克菌降解正十六烷制备表面活性剂的方法，包括以下步骤：

(1)将OD600值为0.6～0.8的非脱羧勒克菌富集菌液接至体积浓度为0.3％的正十六烷的无机盐培养基中(MSM)，菌株富集液与培养基的体积比为1：9，在37℃，160rpm摇床中培养。

(2)培养16d后，将培养液离心以去除菌体(4℃，8000r/min，5min)，去取上清液，用浓度为6mol/L的盐酸溶液调pH至2，有絮状物产生。

(3)4℃静置12h，再次离心(8000r/min，5min)得到沉淀；

(4)将得到的沉淀连续酸洗-碱洗后得到淡黄色表面活性剂粗品，粗品经乙酸乙酯萃取后于-55℃真空冷冻干燥，得到表面活性剂纯品。

所述MSM中pH为5～9，成分包含KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1g/L，NH4Cl 0.5g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.01g/L，NaCl 5～150g/L，微量元素液1vol％，所述微量元素液的组分如下：CaCl2 0.01g/L，FeCl3 0.5g/L，CuSO4 0.38g/L，ZnSO4 1.15g/L，MnSO4 1.69g/L，溶剂为水。

本发明的有益效果在于：本发明对非脱羧勒克菌在代谢正十六烷过程中产生的表面活性剂进行提取，提取得到的表面活性剂中含有磷脂成分，该成分主要作用体现在提高正十六烷的乳化性，增大正十六烷与水的液面张力促进细菌对正十六烷的利用。可实际应用于修复受直链石油污染的土壤、水体环境。同时具有环境友好性，高效性，生物可降解性等特点。

附图说明

图1为菌株A14发酵液、菌株B45发酵液和无菌水的排油效果图。

图2为菌株A14、菌株B45发酵液经粗体-纯化后的产物的薄层层析结果图。

图3为菌株A14、菌株B45发酵液的乳化效果图。

图4为菌株A14、B45纯化后的生物表面活性剂的傅立叶红外光谱图。

具体实施方式

本发明基于对非脱羧勒克菌降解正十六烷过程中的发酵液进行粗提-纯化得到表面活性剂纯品，该表面活性剂可提高正十六烷的乳化性，增大正十六烷与水的界面张力，进而促进细菌对正十六烷的利用率。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实验例一:排油圈实验验证表面活性剂的排油效果

分别取非脱羧勒克菌B45和A14的富集菌液(OD600值为0.6)，分别进行如下操作。

(1)接至体积浓度为0.3％的正十六烷的无机盐培养基中(MSM)，菌株富集液与培养基的体积比为1：9，在37℃，160rpm摇床中培养。

(2)培养16d后，将培养液离心以去除菌体(4℃，8000r/min，5min)，去取上清液，用浓度为6mol/L的盐酸溶液调pH至2，有絮状物产生。

(3)4℃静置12h，再次离心(8000r/min，5min)得到沉淀；

(4)将得到的沉淀连续酸洗-碱洗后得到淡黄色表面活性剂粗品，粗品经乙酸乙酯萃取后于-55℃真空冷冻干燥，得到表面活性剂纯品。

所述MSM中pH为9，成分包含KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1g/L，NH4Cl 0.5g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.01g/L，NaCl 5～150g/L，微量元素液1vol％，所述微量元素液的组分如下：CaCl2 0.01g/L，FeCl3 0.5g/L，CuSO4 0.38g/L，ZnSO4 1.15g/L，MnSO4 1.69g/L，溶剂为水。

排油圈实验方法：向干燥洁净的玻璃平板加入30ml无菌水，向静置的水面中央缓慢滴加300μL含质量浓度为5％的苏丹Ⅲ-液体石蜡，待油膜完全散开后，在油膜中央缓慢滴加200μL表面活性剂溶液(溶剂为水，浓度为1μg/μL)，并以无菌水作空白对照。静置2min待油圈扩散稳定，如图1所示。排油圈直径与排油效果呈正比，即菌株B45产生的表面活性剂排油效果较优于菌株A14。

实验例二:薄层层析初步鉴定表面活性剂类型

分别取非脱羧勒克菌B45和A14的富集菌液(OD600值为0.8)，分别进行如下操作。

(1)接至体积浓度为0.3％的正十六烷的无机盐培养基中(MSM)，菌株富集液与培养基的体积比为1：9，在37℃，160rpm摇床中培养。

(2)培养16d后，将培养液离心以去除菌体(4℃，4000r/min，30min)，去取上清液，用浓度为6mol/L的盐酸溶液调pH至2，有絮状物产生。

(3)4℃静置12h，再次离心(4000r/min，25min)得到沉淀；

(4)将得到的沉淀连续酸洗-碱洗后得到淡黄色表面活性剂粗品，粗品经乙酸乙酯萃取后于-55℃真空冷冻干燥，得到表面活性剂纯品。

所述MSM中pH为5，成分包含KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1g/L，NH4Cl 0.5g/L，MgSO40.5g/L，KCl 0.01g/L，NaCl 5～150g/L，微量元素液1vol％，所述微量元素液的组分如下：CaCl2 0.01g/L，FeCl3 0.5g/L，CuSO4 0.38g/L，ZnSO4 1.15g/L，MnSO4 1.69g/L，溶剂为水。

薄层层析实验方法：分别取两种菌株产生的表面活性剂纯品，用甲醇溶解，然后点样于硅胶G板，以CHCl3/CH3OH/H2O(V:V:V＝65:15:4)作层析液展开表面活性剂纯品，待层析液跑至G板上沿，取出G板放置通风橱吹走层析液，分别以苯酚-硫酸(使糖脂呈棕色斑点)、磷钼酸-乙醇(使磷脂呈淡蓝色斑点)及茚三酮(使脂肽呈紫红色斑点)作显色剂喷洒至G板上，放置高温环境即发生显色。结果显示经磷钼酸-乙醇试剂显色，在Rf(比移值)分别为0.52和0.33处出现淡蓝色斑点，即初步确定纯品中含磷脂成分。Rf值反映出纯品的极性大小，极性越大Rf值越小，说明菌株B45产生的表面活性剂极性强于菌株A14，易溶于水。

实验例三：乳化性实验

按照实施例1的方法，分别通过非脱羧勒克菌B45和A14制备得到表面活性剂纯品。并制得表面活性剂溶液(溶剂为水，浓度为1μg/μL)。

乳化实验方法：分别取3ml菌株A14和菌株B45的表面活性剂溶液，并加3ml石蜡，充分振荡摇匀后静置24h，乳化指数＝乳化液体积/总体积*100％。如图3所示，菌株A14和B45的发酵液乳化指数分别为58.3％和70％，菌株B45发酵液乳化效果强于菌株A14。

实验例四：傅立叶红外光谱定性纯品

按照实施例1的方法，分别通过非脱羧勒克菌B45和A14制备得到表面活性剂纯品。

纯品定性方法：取一定量表面活性剂纯品与干燥后的KBR一起碾磨，压片后利用傅立叶红外光谱仪在波数为4000cm-1-400cm-1下，扫描样品。红外光谱如图4所示，3289cm-1处峰强且宽没有分裂，是分子间氢键伸缩振动。2965、2931cm-1出现的吸收峰分别为-CH3和-CH2-中C-H伸缩振动所致，产物中含饱和脂肪链。烯烃C＝C在1680-1620cm-1处伸缩振动。1537和1405cm-1为C＝O吸收带振动耦合形成的双峰。C-O伸缩振动出现在1320-1210cm-1。多数学者发现磷脂键(P-O-C)的特征峰大致在1090-1040cm-1处，结合薄层层析结果确定菌株A14和B45代谢正十六烷过程中产生了磷脂类表面活性剂，产量分别为0.564和0.657g/L。

一种通过非脱羧勒克菌降解正十六烷制备表面活性剂的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。