专利摘要

本发明公开了催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用。本发明通过定点突变BFD发现该酶的突变体，利用该酶的突变体实现了甲醛高效聚合，同时利用F/XPK实现了羟基乙醛或1,3‑二羟基丙酮(DHA)生成乙酰磷酸，结合磷酸乙酰转移酶(Pta)，三步酶就能够实现甲醛到乙酰辅酶A，从而创建一条新的甲醛同化途径‑甲醛三步合成乙酰辅酶A，此途径路线短，且没有碳损失及ATP输入。

权利要求

1.BFD突变体蛋白，为如下1)-4)中任一所示：

1)所示的BFD突变体W86R-N87T的氨基酸序列为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；

2)所示的BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；

3)所示的BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-A460M为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第460位的丙氨酸突变为甲硫氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；

4)所示的BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第460位的丙氨酸突变为甲硫氨酸，且将第281位的组氨酸突变为缬氨酸，且将第282位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。

2.编码权利要求1所述的蛋白的DNA分子。

3.含有权利要求2所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮中的应用；

或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮产品中的应用；

或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化甲醛生成乙酰辅酶A或乙酰磷酸中的应用；

或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化甲醛生成乙酰辅酶A或乙酰磷酸产品中的应用。

5.权利要求1所述蛋白和F/XPK蛋白在催化甲醛产生乙酰磷酸中的应用；

或权利要求1所述蛋白和F/XPK蛋白在制备催化甲醛产生乙酰磷酸产品中的应用；

或权利要求1所述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶在催化甲醛产生乙酰辅酶A中的应用；

或权利要求1所述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶在制备催化甲醛产生乙酰辅酶A产品中的应用。

6.一种制备羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮的方法，包括如下步骤：以甲醛为底物，用权利要求1所述蛋白催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮。

7.一种利用甲醛生产乙酰辅酶A的方法，包括如下步骤：在权利要求1所述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶的作用下催化甲醛生产乙酰辅酶A。

8.一种催化甲醛产生乙酰磷酸的产品，包括权利要求1所述蛋白和F/XPK蛋白。

9.一种催化甲醛产生乙酰辅酶A的产品，包括权利要求1所述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用。

背景技术

自然界中甲基营养菌能够利用碳一资源合成生长所必需的代谢物。甲基营养菌主要有三种途径同化甲醛，分别是核酮糖单磷酸途径(RuMP)、丝氨酸循环途径和甲醛完全氧化之后的Calvin-Benson-Bassham(CBB)循环途径。在核酮糖单磷酸途径(RuMP)中，三分子甲醛缩合成一分子丙酮酸，然后脱羧形成乙酰辅酶A和CO₂，此过程碳利用率为67％。丝氨酸循环途径需要外部供应ATP以驱动热力学不利反应。同样，甲醛完全氧化成CO₂然后利用Calvin-Benson-Bassham(CBB)循环固定CO₂也需要额外的ATP。ATP的供应必须消耗额外的碳来驱动氧化磷酸化。存在于Clostridium ljungdahlii的还原乙酰辅酶A途径，能够同化甲醛氧化的二氧化碳产生乙酰辅酶A，此过程没有碳的损失。但是由于此路径对氧极其敏感，很难在其他物种中应用。人工合成路径-甲醇缩合循环(MCC)，由核酮糖单磷酸途径(RuMP)和非氧化性糖酵解(NOG)组成，此结合途径既没有碳的损失也不需要ATP的供应。甲醛聚糖途径是将三分子甲醛缩合为1,3-二羟基丙酮，1,3-二羟基丙酮磷酸化为DHAP(磷酸二羟基丙酮)。此过程中DHAP转化为乙酰辅酶A同样有碳的损失。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种BFD突变体蛋白。

本发明提供了BFD突变体蛋白，为如下1)-4)中任一所示：

1)所示的BFD突变体W86R-N87T的氨基酸序列为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；

2)所示的BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；

3)所示的BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-A460M为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第460位的丙氨酸突变为甲硫氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；

4)所示的BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M为将BFD氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第460位的丙氨酸突变为甲硫氨酸，且将第281位的组氨酸突变为缬氨酸，且将第282位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。

上述BFD氨基酸序列为序列表中序列1。

编码上述的蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化甲醛生成乙酰辅酶A或乙酰磷酸中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化甲醛生成乙酰辅酶A或乙酰磷酸产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白和F/XPK蛋白在催化甲醛产生乙酰磷酸中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白和F/XPK蛋白在制备催化甲醛产生乙酰磷酸产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶在催化甲醛产生乙酰辅酶A中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶在制备催化甲醛产生乙酰辅酶A产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种制备羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以甲醛为底物，用上述蛋白催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮。

本发明第三个目的是提供一种利用甲醛生产乙酰辅酶A的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在上述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶的作用下催化甲醛生产乙酰辅酶A。

本发明第四个目的是提供一种催化甲醛产生乙酰磷酸的产品。

本发明提供的产品，包括上述蛋白和F/XPK蛋白。

本发明第五个目的是提供一种催化甲醛产生乙酰辅酶A的产品。

本发明提供的产品，包括上述蛋白、F/XPK蛋白和磷酸乙酰转移酶。

本发明的实验证明，自然界不存在酶催化甲醛缩合为羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮及1,3-二羟基丙酮转化为乙酰磷酸，本发明通过定点突变BFD发现该酶的突变体，突变体能催化甲醛缩合为羟基乙醛，这是首次发现的，实现了甲醛高效聚合，同时利用F/XPK实现了羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮(DHA)生成乙酰磷酸，结合磷酸乙酰转移酶(Pta)，三步酶就能够实现甲醛到乙酰辅酶A，从而创建一条新的甲醛同化途径-甲醛三步合成乙酰辅酶A，此途径路线短，且没有碳损失及ATP输入。

附图说明

图1为pET-28a-BFD、pET-28a-F/XPK质粒图谱。

图2为F/XPK蛋白催化羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮得到乙酰磷酸。

图3为BFD突变体及F/XPK双酶催化甲醛得到乙酰磷酸。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、BFD突变体的制备

BFD酶的编码基因种属来源为Pseudomonas putida，BFD酶的氨基酸如序列1，BFD酶编码基因的核苷酸序列如序列2所示。

分别对BFD酶进行单点突变或者多点突变，得到表1所示的BFD突变体。

BFD突变体W86R-N87T为将BFD氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(Trp)突变为精氨酸(Arg)，且将第87位的天冬酰胺(Asn)突变为苏氨酸(Thr)，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T的编码基因为将BFD酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258位的tgg突变为cgt，且将第259-261位的aac突变为acc，其他碱基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E为将BFD氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(Trp)突变为精氨酸(Arg)，且将第87位的天冬酰胺(Asn)突变为苏氨酸(Thr)，且将第109位的亮氨酸(Leu)突变为甘氨酸(Gly)，且将第110位的亮氨酸(Leu)突变为谷氨酸(Glu)，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E的编码基因为将BFD酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突变为cgt，且将第259-261的aac突变为acc，且将第325-327的ctg突变为ggg，且将第328-330的ctg突变为gag，其他碱基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-A460M为将BFD氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(Trp)突变为精氨酸(Arg)，且将第87位的天冬酰胺(Asn)突变为苏氨酸(Thr)，且将第109位的亮氨酸(Leu)突变为甘氨酸(Gly)，且将第110位的亮氨酸(Leu)突变为谷氨酸(Glu)，且将第460位的丙氨酸(Ala)突变为甲硫氨酸(Met)，其他碱基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-A460M的编码基因为将BFD酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突变为cgt，且将第259-261的aac突变为acc，且将第325-327的ctg突变为ggg，且将第328-330的ctg突变为gag，且将第1378-1380位的gct突变为atg，其他碱基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M为将BFD氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(Trp)突变为精氨酸(Arg)，且将第87位的天冬酰胺(Asn)突变为苏氨酸(Thr)，且将第109位的亮氨酸(Leu)突变为甘氨酸(Gly)，且将第110位的亮氨酸(Leu)突变为谷氨酸(Glu)，且将第460位的丙氨酸(Ala)突变为甲硫氨酸(Met)，且将第281位的组氨酸(His)突变为缬氨酸(Val)，且将第282位的谷氨酰胺(Gln)突变为苯丙氨酸(Phe)，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M的编码基因为将BFD酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突变为cgt，且将第259-261的aac突变为acc，且将第325-327的ctg突变为ggg，且将第328-330的ctg突变为gag，且将第1378-1380位的gct突变为atg，且将第841-843位的cac突变为gtt，且将第844-846位的cag突变为ttt，其他碱基保持不变，得到的序列。

二、表达载体的构建

1、表达BFD突变体的载体的构建

各个表达BFD突变体的载体为将上述各个BFD突变体的编码基因插入pET-28a载体的NdeI和XhoI酶切位点之间得到的载体。

表达BFD酶的载体为将上述BFD酶的编码基因(序列2)插入pET-28a载体的NdeI和XhoI酶切位点之间得到的载体，命名为pET-28a-BFD(如图1左图)

2、表达F/XPK的载体的构建

F/XPK基因种属来源为Bifidobacterium adolescentis，F/XPK蛋白的氨基酸如序列3所示，F/XPK蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列4。

表达F/XPK的载体为将上述F/XPK蛋白的编码基因插入pET-28a载体的NdeI和XhoI酶切位点之间得到的载体，命名为pET-28a-F/XPK(如图1右图)。

三、BFD野生型、BFD突变体和F/XPK的表达

为了体外检测BFD突变体、F/XPK酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将上述二制备的大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-BFD、各个表达BFD突变体的载体、pET-28a-F/XPK分别转入E.coli BL21(DE3)中，获得表达BFD酶的重组菌、各个表达BFD突变体的重组菌和表达F/XPK的重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存，得到表达BFD酶的菌体、各个表达BFD突变体的菌体和表达F/XPK的菌体。

四、BFD野生型，BFD突变体和F/XPK的纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下分别对表达BFD酶的菌体、各个表达BFD突变体的菌体和表达F/XPK的菌体进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，重复一次；

c：洗脱杂蛋白：用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50mL含50mM，100mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白；

d：洗脱目的蛋白：用20mL含200mM咪唑的蛋白缓冲液(50mM磷酸钾，PH＝7.4，5mM MgSO₄)将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流川样品，制样，12％SDS-PAGE检测。

(3)换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加15mL不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复1次，得到BFD、F/XPK蛋白。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/mL，即得到BFD蛋白、各个BFD突变体蛋白和F/XPK蛋白。

实施例2、BFD突变体蛋白的功能检测

一、BFD突变体蛋白催化甲醛缩合为羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮

检测方法：将实施例1的三制备的表达BFD酶的重组菌、各个表达BFD突变体的重组菌和表达F/XPK的重组菌于200ml 2YT 37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，0.5mM IPTG 16℃诱导18h，3500rpm离心15min，蛋白缓冲液洗去培养基，收集菌体，再分别用20ml加入0.5mM TPP的蛋白缓冲液重悬。取500ul重悬菌液再加入500ul由蛋白缓冲液配制含0.5mM TPP的终浓度为5g/L的甲醛溶液，37℃，750rpm反应2h,离心取上清，进行液相检测。液相检测选用AMINEX HPX-87H,300X7.8MM柱子,5mM硫酸作为流动相，每次进样20ul,柱温箱35℃，200nm紫外条件下检测羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮，外标法确定含量。

结果如表1所示，可以看出，与未突变的BFD相比，BFD突变体蛋白催化甲醛缩合为1,3-二羟基丙酮产量均提高；

与未突变的BFD相比，双突变的BFD突变体中W86R-N87T的羟基乙醛产量最高，4突变的BFD突变体中W86R-N87T-L109G-L110E的羟基乙醛产量最高，5突变的BFD突变体中W86R-N87T-L109G-L110E-A460M的羟基乙醛产量最高，7突变的BFD突变体中W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M的羟基乙醛产量最高，且高于其余突变位点。

表1为BFD突变体活性检测

二、F/XPK蛋白催化羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮得到乙酰磷酸

1、检测试剂的配置：

2M PH7.5盐酸羟胺(100mL)：称取13.5g盐酸羟胺固体溶解于190mLddH₂O中，用固体氢氧化钠调节PH至6.5，后用ddH2O定容至200mL。

显色液1：15％三氯乙酸(10mL)，称取150mg三氯乙酸溶解于10mlddH₂O中。

显色液2：4M HCl(10mL)，取3.333mL浓盐酸溶解于ddH₂O中定容至10mL。

显色液3：5％三氯化铁(10mL)，称取50mg三氯化铁溶解于0.1M HCl中，定容至10mL。

2、反应

1)F/XPK催化羟基乙醛或1,3二羟基丙酮：

实验组：10mM 1,3二羟基丙酮或羟基乙醛、50mM Tri-Cl缓冲液pH7.4、20mM KH₂PO₄、2mg/mL F/XPK、1mM TPP、1mMMgCl₂；37℃震荡反应2h，得到反应液。

无酶对照：10mM 1,3二羟基丙酮或羟基乙醛、50mM Tri-Cl缓冲液pH7.4、20mM KH₂PO₄、1mM TPP、1mMMgCl₂；37℃震荡反应2h，得到反应液。

无底物对照：50mM Tri-Cl缓冲液pH7.4、20mM KH₂PO₄、2mg/mL F/XPK、1mM TPP、1mMMgCl₂；37℃震荡反应2h，得到反应液。

检测方法：取上述反应液75ul与75ul 2M PH7.5盐酸羟胺溶液30℃反应10min。后加入显色液1，显色液2，显色液3各50uL。将显色后的反应液12000rpm离心2min，取上清130ul，在505nm下测量(乙酰磷酸)其吸光值。

结果见图2，可以看出，上述BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M得到的羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮可在F/XPK蛋白催化下获得乙酰磷酸。

2)BFD突变体及F/XPK双酶催化甲醛得到乙酰磷酸

实验组：3g/L甲醛、50mM Tri-Cl缓冲液pH7.4、20mM KH₂PO₄、1mg/mL BFD或其突变体、2mg/mL F/XPK、1mM TPP、1mMMgCl₂；37℃震荡反应2h，得到反应液。

无酶对照：3g/L甲醛、50mM Tri-Cl缓冲液pH7.4、20mM KH₂PO₄、1mM TPP、1mMMgCl₂；37℃震荡反应2h，得到反应液。

无底物对照：50mM Tri-Cl缓冲液pH7.4、20mM KH₂PO₄、1mg/mL BFD或其突变体、2mg/mL F/XPK、1mM TPP、1mMMgCl₂；37℃震荡反应2h，得到反应液。

检测方法：取上述反应液75ul与75ul 2M PH7.5盐酸羟胺溶液30℃反应10min。后加入显色液1，显色液2，显色液3各50uL。将显色后的反应液12000rpm离心2min，取上清130ul，在505nm下测量(乙酰磷酸)其吸光值。

BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M结果如图3所示，可以看出，上述BFD突变体蛋白与F/XPK蛋白将甲醛催化得到乙酰磷酸。

三、乙酰磷酸在Pta酶的催化下合成乙酰辅酶A

1、PTA催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶A

1mg/ml PTA、20mM NH₄Cl、20mM KCl、1mM TPP、5mM MgCl₂、3mM乙酰磷酸(上述二的2中BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M和F/XPK催化甲醛得到的乙酰磷酸)、10mM磷酸钾、2mM辅酶A、50mM PH 7.5Tris-Cl Buffer，37℃震荡反应0min，10min，得到反应液。

检测方法：取反应液100ul加入900ul 50mM PH 7.5Tris-Cl Buffer，于233nm测量其吸光值，结果见表2。

表2为乙酰磷酸合成乙酰辅酶A检测数据

计算方法：

取反应0min时的OD233为E₁，反应10min时的OD233为E₂。乙酰辅酶A与辅酶A的摩尔消光系数之差为△ε。

C_{乙酰辅酶A}为乙酰辅酶A的浓度

C_{乙酰辅酶A}＝10*(E₂-E₁)/△ε

乙酰辅酶A浓度为0.98mM。

2、BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M、F/XPK及PTA三酶催化甲醛生成乙酰辅酶A

0.2mg/ml BFD突变体W86R-N87T-L109G-L110E-H281V-Q282F-A460M、0.2mg/ml F/XPK、0.2mg/ml PTA、20mM NH₄Cl、20mM KCl、1mM TPP、5mM MgCl₂、0.1g/L甲醛、10mM磷酸钾、2mM辅酶A、50mM PH 7.5Tris-Cl Buffer，37℃震荡反应2h，得到反应液。

检测方法：取反应液100ul加入900ul 50mM PH 7.5Tris-Cl Buffer，于233nm测量其吸光值.结果见表3。

表3为甲醛生成乙酰辅酶A检测数据

计算方法：

取反应0min时的OD233为Ea，反应120min时的OD233为Eb。乙酰辅酶A与辅酶A的摩尔消光系数之差为△ε。C_{乙酰辅酶A}为乙酰辅酶A的浓度

C_{乙酰辅酶A}＝10*(Eb-Ea)/△ε

可以看出，以甲醛为底物得到乙酰辅酶A浓度为0.257mM。

野生型BFD催化0.1g/L甲醛，得不到羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮，因此野生型BFD与其余两个酶反应检测不到乙酰辅酶A。

四、甲醛生物合成乙酰辅酶A途经获得

从上述可以看出，甲醛生物合成乙酰辅酶A途经可以为如下两条中任一条：

(1)

(2)

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Ala Ser Val His Gly Thr Thr Tyr Glu Leu Leu Arg Arg Gln Gly

1 5 1015

Ile Asp Thr Val Phe Gly Asn Pro Gly Ser Asn Glu Leu Pro Phe Leu

202530

Lys Asp Phe Pro Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Leu Ala Leu Gln Glu Ala

354045

Cys Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Gln Ala Ser Arg Lys Pro

505560

Ala Phe Ile Asn Leu His Ser Ala Ala Gly Thr Gly Asn Ala Met Gly

65707580

Ala Leu Ser Asn Ala Trp Asn Ser His Ser Pro Leu Ile Val Thr Ala

859095

Gly Gln Gln Thr Arg Ala Met Ile Gly Val Glu Ala Leu Leu Thr Asn

100 105 110

Val Asp Ala Ala Asn Leu Pro Arg Pro Leu Val Lys Trp Ser Tyr Glu

115 120 125

Pro Ala Ser Ala Ala Glu Val Pro His Ala Met Ser Arg Ala Ile His

130 135 140

Met Ala Ser Met Ala Pro Gln Gly Pro Val Tyr Leu Ser Val Pro Tyr

145 150 155 160

Asp Asp Trp Asp Lys Asp Ala Asp Pro Gln Ser His His Leu Phe Asp

165 170 175

Arg His Val Ser Ser Ser Val Arg Leu Asn Asp Gln Asp Leu Asp Ile

180 185 190

Leu Val Lys Ala Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Ala Ile Val Leu Gly

195 200 205

Pro Asp Val Asp Ala Ala Asn Ala Asn Ala Asp Cys Val Met Leu Ala

210 215 220

Glu Arg Leu Lys Ala Pro Val Trp Val Ala Pro Ser Ala Pro Arg Cys

225 230 235 240

Pro Phe Pro Thr Arg His Pro Cys Phe Arg Gly Leu Met Pro Ala Gly

245 250 255

Ile Ala Ala Ile Ser Gln Leu Leu Glu Gly His Asp Val Val Leu Val

260 265 270

Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr His Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr

275 280 285

Leu Lys Pro Gly Thr Arg Leu Ile Ser Val Thr Cys Asp Pro Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Pro Met Gly Asp Ala Ile Val Ala Asp Ile Gly Ala

305 310 315 320

Met Ala Ser Ala Leu Ala Asn Leu Val Glu Glu Ser Ser Arg Gln Leu

325 330 335

Pro Thr Ala Ala Pro Glu Pro Ala Lys Val Asp Gln Asp Ala Gly Arg

340 345 350

Leu His Pro Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Asp Met Ala Pro Glu

355 360 365

Asn Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Ser Thr Ser Thr Thr Ala Gln Met Trp

370 375 380

Gln Arg Leu Asn Met Arg Asn Pro Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ala Ala

385 390 395 400

Gly Gly Leu Gly Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ile Gly Val Gln Leu Ala

405 410 415

Glu Pro Glu Arg Gln Val Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ala Asn

420 425 430

Tyr Ser Ile Ser Ala Leu Trp Thr Ala Ala Gln Tyr Asn Ile Pro Thr

435 440 445

Ile Phe Val Ile Met Asn Asn Gly Thr Tyr Gly Ala Leu Arg Trp Phe

450 455 460

Ala Gly Val Leu Glu Ala Glu Asn Val Pro Gly Leu Asp Val Pro Gly

465 470 475 480

Ile Asp Phe Arg Ala Leu Ala Lys Gly Tyr Gly Val Gln Ala Leu Lys

485 490 495

Ala Asp Asn Leu Glu Gln Leu Lys Gly Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ser

500 505 510

Ala Lys Gly Pro Val Leu Ile Glu Val Ser Thr Val Ser Pro Val Lys

515 520 525

<210> 2

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60

ttcggtaacc cgggttctaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120

tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180

tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240

gctctgtcta acgcttggaa ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300

cgtgctatga tcggtgttga agctctgctg accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360

ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420

cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480

gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540

tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600

tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660

gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720

ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780

tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840

caccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900

gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960

atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020

ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080

accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140

gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200

ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260

caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320

gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtgct 1380

ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440

atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500

gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560

gtttctaccg tttctccggt taaa1584

<210> 3

<211> 825

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Ala Pro

1 5 1015

Val Ser Glu Glu Ala Ile Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Ala Ala

202530

Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met

354045

Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His

505560

Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg

65707580

Leu Ile Ala Asp His Gln Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly

859095

His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ala Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr

100 105 110

Thr Glu Tyr Phe Pro Asn Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys

115 120 125

Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Tyr Ala

130 135 140

Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala

145 150 155 160

Leu Ser His Ala Tyr Gly Ala Val Met Asn Asn Pro Ser Leu Phe Val

165 170 175

Pro Ala Ile Val Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr

180 185 190

Gly Trp Gln Ser Asn Lys Leu Ile Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val

195 200 205

Leu Pro Ile Leu His Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ile

210 215 220

Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met

225 230 235 240

Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asn Glu Asp His

245 250 255

Leu Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Phe Glu Thr Val Phe Asp

260 265 270

Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Ala Ala Gln Thr Asp Asp Met Thr Arg

275 280 285

Pro Phe Tyr Pro Met Ile Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys

290 295 300

Pro Lys Phe Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His

305 310 315 320

Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val

325 330 335

Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu

340 345 350

Asn Gly Ala Val Lys Pro Glu Val Thr Ala Phe Met Pro Thr Gly Glu

355 360 365

Leu Arg Ile Gly Glu Asn Pro Asn Ala Asn Gly Gly Arg Ile Arg Glu

370 375 380

Glu Leu Lys Leu Pro Lys Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Ala

385 390 395 400

Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gln Leu Glu Ala Thr Arg Arg Leu Gly

405 410 415

Val Tyr Thr Arg Asp Ile Ile Lys Asn Asn Pro Asp Ser Phe Arg Ile

420 425 430

Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gln Ala Ala Tyr Asp

435 440 445

Val Thr Asn Lys Gln Trp Asp Ala Gly Tyr Leu Ser Ala Gln Val Asp

450 455 460

Glu His Met Ala Val Thr Gly Gln Val Thr Glu Gln Leu Ser Glu His

465 470 475 480

Gln Met Glu Gly Phe Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly

485 490 495

Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser Met Leu

500 505 510

Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile Pro Trp

515 520 525

Arg Lys Pro Ile Ser Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp

530 535 540

Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe Asn Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr

565 570 575

Phe Pro Val Asp Ser Asn Met Leu Leu Ala Val Ala Glu Lys Cys Tyr

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala

595 600 605

Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Lys Gly

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Ala Ala Glu Trp Lys Trp Ala Ser Asn Val Lys Ser Asn Asp Glu Ala

625 630 635 640

Gln Ile Val Leu Ala Ala Thr Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met

645 650 655

Ala Ala Ala Asp Lys Leu Asp Ala Met Gly Ile Lys Phe Lys Val Val

660 665 670

Asn Val Val Asp Leu Val Lys Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asn Glu

675 680 685

Ala Leu Ser Asp Glu Glu Phe Ala Glu Leu Phe Thr Glu Asp Lys Pro

690 695 700

Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala Arg Asp Val Arg Gly Leu Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu

725 730 735

Gln Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Asn Ile

740 745 750

Asp Arg Tyr Glu Leu Gln Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp

755 760 765

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asn Glu Leu Glu Ala Phe Arg Gln Glu Ala

770 775 780

Phe Gln Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp

785 790 795 800

Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asn Lys Gln Gly Ala Ile Ser Ala

805 810 815

Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu

820 825

<210> 4

<211> 2477

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atgacctctc cggttatcgg taccccgtgg aaaaaactga acgcgccggt ttctgaagaa 60

gcgatcgaag gtgttgacaa atactggcgt gcggcgaact acctgtctat cggtcagatc 120

tacctgcgtt ctaacccgct gatgaaagaa ccgttcaccc gtgaagacgt taaacaccgt 180

ctggttggtc actggggtac caccccgggt ctgaacttcc tgatcggtca catcaaccgt 240

ctgatcgcgg accaccagca gaacaccgtt atcatcatgg gtccgggtca cggtggtccg 300

gcgggtaccg cgcagtctta cctggacggt acctacaccg aatacttccc gaacatcacc 360

aaagacgaag cgggtctgca gaaattcttc cgtcagttct cttacccggg tggtatcccg 420

tctcactacg cgccggaaac cccgggttct atccacgaag gtggtgaact gggttacgcg 480

ctgtctcacg cgtacggtgc ggttatgaac aacccgtctc tgttcgttcc ggcgatcgtt 540

ggtgacggtg aagcggaaac cggtccgctg gcgaccggtt ggcagtctaa caaactgatc 600

aacccgcgta ccgacggtat cgttctgccg atcctgcacc tgaacggtta caaaatcgcg 660

aacccgacca tcctgtctcg tatctctgac gaagaactgc acgagttctt ccacggtatg 720

ggttacgaac cgtacgagtt cgttgcgggt ttcgacaacg aagaccacct gtctatccac 780

cgtcgtttcg cggaactgtt cgaaaccgtt ttcgacgaaa tctgcgacat caaagcggcg 840

gcgcagaccg acgacatgac ccgtccgttc tacccgatga tcatcttccg taccccgaaa 900

ggttggacct gcccgaaatt catcgacggt aaaaaaaccg aaggttcttg gcgttctcac 960

caggttccgc tggcgtctgc gcgtgacacc gaagcgcact tcgaagttct gaaaaactgg 1020

ctggaatctt acaaaccgga agaactgttc gacgaaaacg gtgcggttaa accggaagtt 1080

accgcgttca tgccgaccgg tgaactgcgt atcggtgaaa acccgaacgc gaacggtggt 1140

cgtatccgtg aagaactgaa actgccgaaa ctggaagact acgaagttaa agaagttgcg 1200

gaatacggtc acggttgggg tcagctggaa gcgacccgtc gtctgggtgt ttacacccgt 1260

gacatcatca aaaacaaccc ggactctttc cgtatcttcg gtccggacga aaccgcgtct 1320

aaccgtctgc aggcggcgta cgacgttacc aacaaacagt gggacgcggg ttacctgtct 1380

gcgcaggttg acgaacacat ggcggttacc ggtcaggtta ccgaacagct gtctgaacac 1440

cagatggaag gtttcctgga aggttacctg ctgaccggtc gtcacggtat ctggtcttct 1500

tacgaatctt tcgttcacgt tatcgactct atgctgaacc agcacgcgaa atggctggaa 1560

gcgaccgttc gtgaaatccc gtggcgtaaa ccgat

催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。