布雷菲德菌素A硒酯衍生物及其制备与应用

IPC分类号 : C07D313/00,A61P39/06,A61P35/00

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CN201510589902.8

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专利摘要

本发明公开了一种布雷菲德菌素A硒酯衍生物及其制备与应用，本发明所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物具有抗氧化活性和抗肿瘤活性，其中布雷菲德菌素A硒酯类衍生物(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)或(Ⅰ-5)有好的抗氧化效果，能够清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O2-)；式(Ⅰ-5)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物对人肺癌细胞A549有很好的抑制活性，远高于BFA本身的抑制活性；所得的结果显示出BFA衍生物在药物开发体系中具有广阔的应用前景，为合成和筛选BFA衍生药物提供了新的更广阔的思路，以期为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。

权利要求

1.一种式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物，

式(Ⅰ)中R₁为H或 R₁、R₂中R₃同时为苯环、苄基或2-甲基-6-乙基苯基。

2.如权利要求1所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物，其特征在于所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为下列之一：

3.如权利要求2所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物，其特征在于所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)或(Ⅰ-5)所示化合物。

4.一种权利要求1所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物的制备方法，其特征在于所述方法为：以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A和式(Ⅲ)所示芳香族异硒氰酸酯为原料，以四氢呋喃为溶剂，以氢化钠为催化剂，通氮气，于冰浴条件下反应，反应结束后，反应液后处理制得式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物；

式(Ⅲ)中R₃为苯环、苄基或2-甲基-6-乙基苯基。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与式(Ⅲ)所示芳香族异硒氰酸酯投料物质的量之比为1：1；所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与氢化钠投料物质的量之比为1：2；所述四氢呋喃体积用量以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A物质的量计为30ml/mmol。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述反应液后处理方法为：反应结束后，反应混合物加水淬灭，并加入二氯甲烷进行萃取，有机层先水洗，后用饱和NaCl水溶液洗涤，有机相收集后用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产品，经薄层层析分离，得到式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物。

7.一种权利要求1所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物在制备抗氧化药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)或(Ⅰ-5)所示化合物。

9.一种权利要求1所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物在制备抗肿瘤活性药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为式(Ⅰ-5)所示化合物。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及布雷菲德菌素A硒酯类衍生化合物及其制备与生物应用。

(二)背景技术

布雷菲德菌素A((+)-BrefeldinA，简称BFA)，是一种新型的抗生素，由一种大环内酯类真菌产生的次级代谢产物，也可称之为斜卧菌素或壳二孢素，具有多种生物学活性，包括抗真菌、抗病毒、抗线虫、抗有丝分裂，并且发现它对多种癌细胞具有高活性抑制作用，另外还可以分子工具的作用应用于哺乳动物信号传导途径的研究中。但是，因为布雷菲德菌素A存在水溶性差，半衰期短，靶向性低和生物利用度低等问题，使得它在诸多方面的应用受到限制，因此对BFA进行结构修饰来克服其本身存在的不良因素，使它能够尽快应用于临床研究已经成为新的科学研究热点。

硒是人体必需的微量元素，具有不可替代的作用。有机硒在人体内的存在形式为硒蛋氨酸，依循蛋氨酸代谢途径代谢，合成蛋白质，因此在组织内储存、吸收较容易；人体吸收后可迅速利用，能够有效改善人体内血硒状况。硒能直接作用于病毒，抑制病毒在体内的复制，并能参与细胞的修复，预防多种病毒和疾病(如乙肝、心炎等)。当硒缺乏的时候，会使得人体免疫能力下降，威胁人类健康和生命，其实人类的四十多种疾病都与人体硒含量过低相关，如癌症、心血管病、肝病、白内障、胰脏疾病、糖尿病、生殖系统疾病等。研究表明，有机硒具有很好的生物活性，将生物活性硒运用于对BFA的结构修饰，会对BFA的药代动力学性质有所改善，可能会大大提高抗肿瘤活性，成为新的具有潜在药用价值的BFA衍生药物。

本发明正是通过对BFA的4-OH，7-OH的化学修饰，得到BFA硒酯类衍生物，检测了其抗氧化活性，以及检测其对人肺癌细胞系(A549)、中国仓鼠肺细胞(CHL)的抑制能力，研究BFA硒酯类衍生物的抗肿瘤活性和构效关系，为抗肿瘤新药筛选提供了研究基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种布雷菲德菌素A硒酯类衍生物及其制备方法，以及该类衍生物在制备抗氧化和抗肿瘤活性药物中的应用，该类衍生物合成工艺简单，有较好的抗氧化活性和抗肿瘤活性，具有好的研究价值。

本发明采用的技术方案是：

本发明所述布雷菲德菌素A(BFA)结构式为(Ⅱ)所示：

式(Ⅱ)中：3-，11-碳碳双键，4-OH，7-OH以及15-CH₃均为BFA本身可修饰基团，用以合成不同的BFA衍生物，以改变其性质。本发明优选的修饰基团为4-OH，7-OH，修饰所用化合物包括不同的芳香族异硒氰酸酯，以合成硒酯类化合物。

本发明提供一种式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物，

式(Ⅰ)中R₁为H或 R₂为 R₁、R₂中R₃同时为苯环、苄基或2-甲基-6-乙基苯基。

进一步，优选本发明所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为下列之一：

本发明所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物最优选为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)或(Ⅰ-5)所示化合物。

本发明还提供一种所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物的制备方法，所述方法为：以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A(BFA)和式(Ⅲ)所示芳香族异硒氰酸酯为原料，以四氢呋喃(THF)为溶剂，以氢化钠为催化剂，通氮气，于冰浴条件下反应，反应结束后，反应液后处理制得式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物；

式(Ⅲ)中R₃为苯环、苄基或2-甲基-6-乙基苯基。

进一步，所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与式(Ⅲ)所示芳香族异硒氰酸酯投料物质的量之比为1：1；所述式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A与氢化钠投料物质的量之比为1：2；所述四氢呋喃体积用量以式(Ⅱ)所示布雷菲德菌素A物质的量计为30ml/mmol。

进一步，本发明所述反应液后处理方法为：反应结束后，反应混合物加水淬灭，并加入二氯甲烷进行萃取，有机层先水洗，后用饱和NaCl水溶液洗涤，有机相收集后用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产品，经薄层层析分离，收集Rf＝0.5～0.7的组分，得到式(Ⅰ)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物。

本发明还提供一种所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物在制备抗肿瘤活性药物中的应用，具体优选所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为式(Ⅰ-5)所示化合物，优选中国仓鼠肺细胞CHL和人肺癌细胞A549。

本发明提供一种所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物在制备抗氧化药物中的应用，具体优选所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物为式(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)或(Ⅰ-5)所示化合物，所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物能够清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O₂^-)。

本发明所述制备BFA硒酯类衍生物的反应式为：

式(Ⅲ)中R₃为苯环、苄基以及2-甲基-6-乙基苯基。

式(Ⅰ)中R₁为H或 R₂为 R₁、R₂中R₃同时为苯环、苄基或2-甲基-6-乙基苯基。

本发明所述布雷菲德菌素A硒酯类衍生物的制备方法中，首先称取纯度为60％的氢化钠溶于无水的THF中，然后依次加入苯基异硒氰酸酯(Ⅲ-1)和BFA(Ⅱ)，在氮气气氛下，冰浴反应4～5h，反应过程用TLC追踪检测(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)，直至(Ⅲ-1)反应完全。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明通过芳香族异硒氰酸酯与布雷菲德菌素A发生亲电加成反应，制备了新的布雷菲德菌素A硒酯类衍生物；(2)本发明提供了一种新的布雷菲德菌素A硒酯类衍生物，研究它们的构效关系，从而有新的研究方向和新的药物开发思路；(3)该类BFA衍生物具有抗氧化活性和抗肿瘤活性，其中布雷菲德菌素A硒酯类衍生物(Ⅰ-1)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)或(Ⅰ-5)有好的抗氧化效果，能够清除DPPH、ABTS和超氧自由基(O₂^-)。式(Ⅰ-5)所示布雷菲德菌素A硒酯类衍生物对人肺癌细胞A549有很好的抑制活性，远高于BFA本身的抑制活性；(4)通过本发明的研究，衍生位点的选择对BFA相关活性有至关重要的影响，布雷菲德菌素A硒酯类衍生物(Ⅰ-4)比(Ⅰ-3)的抗肿瘤活性弱，说明4-OH比7-OH位点对抗肿瘤活性的影响更大。因此，所得的结果显示出BFA衍生物在药物开发体系中具有广阔的应用前景，为合成和筛选BFA衍生药物提供了新的更广阔的思路，以期为相关疾病的治疗提供了更加有效的途径。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：7-苯基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-1)和4’7-苯基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-2)的制备

反应式如下：

称取纯度为60％的氢化钠(2eq，1mmol，44mg)溶于无水的THF(15mL)，依次加入苯基异硒氰酸酯(Ⅲ-1)(1eq，0.5mmol，91mg)和BFA(Ⅱ)(1eq，0.5mmol，140mg)，在氮气气氛下，冰浴反应4～5h，反应过程用TLC追踪检测(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)，直至(Ⅲ-1)反应完全。反应混合物加10ml水淬灭，加入2×20ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×20ml后，饱和NaCl水溶液洗涤2×20ml，收集有机相用无水Mg₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产品，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2为展开剂，v/v)，收集R_f＝0.5的组分得到7-苯基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-1)，收集R_f＝0.7的组分得到4’7-苯基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-2)。

7-苯基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-1)(产率50％)：MS(ESI)m/z464(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.56–7.33(m,4H),7.25(dd,J＝21.2,6.0Hz,1H),5.51(d,J＝53.4Hz,1H),5.07(dd,J＝15.4,8.4Hz,1H),4.86–4.59(m,1H),4.36(s,1H),2.72–2.45(m,2H),2.42–2.16(m,1H),2.03(s,1H),1.94–1.59(m,4H),1.47(dd,J＝29.1,12.4Hz,2H),1.37–1.02(m,6H),0.87(d,J＝9.3Hz,2H)；¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ188.99,168.73,136.79,134.99,131.62,129.81,129.42,129.24,127.28,121.69,77.35,77.09,76.84,72.016,71.583,65.28,49.93,43.92,41.18,39.00,33.36,30.89,20.66；

IRν_max(cm^-1):3370.36,2932.33,1700.361639.52,1496.57,1455.60,1297.18,1209.30,1168.61，1089.67，972.50,697.72,573.33。

4’7-二苯基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-2)(产率30％)：MS(ESI)m/z647(M+H)⁺；IRν_max(cm^-1):2978.39,2351.71,1708.30,1631.36,1594.24,1447.98，1401.77,1362.14，1335.62,1312.58,1230.49,1114.15,1011.41，908.78，695.01，571.62。

实施例2：7-苄基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-3)和4’7-苄基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-4)的制备

反应式如下：

称取纯度为60％的氢化钠(2eq，1mmol，44mg)溶于无水的THF(15mL)，依次加入苄基异硒氰酸酯(Ⅲ-2)(1eq，0.5mmol，98mg)、BFA(Ⅱ)(1eq，0.5mmol，140mg)，在氮气气氛下，冰浴反应3～4h，反应过程用TLC追踪检测(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)，直至(Ⅲ-1)反应完全。反应混合物加10ml水淬灭，加入2×20ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×20ml后，饱和NaCl水溶液洗涤2×20ml，收集有机相用无水Mg₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产品，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2为展开剂，v/v)，收集Rf＝0.5的组分得到7-苄基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-3)，收集R_f＝0.7的组分得到4’7-苄基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-4)。

7-苄基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-3)(产率60％)：MS(ESI)m/z478(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.31(d,J＝41.1Hz,5H),5.50(d,J＝14.9Hz,1H),5.39(d,J＝10.3Hz,1H),5.18–4.99(m,2H),4.54(d,J＝4.7Hz,1H),4.44–4.26(m,2H),3.79(d,J＝11.4Hz,1H),2.75(d,J＝13.0Hz,1H),2.45–2.35(m,1H),2.29(dd,J＝22.3,12.8Hz,2H),1.67(d,J＝18.1Hz,5H),1.62–1.42(m,3H),1.40–1.23(m,3H),1.16(d,J＝6.6Hz,3H)。

IRν_max(cm^-1):3423.43,2977.73,2922.45,1710.71,1499.90,1453.62,1389.11,1340.32,1313.00,1267.21,1171.20,1109.10，1072.52,973.89,839.8。

4’7-二苄基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-4)(产率40％)：MS(ESI)m/z675(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.38(s,1H),7.32(t,J＝21.2Hz,8H),7.16(d,J＝7.1Hz,1H),5.75(d,J＝42.1Hz,1H),5.56–5.45(m,1H),4.78(d,J＝5.2Hz,1H),4.51(d,J＝4.6Hz,1H),4.35(dd,J＝27.6,16.6Hz,2H),4.10(d,J＝7.1Hz,1H),3.81–3.66(m,1H),2.74(d,J＝13.0Hz,1H),2.45(d,J＝7.1Hz,1H),2.29(d,J＝13.2Hz,1H),2.02(s,1H),1.62(s,2H),1.58(s,2H),1.51–1.43(m,2H),1.37(s,1H),1.24(s,4H),1.20–1.13(m,4H),1.04(d,J＝11.4Hz,1H)。IRν_max(cm^-1):3029.14，2926.61,2855.53,1719.95,1520.74,1485.42,1341.54,1243.34,1167.77，1092.55,947.24,909.93,798.85，699.71。

实施例3：7-2-甲基-6-乙基苯基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-5)和4’7-2-甲基-6-乙基苯基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-6)的制备

反应式如下：

称取纯度为60％的氢化钠(2eq，1mmol，44mg)溶于无水的THF(15mL)，依次加入苄基异硒氰酸酯(Ⅲ-3)(1eq，0.5mmol，112mg)、BFA(Ⅱ)(1eq，0.5mmol，140mg)，在氮气气氛下，冰浴反应3～4h，反应过程用TLC追踪检测(乙酸乙酯：石油醚＝1：2，v/v)，直至(Ⅲ-1)反应完全。反应混合物加10ml水淬灭，加入2×20ml二氯甲烷进行萃取，有机层水洗2×20ml，饱和NaCl水溶液洗涤2×20ml，收集有机相用无水Mg₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产品，经薄层层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1：2为展开剂，v/v)，收集Rf＝0.5的组分得到7-2-甲基-6-乙基苯基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-5)，收集Rf＝0.7的组分得到4‘7-2-甲基-6-乙基苯基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-6)。

7-2-甲基-6-乙基苯基布雷菲德菌素A单硒酯(Ⅰ-5)(产率60％)：MS(ESI)m/z506(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.33(td,J＝7.6,3.0Hz,1H),7.23(t,J＝8.9Hz,1H),7.17(d,J＝7.3Hz,1H),5.45(ddd,J＝15.1,9.7,5.3Hz,1H),5.30(dd,J＝15.4,8.7Hz,1H),5.15–5.02(m,1H),4.73(dd,J＝6.6,2.7Hz,1H),4.49(d,J＝4.0Hz,1H),4.28(ddd,J＝19.3,11.1,5.8Hz,1H),2.60–2.48(m,4H),2.31(t,J＝10.3Hz,5H),2.11–1.94(m,2H),1.81(dd,J＝16.1,8.1Hz,2H),1.73–1.65(m,3H),1.61–1.38(m,3H),1.33(t,J＝7.5Hz,3H),1.21–1.16(m,3H)；¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ168.60,142.50,140.90,135.78,135.70,134.97,132.82,130.63,130.53,129.57,127.21,77.03,72.50,71.49,64.87,44.03,41.38,38.61,38.44,33.82,33.59,24.18,23.81,20.47,17.22,14.44。

IRν_max(cm^-1):3850.15,3730.10，2973.67,2929.67,2855.26，2081.30,1972.27,1721.45,1632.50,1453.17，1360.42,1232.54，1208.27,1179.93,1090.70,977.43,914.10,844.18，696.91。

4’7-2-甲基-6-乙基苯基布雷菲德菌素A双硒酯(Ⅰ-6)(产率40％)：MS(ESI)m/z731(M+H)⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.31(s,1H),7.26–6.94(m,5H),5.52(s,1H),5.25(s,1H),5.07(s,1H),4.69(s,1H),4.24(d,J＝87.7Hz,1H),2.31–2.20(m,4H),2.04(s,1H),1.59(s,9H),1.27(dd,J＝37.2,15.5Hz,18H),0.87(s,3H)。

实施例4各样品抗氧化活性的测定

(1)样品配制

分别称量样品BFA、Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-4、VE(维生素E)各3mg，分别溶于无水甲醇中，配制样品浓度为300μg/mL。分别进行清除DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力的测定、总还原力能力的测定、超氧自由基(O₂^-)清除率的测定以及清除ABTS自由基能力的测定。每个实验组都进行三组平行实验，取平均值。

(2)清除DPPH自由基能力的测定

测定过程中分为实验组、对照组、空白调零组。取1mmol/L的DPPH甲醇溶液200μL加入试管中，再加入800μL的无水甲醇进行稀释，配制0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液。实验组(OD值记为A_i)每试管加入2mL样品液与2mL、0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液；对照组(OD值记为A_j)每试管加入2mL样品液与2mL无水甲醇；空白调零组(OD值记为A₀)每试管加入2mL、0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液与2mL无水甲醇。25℃下避光反应60min，测定样品在紫外波长为517nm时的吸光度。

样品对DPPH自由基清除能力的计算公式为：

R％＝[1-((A_i-A_j)/A₀)]×100％

(3)总还原力能力的测定

测定过程仅需实验组即可。每试管中，2mL的样品液与2mL的0.2mol/L的pH＝6.6的PBS缓冲液以及2mL的质量浓度1％的铁氰化钾缓冲液混匀后，在50℃水浴中反应30min，再分别加入2mL的质量浓度为10％的TCA水溶液，3000rpm离心10min。取上清液2mL与2mL的无水甲醇以及0.4mL质量浓度0.1％的FeCl₃水溶液混匀。避光反应10min，测定样品在紫外波长为700nm时的吸光度。OD₇₀₀值越大，说明其还原力即抗氧化能力越强。

(4)超氧自由基(O₂^-)清除率的测定

测定过程中分为实验组、对照组、空白调零组。取0.2mol/L的PBS缓冲液(用NaOH(1M)调pH到8.0)1mL，加入99mL的无水甲醇，定容稀释为2mmol/L，pH＝8.35，再取此缓冲液4.5mL加入每试管，在25℃即室温下预热20min。实验组(OD值记为A_x)每试管加入0.1mL样品液与0.4mL的25mmol/L邻苯三酚水溶液混匀；对照组(OD值记为A_i)每试管加入0.1mL样品液与0.4mL的无水甲醇混匀；空白调零组(OD值记为A₀)每试管加入0.1mL无水甲醇与0.4mL的25mmol/L邻苯三酚水溶液混匀；25℃下反应5min，每试管滴一滴浓盐酸(物质浓度：12mol/L)以终止反应。测定样品在紫外波长为325nm时的吸光度。

超氧自由基(O₂^-)清除率的计算公式为：

R％＝[(A₀-(A_x-A_i))/A₀]×100％

(5)清除ABTS自由基能力的测定

测定过程中分为实验组、对照组。5mLABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)试剂与过硫酸钾88μL避光反应12-16h后，使用PBS缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)将反应液稀释至其在紫外波长为734nm时的吸光度为0.70±0.02，获得ABTS自由基储备液，备用。实验组(OD值记为A_x)每试管加入1mL样品溶液和3mLABTS自由基储备液；对照组(OD值记为A₀)每试管加入1mL无水甲醇和3mLABTS自由基储备液。25℃下避光反应5min，测定样品在紫外波长为734nm时的吸光度。

样品对ABTS自由基清除能力的计算公式为：

R％＝[(A₀-A_x)/A₀]×100％

各实验结果见表1和表2。

表1各样品清除DPPH自由基能力测定与总还原力测定

注：1)*表示样品对DPPH自由基清除能力过小，无法计算；

2)清除DPPH自由基能力测定实验中A₀值为0.303。

表2各样品清除超氧自由基(O₂^-)能力测定与ABTS自由基能力测定

注：清除超氧自由基(O₂^-)能力测定实验中A₀值为0.344。

从表1可以看出，化合物Ⅰ-3、Ⅰ-4对DPPH自由基具有较好的清除能力，其中化合物Ⅰ-3的清除能力较强，且高于VE清除能力；化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5的总还原力与VE相差不大，且与BFA本身相比有一定的提高。

从表2可以看出，化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-4对清除超氧自由基(O₂^-)能力较强，Ⅰ-3、Ⅰ-5的清除能力高于VE，与BFA本身相比仍有所下降，但影响不大。化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-4的清除ABTS自由基能力总体能力强，其中Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-4的清除能力较强，与BFA本身的清除能力相比有一定范围内的提高，远高于VE的清除能力。

实施例5各样品对细胞生长抑制能力的测定

(1)人肺癌(A549)细胞培养

培养条件：RPMI1640培养液+10％/牛血清，37℃，5％CO₂培养箱。

冻存条件：RPMI1640培养液+10％/胎牛血清+10％DMSO。

传代方法：细胞在培养瓶中生长到80-90％并仍为单层时进行传代。弃去旧液，向培养瓶中加入2mLPBS缓冲液(pH值为7.2±0.1)，清洗一下，弃掉，重复两次。加入消化液(0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA)1mL消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成3-5个抱团细胞后加入2mL(RPMI1640培养液+10％/牛血清)培养液终止消化，吹打细胞至显微镜下呈单细胞状态，细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，RPMI1640培养液重悬细胞重复两次。培养液重悬细胞混匀后分装到T25培养瓶中，补加培养液至4-5mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)中国仓鼠肺细胞(CHL)培养

培养条件：RPMI1640培养液+10％/牛血清，37℃，5％CO₂培养箱。

冻存条件：RPMI1640培养液+10％/胎牛血清+10％DMSO。

(3)抗肿瘤活性实验(MTT法)

A549细胞贴壁至T25瓶约90％时，经消化制成细胞悬浮液，均匀铺于96孔板，浓度为1.6-2×10⁴个/孔。实验设6个浓度梯度加药组，1个对照组，1个调零组，每组3个平行，对照组以助溶剂代替药物，调零组加同体积培养基，96孔板边缘加PBS缓冲液。细胞于37℃，5％CO₂培养箱培养24h，至细胞贴壁分裂生长至占瓶壁70-80％后，加药组分别加入终浓度为2.5μM，1.875μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.15625μM的药品溶液200μL(所述药品溶液是将实施例Ⅰ-4制备的化合物分别含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液配制而成)，对照组加入含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液200μL，调零组则加入RPMI1640培养液200μL，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h。加药组，对照组和调零组分别加入20μLMTT(5mg/mL，PBS现配过膜使用)作用4h，小心吸出培养液，再分别加200μLDMSO，平板振荡器摇匀10min左右至沉淀充分溶解；使用酶标仪于570nm处测量吸光度，计算各自的抑制率，利用SPSS20.0软件计算IC50值。

(4)抗肿瘤活性对照实验(MTT法)

CHL细胞贴壁至T25瓶约90％时，经消化制成细胞悬浮液，均匀铺于96孔板，浓度为1.6-2×10⁴个/孔。实验设6个浓度梯度加药组，1个对照组，1个调零组，每组3个平行，对照组以助溶剂代替药物，调零组加同体积培养基，96孔板边缘加PBS缓冲液。细胞于37℃，5％CO₂培养箱培养24h，至细胞贴壁分裂生长至占瓶壁70-80％后，加药组分别加入终浓度为2.5μM，1.875μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.15625μM的药物溶液200μL(所述药物溶液是将实施例1-4制备的化合物分别用含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液配制而成)，对照组加入含体积浓度8％助溶剂DMSO的RPMI1640培养液200μL，调零组则加入RPMI1640培养液200μL。于37℃、5％CO₂培养箱培养24h。加药组，对照组和调零组分别加入20μLMTT(5mg/mL，PBS现配过膜使用)作用4h，小心吸出培养液，然后再分别加200μLDMSO，平板振荡器摇匀10min左右至沉淀充分溶解；使用酶标仪于570nm处测量吸光度，计算各自的抑制率，利用SPSS20.0软件计算IC50值。

样品实验结果见表3.

表3BFA硒酯类衍生化合物的对A549和CHL细胞抑制活性

注：1)、*表示没有抑制活性或者抑制活性远远大于500μM。

2)、SI＝IC50(A549)/IC50(CHL)，SI越小，药物对肿瘤细胞的选择性越高。

如表3所示，BFA硒酯类衍生物对A549细胞表现出抗肿瘤活性，其中单酯化合物Ⅰ-5活性最好，相比于BFA本身活性大幅度提高；单酯化合物Ⅰ-1、Ⅰ-3活性较好，相比于BFA本身活性有所降低；双酯化合物Ⅰ-4的活性比BFA本身活性下降了13倍左右，但BFA硒酯衍生物对A549细胞的抑制性远远大于CHL细胞抑制性，这种选择性对比与BFA本身都有一定的提高。

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