取代嘌呤类衍生物及其制备方法与应用

IPC分类号 : C07D473/00,A61K31/52,A61P31/20

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CN201610486112.1

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专利摘要

本发明公开了一种具有通式Ⅰ所示结构的取代嘌呤类衍生物及其制备方法和应用。本发明还包括取代嘌呤类衍生物的N‑氧化物、立体异构体形式、立体异构体混合物或药学上可接受的盐。本发明还包括取代嘌呤类衍生物的制备方法以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备抗乙型肝炎药物中的应用。

权利要求

1.具有如下通式Ⅰ所示结构的取代嘌呤类衍生物，以及其N-氧化物、立体异构体形式、立体异构体混合物或药学上可接受的盐：

其中，

R为氨基、氯原子、氟原子、溴原子、碘原子、羟基、甲基或乙基；

R₁为苄基、取代苄基、各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环、各种取代的六元并五元杂环、各种取代的六元并六元杂环、各种取代的五元并五元杂环、各种取代的苯并五元杂环或各种取代的苯并六元杂环；

Linker为0-3个碳原子的烷烃链或含杂原子的烷烃链；

R₂为各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环、各种取代的六元并五元杂环、各种取代的六元并六元杂环、各种取代的五元并五元杂环、各种取代的苯并五元杂环或各种取代的苯并六元杂环。

2.如权利要求1所述的取代嘌呤类衍生物，其特征在于，所述通式Ⅰ中，

R为氯原子；

R₁为甲基、乙基、苄基或对甲基苄基；

Linker为长度是0个原子的烷烃链、1个碳原子和1个硫原子的烷烃链或2个碳原子和1个硫原子的烷烃链；

R₂为N-甲基吡咯甲醛、吲哚甲醛、5-溴吲哚甲醛、N-溴甲基邻苯二甲酰亚胺或N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺。

3.如权利要求1或2所述的取代嘌呤类衍生物，其特征在于，为如下化合物之一：

4.如权利要求1所述的取代嘌呤类衍生物的制备方法，其特征在于，由起始原料2,4-二氯-5-硝基嘧啶经低温下选择性亲核取代，得中间体LN-1，中间体LN-1的硝基经氯化亚锡还原得到关键中间体LN-2；中间体LN-2中的氨基与带醛基的芳杂环生成席夫碱，再在无水三氯化铁催化下环合得到部分终产物LN-0系列；中间体LN-2与硫羰基二咪唑反应生成中间体LN-3，再经亲核取代得到终产物LN-S系列，然后由间氯过氧苯甲酸氧化得到亚砜产物；

合成路线如下：

试剂及条件:(i)甲胺水溶液、或乙胺水溶液、或苄胺、或对甲基苄胺，二氯甲烷，二异丙基乙胺，-78℃；(ii)氯化亚锡，无水乙醇，回流；(iii)醛基取代的含氮芳杂环，冰醋酸，无水甲醇，无水三氯化铁，室温；(iv)硫羰基二咪唑，四氢呋喃，回流；(v)碳酸钾或碳酸氢钠，室温；(iv)间氯过氧苯甲酸，二氯甲烷，室温；

其中，其中，R₁、R₂的定义同上通式Ⅰ所述。

5.如权利要求4所述的取代嘌呤类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)称取2.0g 2,4-二氯-5-硝基嘧啶于100mL茄形烧瓶中，加入20mL二氯甲烷室温搅拌溶解，放入低温反应仪中，降温至-30℃时，加入3.07mL二异丙基乙胺，至-78℃时，缓慢滴加用5mL二氯甲烷稀释的0.885g 40％甲胺水溶液，滴毕，继续搅拌4h，TLC监测，反应完毕，停止反应，恢复至室温，水洗三次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干拌样，硅胶柱层析分离纯化，流动相选择石油醚：乙酸乙酯，体积比8：1，得到中间体LNa-1；

(2)称取1.4g中间体LNa-1于250mL烧瓶中，100mL乙醇溶解，搅拌下分批加入6.17g氯化亚锡，加毕，在氮气保护下，升温至80℃回流反应9h，TLC监测，反应完毕，停止反应，待反应液恢复至室温，测反应液pH为3，冰水浴下，用1M氢氧化钠溶液缓慢调pH至8，用硅藻土抽滤，将滤液中大部分乙醇蒸出，再加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液蒸干拌样，硅胶柱层析分离纯化，流动相选择石油醚：乙酸乙酯，体积比1：1至1：2，得中间体LNa-2；

(3)称取0.3g中间体LNa-2于50mL茄形烧瓶中，15mL无水甲醇溶解，搅拌下分别加入0.2684g N-甲基-2-吡咯甲醛，0.1mL醋酸，室温搅拌6h，TLC监测，反应完毕，减压蒸出溶剂甲醇和醋酸，再加入15mL无水乙醇溶解，搅拌下加入6.2g 5％FeCl₃-SiO₂，升温至80℃回流1.5h，停止反应，冷却至室温，过滤出不溶物，将滤液中的乙醇蒸出，加入乙酸乙酯复溶，水洗三次，饱和食盐水洗一次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干拌样，硅胶柱层析分离纯化，流动相选择石油醚：乙酸乙酯，体积比10：1至8：1，即可分离出产物LN-0-1；

称取0.2g中间体LNa-2于50mL茄形烧瓶中，15mL无水甲醇溶解，搅拌下分别加入0.2197g吲哚醛，0.1mL醋酸，室温搅拌12h，TLC监测，反应完毕，减压蒸出溶剂甲醇和醋酸，再加入15mL无水乙醇或二甲基甲酰胺溶解，搅拌下加入溶剂稀释的0.2045g FeCl₃溶液，升温至80℃回流10h，停止反应，冷却至室温，直接过滤出不溶物，滤饼用水洗，石油醚洗，真空干燥箱干燥，即可得到产物LN-0-4；

(4)称取0.3g中间体LNa-2于50mL烧瓶中，15mL重蒸四氢呋喃溶解，搅拌下加入0.5057g硫羰基二咪唑，加入0.2871g三乙胺，升温至70℃回流反应12h，TLC监测，反应完毕，停止反应，待反应恢复至室温，蒸出四氢呋喃，再加入乙酸乙酯复溶，冰水浴下，用2M氢氧化钠溶液洗有机相三次，水相合并，冰水浴缓慢搅拌下，滴加稀盐酸，析出固体，过滤，滤饼用水洗后干燥即得中间体LNa-3；

(5)称取0.1g中间体LNa-3于50mL茄形烧瓶中，加入10mL二甲基甲酰胺，室温搅拌溶解，先加入0.103g碳酸钾，室温搅拌0.5h后，加入0.139g原料N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺，升温至40℃继续反应，TLC监测，12h后，反应完毕，停止反应，蒸出溶剂二甲基甲酰胺，乙酸乙酯复溶，加入水洗三次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干即得产物粗品，然后用体积分数为95％乙醇重结晶，得纯品LN-S-1；

称取0.1g中间体LNa-3于50mL茄形烧瓶中，加入15mL二甲基甲酰胺，室温搅拌溶解，加入0.0460g碳酸氢钠，升温至40℃搅拌1.5h后，再缓慢滴加0.2393g N-溴甲基邻苯二甲酰亚胺的二甲基甲酰胺溶液，2h滴毕，TLC监测，反应完毕，停止反应，蒸出溶剂，乙酸乙酯复溶，加入水洗三次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干即得产物粗品，然后用体积分数为95％乙醇重结晶，得纯品LN-S-5；

(6)称取0.1g产物LN-S-6于50mL茄形烧瓶中，加入10mL重蒸二氯甲烷室温搅拌溶解，缓慢滴加0.1385g间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷溶液，滴毕，TLC监测，18h后反应完毕，停止反应，向反应液中加入过量新配制的硫代硫酸钠溶液，除去反应中剩余的间氯过氧苯甲酸，分离有机相，水洗三次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干即得产物粗品，然后用无水乙醇重结晶，即得产物LN-S-9。

6.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备抗HBV的药物中的应用。

7.一种抗HBV药物组合物，包含权利要求1-3任一项所述化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种取代嘌呤类衍生物，本发明还涉及这类衍生物的制备方法及其在制备抗乙型肝炎药物中的用途。

背景技术

病毒感染性疾病是严重危害人类生命健康的一大类疾病。乙肝病毒(HBV)是乙型肝炎的主要病原体。虽然目前乙肝疫苗已成功的研发并广泛推广，但是乙肝病毒因其极强的传染性和致病性，社会危害性仍然极大。此外，干扰素和核苷类药物的实施是抗乙型肝炎治疗的一项重大突破，但是由于耐药性的出现及长期服药的毒性问题极大地限制了该疗法的应用，具有新结构、新机制的抗乙型肝炎药物的研发刻不容缓。

杂环化合物具有广泛的抗病毒活性，它们一般是作为构成药效团的基本结构母核，以适合药物特殊作用靶点的空间要求，或者是作为活性取代基或环系的组成部分而产生相应的生物活性。药物之所以依赖于杂环是因为杂环较脂肪或芳香化合物在体内更不易代谢分解，且具有更好的生物相容性。苯并咪唑环是一类重要的芳杂环，其衍生物具有广泛的生物活性以及临床应用。本发明基于苯并咪唑类似物良好的抗HBV活性，利用生物电子等排体嘌呤环取代苯并咪唑环，设计合成了一系列取代嘌呤类衍生物，现有技术中未见此类化合物及其应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种取代嘌呤类衍生物及其制备方法，本发明还提供取代嘌呤类衍生物的抗HBV活性筛选结果及其在制备抗乙型肝炎药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

1.取代嘌呤类衍生物

本发明所涉及的是具有如下通式Ⅰ所示结构的取代嘌呤类衍生物，以及其N-氧化物、立体异构体形式、立体异构体混合物或药学上可接受的盐：

其中，

R为氨基、氯原子、氟原子、溴原子、碘原子、羟基、甲基或乙基；

Linker为0-3个碳原子的烷烃链或含杂原子的烷烃链；

R₂为各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环、各种取代的六元并五元杂环、各种取代的六元并六元杂环、各种取代的五元并五元杂环、各种取代的苯并五元杂环或各种取代的苯并六元杂环；

根据本发明优选的，所述通式Ⅰ中，

R为氯原子；

R₁为甲基、乙基、苄基或对甲基苄基；

Linker为长度是0个原子的烷烃链、1个碳原子和1个硫原子的烷烃链或2个碳原子和1个硫原子的烷烃链；

R₂为N-甲基吡咯甲醛、吲哚甲醛、5-溴吲哚甲醛、N-溴甲基邻苯二甲酰亚胺或N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺；

本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19页。

本发明中所述的“前药”是指药学上可接受的衍生物，以便这些衍生物所得的生物转换产物是如式Ⅰ化合物所定义的活性药物。

根据本发明，进一步优选的，取代嘌呤类衍生物为如下具体化合物之一：

2.取代嘌呤类衍生物的制备方法：

取代嘌呤类衍生物的制备方法，由起始原料2,4-二氯-5-硝基嘧啶经低温下选择性亲核取代，得中间体LN-1，中间体LN-1的硝基经氯化亚锡还原得到关键中间体LN-2；中间体LN-2中的氨基与带醛基的芳杂环生成席夫碱，再在无水三氯化铁催化下环合得到部分终产物LN-0系列；中间体LN-2与硫羰基二咪唑反应生成中间体LN-3，再经亲核取代得到终产物LN-S系列，然后由间氯过氧苯甲酸氧化得到亚砜产物。

合成路线如下：

其中，其中，R₁、R₂的定义同上通式Ⅰ所述。

本发明所述的室温为20-30℃。

本发明更为详细的，取代嘌呤类衍生物的制备方法，步骤如下：

3.取代嘌呤类衍生物的抗HBV活性及应用

通过HepG2.2.15细胞株对新合成的20个取代嘌呤类衍生物进行了体外抗HBV活性研究，以拉米夫定(3TC)为阳性对照药物，利用ELISA法测定目标化合物在体外抑制HBsAg(表面抗原)和HBeAg(核心抗原)分泌的活性；通过PCR法测定了部分化合物的抑制HBV DNA复制活性；采用CCK-8法检测样品化合物的细胞毒性，从而对样品化合物的抗HBV活性进行筛选。它们的抗HBV活性和毒性数据列于表1、2中。

本发明的取代嘌呤类衍生物可作为非核苷类HBV抑制剂应用。具体地说，作为HBV抑制剂用于制备抗乙型肝炎药物。

一种抗HBV药物组合物，包括本发明的取代嘌呤类衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明提供了结构全新的取代嘌呤类衍生物及其制备方法，抗HBV活性筛选结果及其在制备抗乙型肝炎药物中的应用。经过实验证明，本发明的取代嘌呤类衍生物可作为HBV抑制剂应用并具有潜在的应用价值。具体地说，作为HBV抑制剂用于制备抗乙型肝炎药物。

具体实施方式

通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例中所涉及的合成路线如下：

实施例1.中间体LN-2的制备方法(以LNa-2为例，R₁＝甲基)

称取2,4-二氯-5-硝基嘧啶(2.0g，10.4mmol)于100mL茄形烧瓶中，加入二氯甲烷(20mL)室温搅拌溶解，放入低温反应仪中，降温至-30℃时，加入二异丙基乙胺(3.07mL，19.0mmol)，至-78℃时，缓慢滴加用二氯甲烷(5mL)稀释的40％甲胺水(0.885g，11.4mmol)溶液，滴毕，继续搅拌4h，TLC监测，反应完毕，停止反应，恢复至室温，水洗三次(25mL)，饱和食盐水洗一次(25mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干拌样，硅胶柱层析分离纯化，流动相选择石油醚：乙酸乙酯，体积比8：1，得到中间体LNa-1；

称取中间体LNa-1(1.4g，7.42mmol)于250mL烧瓶中，乙醇(100mL)溶解，搅拌下分批加入氯化亚锡(6.17g，29.7mmol)，加毕，在氮气保护下，升温至80℃回流反应9h，TLC监测，反应完毕，停止反应，待反应液恢复至室温，测反应液pH为3，冰水浴下，用1M氢氧化钠溶液缓慢调pH至8，用硅藻土抽滤，将滤液中大部分乙醇蒸出，再加入乙酸乙酯(3×20mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(60mL)洗一次，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液蒸干拌样，硅胶柱层析分离纯化，流动相选择石油醚：乙酸乙酯，体积比1：1至1：2，得中间体LNa-2；

2-氯-N₄-甲基嘧啶-4,5-二胺(LNa-2)

浅棕色粉末，产率56.1％，熔点：138-140℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.61(s,1H,purine-CH),5.09(s,1H,purine-NH-CH₃),3.07(d,3H,J＝4.0Hz,purine-NH-CH₃),1.57(s,2H,purine-NH₂),impurity peaks:3.79,1.25(Ethanol)；ESI-MS:m/z 159.2,161.4[M+H]⁺.C₅H₇ClN₄(158.04).

2-氯-N₄-乙基嘧啶-4,5-二胺(LNb-2)

深棕色粉末，产率53.1％，熔点：164-166℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.54(s,1H,purine-CH),5.33(s,1H,purine-NH-CH₂),3.52-3.48(m,2H,NH-CH₂-CH₃),3.17(s,2H,purine-NH₂),1.25(t,3H,NH-CH₂-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm:156.98,152.35,140.90,124.00(purine-C),36.03(NH-CH₂-CH₃),14.58(NH-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 173.3,175.2[M+H]⁺.C₆H₉ClN₄(172.05).

N₄-苄基-2-氯嘧啶-4,5-二胺(LNc-2)

浅棕色粉末，产率65.43％，熔点：183-186℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.64(s,1H,purine-CH),7.37-7.32(m,5H,Ph-H),5.27(s,1H,purine-NH-CH₂),4.68(d,2H,J＝4.0Hz,purine-NH-CH₂-Ph),2.95(s,2H,purine-NH₂),impurity peaks:1.25(Ethanol)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm:157.08,153.00,142.56,128.86(purine-C),137.87,128.23,127.86,123.54(Ph-C),45.27(NH-CH₂-Ph)；ESI-MS:m/z 234.7,236.7[M+H]⁺,257.2,259.2[M+Na]⁺.C₁₁H₁₁ClN₄(234.07).

2-氯-N₄-(4-甲基苄基)嘧啶-4,5-二胺(LNd-2)

浅黄色粉末，产率51.0％，熔点：147-150℃；ESI-MS:m/z 249.4,251.4[M+H]⁺.C₁₂H₁₃ClN₄(248.08).

实施例2.中间体LN-3的制备方法(以LNa-3为例，R₁＝甲基)

称取中间体LNa-2(0.3g，1.89mmol)于50mL烧瓶中，重蒸四氢呋喃(15mL)溶解，搅拌下加入硫羰基二咪唑(0.5057g，2.84mmol)，加入三乙胺(0.2871g，2.84mmol)，升温至70℃回流反应12h，TLC监测，显示原料已大部分反应完毕，停止反应，待反应恢复至室温，蒸出大部分四氢呋喃，再加入乙酸乙酯复溶，冰水浴下，用2M氢氧化钠溶液洗有机相三次，水相合并，冰水浴缓慢搅拌下，滴加稀盐酸，析出固体，过滤，滤饼用水洗后干燥即得中间体LNa-3。

2-氯-9-甲基-9H-嘌呤-8-硫醇(LNa-3)

浅黄色粉末，产率52.3％，熔点：292-294℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:13.57(s,1H,-SH),8.39(s,1H,purine-CH),3.56(s,3H,purine-N-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:173.05,153.79,152.34,136.70,124.06(purine-C),29.32(purine-N-CH₃)；ESI-MS:m/z201.2,203.2[M+H]⁺.C₆H₅ClN₄S(199.99).

2-氯-9-乙基-9H-嘌呤-8-硫醇(LNb-3)

浅黄色粉末，产率55.3％，熔点：263-266℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.20(s,1H,purine-CH),4.19(q,2H,J＝8.0Hz,purine-N-CH₂-CH₃),1.91(s,1H,-SH),1.25(t,3H,J＝8.0Hz,purine-N-CH₂-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:173.05,153.79,152.34,136.70,124.06(purine-C),29.32(purine-N-CH₃)；ESI-MS:m/z 215.3,217.4[M+H]⁺.C₇H₇ClN₄S(214.01).

9-苄基-2-氯-9H-嘌呤-8-硫醇(LNc-3)

浅黄色粉末，产率56.0％，熔点：231-234℃。

2-氯-9-(4-甲基苄基)-9H-嘌呤-8-硫醇(LNd-3)

浅黄色粉末，产率54.7％，熔点：206-208℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.05(s,1H,purine-CH),7.20(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),7.08(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),5.31(s,2H,purine-N-CH₂-Ph),2.24(s,3H,Ph-CH₃),impurity peaks:1.71(Tetrahydrofuran)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:177.31,174.79,147.86,137.28(purine-C),136.39,135.37,129.13,127.99(Ph-C),45.24(purine-N-CH₂-Ph),24.86(Ph-CH₃)；ESI-MS:m/z 291.3,293.3[M+H]⁺.C₁₃H₁₁ClN₄S(290.04).

实施例3.目标化合物LN-0-1～LN-0-3的制备方法(以LN-0-1为例，R₁＝甲基，R₂＝N-甲基-2-吡咯)

称取中间体LNa-2(0.3g，1.89mmol)于50mL茄形烧瓶中，无水甲醇(15mL)溶解，搅拌下分别加入N-甲基-2-吡咯甲醛(0.2684g，2.46mol)，醋酸(0.1mL)，室温搅拌6h，TLC监测，反应完毕，减压蒸出溶剂甲醇和醋酸，再加入无水乙醇(15mL)溶解，搅拌下加入5％FeCl₃-SiO₂(6.2g)，升温至80℃回流1～2h，停止反应，冷却至室温，过滤出不溶物，将滤液中的乙醇蒸出，加入乙酸乙酯复溶，水洗(3×5mL)三次，饱和食盐水(5mL)洗一次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干拌样，硅胶柱层析分离纯化，流动相选择石油醚：乙酸乙酯，体积比10：1至8：1，即可分离出产物LN-0-1。

以不同的中间体LN-2和N-甲基-2-吡咯甲醛，用上述方法分别制得化合物LN-0-1～LN-0-3的目标产物，结果如下：

白色粉末，产率33.7％，熔点：152-154℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.96(s,1H,purine-CH),7.21-7.20,6.95-6.93,6.29-6.27(m,3×1H,pyrrole-CH),3.97(s,3H,purine-N-CH₃),3.86(s,3H,pyrrole-N-CH₃)；ESI-MS:m/z 248.3,250.3[M+H]⁺.C₁₁H₁₀ClN₅(247.06).

操作同实施例3，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNb-2。

白色粉末，产率53.6％，熔点：140-142℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.00(s,1H,purine-CH),7.22-7.21,6.84-6.83,6.30-6.29(m,3×1H,pyrrole-CH),4.41(q,2H,J＝8.0Hz,purine-N-CH₂-CH₃),3.94(s,3H,pyrrole-N-CH₃),1.41(t,3H,J＝8.0Hz,purine-N-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 262.2,264.2[M+H]⁺.C₁₂H₁₂ClN₅(261.08).

操作同实施例3，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNc-2。

淡黄色粉末，产率28.5％，熔点：130-132℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.08(s,1H,purine-CH),7.35-7.29,7.08-7.06(m,5H,Ph-H),7.17,6.46,6.16(s,3×1H,pyrrole-CH),5.60(s,2H,N-CH₂-Ph),3.93(s,3H,pyrrole-N-CH₃)，impurity peak:1.23,0.85(n-hexane)；ESI-MS:m/z 324.4,326.5[M+H]⁺.C₁₇H₁₄ClN₅(323.09).

实施例4.目标化合物LN-0-4～LN-0-8的制备方法(以LN-0-3为例，R₁＝甲基，R₂＝1-H-3-吲哚基)

称取中间体LNa-2(0.2g，1.26mmol)于50mL茄形烧瓶中，无水甲醇(15mL)溶解，搅拌下分别加入吲哚醛(0.2197g，1.51mmol)，醋酸(0.1mL)，室温搅拌12h，TLC监测，显示原料已反应完毕，减压蒸出溶剂甲醇和醋酸，再加入无水乙醇或二甲基甲酰胺(15mL)溶解，搅拌下加入溶剂稀释的FeCl₃(0.2045g，1.26mmol)溶液，升温至80℃回流10h，停止反应，冷却至室温，直接过滤出不溶物，滤饼用水洗，石油醚洗，真空干燥箱干燥，即可得到产物LN-0-4。

以不同的中间体LN-2和吲哚甲醛或5-溴吲哚甲醛，用上述方法分别制得化合物LN-0-4～LN-0-8的目标产物，结果如下：

淡黄色粉末，产率35.3％，熔点：>320℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:12.11(s,1H,indole-NH),8.95(s,1H,purine-CH),8.52,7.55(m,5H,indole-CH),4.01(s,3H,N-CH₃)；ESI-MS:m/z 284.3,286.2[M+H]⁺.C₁₄H₁₀ClN₅(283.06).

操作同实施例4，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNb-2。

白色粉末，产率41.0％，熔点：315-317℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:12.34(s,1H,indole-NH),8.97(s,1H,purine-CH),8.51,8.25,7.58,7.28-7.23(m,5H,indole-CH),4.55(q,2H,N-CH₂-CH₃),1.42(t,3H,N-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 298.5,300.4[M+H]⁺.C₁₅H₁₂ClN₅(297.08).

操作同实施例4，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNc-2。

白色粉末，产率39.1％，熔点：>320℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:11.91(s,1H,indole-NH),9.05(s,1H,purine-CH),8.55-8.53,7.85,7.49,7.15-7.13(m,5H,indole-CH),7.34-7.32,7.27-7.25(m,5H,Ph-H),5.80(s,2H,N-CH₂-Ph)；ESI-MS:m/z 360.4,362.4[M+H]⁺.C₂₀H₁₄ClN₅(359.09).

操作同实施例4，所不同的是将取代基吲哚甲醛替换为5-溴吲哚甲醛。

淡褐色粉末，产率14.7％，熔点：>300℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:12.30(s,1H,indole-NH),9.02(s,1H,purine-CH),9.02,8.72,8.42,7.54-7.42(m,4H,indole-CH),4.01(s,3H,N-CH₃)；ESI-MS:m/z 362.3,364.3,366.3[M+H]⁺.C₁₄H₉BrClN₅(360.97).

操作同实施例4，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNb-2，将取代基吲哚甲醛替换为5-溴吲哚甲醛。

淡黄色粉末，产率18.0％，熔点：>300℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:12.26(s,1H,indole-NH),9.04(s,1H,purine-CH),8.71,8.33,7.53-7.42(m,4H,indole-CH),4.56(m,2H,N-CH₂-CH₃),1.42(t,3H,N-CH₂-CH₃),impurity peaks:4.34,3.43,1.06(Ethanol)；ESI-MS:m/z376.3,378.4,380.4[M+H]⁺.C₁₅H₁₁BrClN₅(374.99).

操作同实施例4，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNc-2，将取代基吲哚甲醛替换为5-溴吲哚甲醛。

白色粉末，产率24.7％，熔点：>300℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:12.10(s,1H,indole-NH),9.13(s,1H,purine-CH),8.73,7.93,7.78,7.48-7.46,7.40-7.38(m,4H,indole-CH),7.35-7.27,7.14-7.13(m,5H,Ph-H),5.81(m,2H,N-CH₂-Ph),impurity peaks:4.49,3.43,1.06(Ethanol),1.44(Cyclohexane)；ESI-MS:m/z 438.4,440.4,442.4[M+H]⁺.C₂₀H₁₃BrClN₅(437.00).

实施例5.目标化合物LN-S-1～LN-S-4的制备通法(以LN-S-1为例，R₁＝甲基，R₂＝N-乙基邻苯二甲酰亚胺基)

称取中间体LNa-3(0.1g，0.498mmol)于50mL茄形烧瓶中，加入二甲基甲酰胺(10mL)室温搅拌溶解，先加入碳酸钾(0.103g，0.748mmol)，室温搅拌0.5h后，加入原料N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺(0.139g，0.548mmol)，升温至40℃继续反应，TLC监测，12h后，反应完毕，停止反应，蒸出大部分溶剂，乙酸乙酯(6mL)复溶，加入水洗三次(3×5mL)，饱和食盐水(5mL)洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干即得产物粗品，然后用体积分数为95％乙醇重结晶，得纯品LN-S-1。

以不同的中间体LN-3和N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺，用上述方法分别制得化合物LN-S-1～LN-S-4的目标产物，结果如下：

白色晶体，产率39.7％，熔点：213-214℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.57(s,1H,purine-CH),7.77-7.73(m,4H,Ph-H),4.07(t,2H,J＝8.0Hz,S-CH₂-CH₂-N),3.71(t,2H,J＝8.0Hz,S-CH₂-CH₂-N),3.55(s,3H,N-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:168.13(N-CO＝C),157.97,155.29,151.80,131.81,123.40(purine-C),134.78,133.37,123.40(isoindoline-1,3-dione-C),37.74(S-CH₂-CH₂-N),30.57(N-CH₃),29.31(S-CH₂-CH₂-N)；ESI-MS:m/z 374.3,376.4[M+H]⁺,396.1[M+Na]⁺.C₁₆H₁₂ClN₅O₂S(373.04).

操作同实施例5，所不同的是将中间体LNa-3替换为LNb-3。

白色晶体，产率41.6％，熔点：227-229℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.59(s,1H,purine-CH),7.78-7.75(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),4.09-4.05(m,4H,S-CH₂-CH₂-N,N-CH₂-CH₃),3.74(t,2H,J＝8.0Hz,S-CH₂-CH₂-N),1.29(t,3H,J＝8.0Hz,N-CH₂-CH₃)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm:168.05(N-CO＝C),156.11,154.93,152.68,145.80,133.63(purine-C),134.13,131.88 123.29(isoindoline-1,3-dione-C),38.19(S-CH₂-CH₂-N),37.17(N-CH₂-CH₃),30.18(S-CH₂-CH₂-N),14.31(N-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 387.9,389.9[M+H]⁺,410.2[M+Na]⁺.C₁₇H₁₄ClN₅O₂S(387.06).

操作同实施例5，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNc-2。

白色晶体，产率36.0％，熔点：186-188℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.66(s,1H,purine-CH),7.80-7.77(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),7.35-7.28,7.18(m,5H,Ph-H),5.29(s,2H,N-CH₂-Ph),4.09(t,2H,J＝4.0Hz,S-CH₂-CH₂-N),3.70(t,2H,J＝4.0Hz,S-CH₂-CH₂-N)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:168.12(N-CO＝C),157.77,155.27,152.06,146.46,127.56(purine-C),135.21,133.38,129.27(Ph-C),134.80,131.87,123.45(isoindoline-1,3-dione-C),46.13(N-CH₂-Ph),37.49(S-CH₂-CH₂-N),30.49(S-CH₂-CH₂-N)；ESI-MS:m/z 450.4[M+H]⁺.C₂₂H₁₆ClN₅O₂S(449.07).

操作同实施例5，所不同的是将中间体LNa-2替换为LNd-2。

白色絮状晶体，产率37.4％，熔点：204-205℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.65(s,1H,purine-CH),7.80-7.78(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),7.13(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),7.07(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),5.23(s,2H,N-CH₂-Ph),4.09(t,2H,J＝4.0Hz,S-CH₂-CH₂-N),3.70(t,2H,J＝4.0Hz,S-CH₂-CH₂-N),2.25(s,3H,Ph-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm:167.99(N-CO＝C),156.61,155.24,152.94,145.99,131.29(purine-C),138.28,133.18,129.54,127.98(Ph-C),134.11,131.86,123.29(isoindoline-1,3-dione-C),46.14(N-CH₂-Ph-CH₃),37.12(S-CH₂-CH₂-N),30.39(S-CH₂-CH₂-N),21.15(Ph-CH₃)；ESI-MS:m/z 464.4,466.4[M+H]⁺,486.5[M+Na]⁺.C₂₃H₁₈ClN₅O₂S(463.09).

实施例6.目标化合物LN-S-5～LN-S-8的制备通法(以LN-S-5为例，R₁＝甲基，R₂＝N-甲基邻苯二甲酰亚胺基)

称取中间体LNa-3(0.1g，0.4984mmol)于50mL茄形烧瓶中，加入二甲基甲酰胺(15mL)室温搅拌溶解，加入碳酸氢钠(0.0460g，0.5482mmol)升温至40℃搅拌1.5h后，再缓慢滴加N-溴甲基邻苯二甲酰亚胺(0.2393g，0.9968mmol)的二甲基甲酰胺溶液，滴毕(2h)，TLC监测，反应完毕，停止反应，蒸出大部分溶剂，乙酸乙酯(6mL)复溶，加入水洗三次(3×5mL)，饱和食盐水(5mL)洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干即得产物粗品，然后用体积分数为95％乙醇重结晶，得纯品LN-S-5。

以不同的中间体LN-3和N-溴甲基邻苯二甲酰亚胺用上述方法分别制得化合物LN-S-5～LN-S-8的目标产物，结果如下：

淡褐色针状晶体，产率37.8％，熔点：210-212℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.80(s,1H,purine-CH),7.90-7.88(m,2H,Ph-H),7.78-7.75(m,2H,Ph-H),5.69(s,2H,S-CH₂-N),3.69(s,3H,N-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm:166.54(N-CO＝C),155.12,153.26,146.95,123.87(purine-C),134.63,133.27,123.87(isoindoline-1,3-dione-C),38.85(S-CH₂-N),29.00(N-CH₃)；ESI-MS:m/z 360.4,362.4[M+H]⁺,382.3[M+Na]⁺.C₁₅H₁₀ClN₅O₂S(359.02).

操作同实施例6，所不同的是将中间体LNa-3替换为LNb-3。

淡黄色针状晶体，产率35.4％，熔点：157-158℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.80(s,1H,purine-CH),7.89-7.77(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),5.70(s,2H,S-CH₂-N),4.21(q,2H,J＝8.0Hz,N-CH₂-CH₃),1.29(t,3H,J＝8.0Hz,N-CH₂-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:166.88(N-CO＝C),155.13,154.92,152.38，147.45,131.87(purine-C),135.40,133.58,123.99(isoindoline-1,3-dione-C),39.52(S-CH₂-N),38.66(N-CH₂-CH₃),14.58(N-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 374.3,376.4[M+H]⁺,396.1[M+Na]⁺.C₁₆H₁₂ClN₅O₂S(373.04).

操作同实施例6，所不同的是将中间体LNa-3替换为LNc-3。

淡黄色针状晶体，产率41.2％，熔点：182-184℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.67(s,1H,purine-CH),7.90-7.87,7.79-7.75(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),7.59-7.57(m,2H,Ph-H),7.33-7.28(m,3H,Ph-H),6.17(s,2H,N-CH₂-Ph),5.48(s,2H,S-CH₂-N)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:166.81(N-CO＝C),155.75,155.31,152.69,147.79,129.20(purine-C),133.50,131.86,123.98(isoindoline-1,3-dione-C),135.35,127.65(Ph-C),46.34(N-CH₂-Ph),39.52(S-CH₂-N)；ESI-MS:m/z 436.4,438.4[M+H]⁺,458.4,460.4[M+Na]⁺.C₂₁H₁₄ClN₅O₂S(435.06).

操作同实施例6，所不同的是将中间体LNa-3替换为LNd-3。

淡黄色针状晶体，产率39.4％，熔点：189-191℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.83(s,1H,purine-CH),7.87-7.84,7.78-7.75(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),7.18(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),7.07(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),5.62(s,2H,N-CH₂-Ph),5.26(s,2H,S-CH₂-N),2.25(s,3H,Ph-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:166.80(N-CO＝C),155.73,155.25,152.67,147.78,132.43(purine-C),135.35,131.86,123.97(isoindoline-1,3-dione-C),137.76,133.48,129.73,127.68(Ph-C),46.14(N-CH₂-Ph-CH₃),39.36(S-CH₂-N),21.10(Ph-CH₃)；ESI-MS:m/z450.3,452.2[M+H]⁺,472.3[M+Na]⁺.C₂₂H₁₆ClN₅O₂S(449.07).

实施例7.目标化合物LN-S-9、LN-S-10和LN-S-11的制备通法(以LN-S-9为例，R₁＝乙基，R₂＝N-甲基邻苯二甲酰亚胺基)

称取产物LN-S-6(0.1g，0.2675mmol)于50mL茄形烧瓶中，加入重蒸二氯甲烷(10mL)室温搅拌溶解，缓慢滴加间氯过氧苯甲酸(0.1385g，0.8025mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)，滴毕，TLC监测，18h后反应完毕，停止反应，向反应液中加入过量新配制的硫代硫酸钠溶液，除去反应中剩余的间氯过氧苯甲酸，分离有机相，水洗三次(3×5mL)，饱和食盐水(5mL)洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干即得产物粗品，然后用无水乙醇重结晶，即得产物LN-S-9。

以不同的终产物LN-S-6、LN-S-2或LN-S-8，用上述方法分别制得化合物LN-S-9、LN-S-10和LN-S-11的目标产物，结果如下：

白色絮状晶体，产率39.5％，熔点：198-199℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.74(s,1H,purine-CH),7.76-7.69(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),4.75-4.56(m,2H,N-CH₂-CH₃),4.36-4.22(m,2H,SO-CH₂-CH₂-N),4.16-4.10,3.89-3.83(m,2H,SO-CH₂-CH₂-N),1.59(t,3H,J＝8.0Hz,N-CH₂-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:167.10(N-CO＝C),156.32,154.39,151.88,131.59(purine-C),135.70,132.59,123.97(isoindoline-1,3-dione-C),57.59(N-CH₂-CH₃),15.52(N-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 391.5[M+H]⁺.C₁₆H₁₂ClN₅O₃S(389.03).

操作同实施例7，所不同的是将LN-S-6替换为LN-S-2。

白色絮状晶体，产率32.7％，熔点：221-222℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.93(s,1H,purine-CH),7.88-7.86,7.81-7.79(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),5.59-5.44(m,2H,SO-CH₂-N),4.68-4.66(m,2H,N-CH₂-CH₃),1.58(t,3H,J＝8.0Hz,N-CH₂-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δppm:167.92(N-CO＝C),156.83,154.34,151.84,131.85(purine-C),134.87,132.14,123.44(isoindoline-1,3-dione-C),50.81(SO-CH₂-CH₂-N),31.08(SO-CH₂-CH₂-N,N-CH₂-CH₃),15.50(N-CH₂-CH₃)；ESI-MS:m/z 404.4[M+H]⁺,426.2[M+Na]⁺.C₁₇H₁₄ClN₅O₃S(403.05).

操作同实施例7，所不同的是将LN-S-6替换为LN-S-8。

白色晶体，产率34.6％，熔点：171-173℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.96(s,1H,purine-CH),7.84-7.78(m,4H,isoindoline-1,3-dione-CH),7.40(d,2H,J＝12.0Hz,Ph-H),7.12(d,2H,J＝8.0Hz,Ph-H),5.78(q,2H,J＝16.0Hz,J＝12.0Hz,N-CH₂-Ph),5.31(q,2H,J＝12.0Hz,J＝12.0Hz,S-CH₂-N),2.29(s,3H,Ph-CH₃),impurity peaks:1.55(H₂O),1.25(Ethanol-CH₃)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm:166.52(N-CO＝C),151.17,134.81,129.66(purine-C),134.81,128.72(Ph-C),131.49,124.07(isoindoline-1,3-dione-C),57.13(N-CH₂-Ph-CH₃),46.82(S-CH₂-N),21.36(Ph-CH₃)；ESI-MS:m/z 466.3[M+H]⁺,488.3[M+Na]⁺,931.3[2M+H]⁺,953.4[M+Na]⁺.C₂₂H₁₆ClN₅O₃S(465.07).

实验例1：目标化合物的体外抗HBV活性测试实验

测试原理

HBV转基因肝癌细胞系--HepG2.2.15细胞株能分泌病毒颗粒于培养上清，包括病毒DNA、HBsAg和HBeAg。在加入待测目标化合物后，细胞分泌HBsAg和HBeAg含量会有所变化。因此，通过检测细胞分泌到培养上清中病毒颗粒含量，对比未加药对照组含量，可以获得样品药物的抗病毒能力，同时还可以检测样品药物对细胞的毒性大小。以拉米夫定(3TC)为阳性对照药，用ELISA法检测样品药物达到抑制病毒HBsAg的和HBeAg分泌的50％时的浓度数值为IC₅₀；用PCR法检测样品药物抑制HBV DNA复制量的50％时的浓度数值IC₅₀；用CCK-8法检测样品药物导致50％细胞毒性死亡时的浓度数值为CC₅₀；通过公式:SI＝CC₅₀/IC₅₀,计算出待测化合物的“选择系数”(selectivity index，SI)。由于化合物的溶解度不同，因此每个化合物初筛浓度也不同。(活性结果见表1和表2)

其中，首先将活性试验所得到的OD值换算成抑制率，然后再根据浓度梯度将其转化成IC₅₀和CC₅₀值，由改良寇式法计算，公式如下：

lgIC₅₀＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)；

Xm:lg最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；

P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率

测试病毒株

HBV转基因肝癌细胞系HepG2.2.15细胞株。HepG2.2.15可以稳定表达乙肝病毒颗粒，该细胞株由山东大学马春红教授课题组提供。

测试方法

培养上清的收集

将HepG2.2.15细胞接种于96孔板中，次日加入不同浓度的样品药物(每浓度3复孔)，在第四天更换培养液及同浓度的样品药物，于第九天收集培养上清液待测。

细胞毒性实验(CCK-8法)

向96孔板中的细胞加CCK-8，4小时后加CCK-8溶解液反应过夜，次日在酶标仪上测OD₄₅₀。根据OD值计算出样品药物对HepG2.2.15细胞的毒性作用以及影响细胞生长的状况，最后计算出导致半数细胞死亡量所需的浓度(CC₅₀)。

酶联免疫法检测培养上清中HBeAg和HBsAg的含量

向包被好的条形板中分别加入50μL的培养上清液，并加入等量的HBeAg和HBsAg用酶标结合物(空白对照孔不加)，充分混匀，贴上胶纸，置37℃下孵育60分钟后弃去条形板内液体，并用洗涤液洗涤，重复5次，然后拍干。最后每孔加入混合后的发光底物50μL，充分混匀室温避光孵育10分钟后加入终止液(50μL)终止反应，用酶标仪测定OD₄₅₀/₆₃₀，并根据OD值计算样品对HBV抗原的半数抑制率(IC₅₀)。

PCR法检测培养上清中HBV DNA的含量

HepG2 2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养4小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养8天(每4天换液一次)，收集上清液，用荧光探针法进行PCR检测。

表1.新型嘌呤非核苷类抑制剂的抗乙肝病毒初筛活性

注：活性化合物用粗体表示；^aND：未测定。

表2.部分化合物的抗HBsAg和HBeAg分泌活性

注：^bIC₅₀：抑制50％HBsAg或HBeAg分泌时化合物的浓度；^cCC₅₀：抑制50％细胞生长时化合物的浓度；^dSI：选择指数，CC₅₀/IC₅₀的比值；^eNA：无活性。

结论：

由表1可以看出，本发明的取代嘌呤类衍生物是一系列结构新颖的非核苷类HBV抑制剂，表现出了不同的抑制抗原(HBsAg和HBeAg)分泌活性。其中，化合物LN-S-4、LN-S-6、LN-S-9和LN-S-10对两种抗原的抑制率超过50％。在最大初筛浓度下，除化合物LN-0-5、LN-0-7、LN-0-8和LN-S-8的DNA复制抑制率达到40％，大部分化合物几乎不具有HBV DNA复制抑制活性。基于初筛结果，进一步筛选了化合物LN-S-4、LN-S-6、LN-S-9和LN-S-10对抗原的抑制活性(表2)。其中，化合物LN-S-10活性最好，对HBsAg的活性为IC₅₀＝6.63μM，SI＝1.17，对HBeAg的活性为IC₅₀＝4.43μM，SI＝1.72。因此该类取代嘌呤类衍生物具有进一步研究与开发的价值，可作为抗HBV的先导化合物加以利用。

取代嘌呤类衍生物及其制备方法与应用专利购买费用说明