专利摘要

本发明涉及一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法，属于生物化工领域。本发明将发酵液pH值调节至pH0.5—4.0；在搅拌条件下缓慢加入20—1200mg/L絮凝剂，缓慢搅拌10-20分钟；加入0.5％-1.0％助滤剂后将絮凝好的发酵液压入板框压滤机中进行过滤。与目前常用的分离方式相比，本发明工艺不需要加热和稀释，固液分离速度快，滤液澄清度高；设备投资低，维护成本低；ε-聚赖氨酸收率高，杂蛋白去除率高，适合工业化大生产使用。

权利要求

1.一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法，包括以下步骤：将ε-聚赖氨酸发酵液pH值调节至pH0.5-4.0；在搅拌条件下缓慢加入20-1200mg/L絮凝剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括向经絮凝处理的发酵液中加入0.5％-1.0％助滤剂，然后将絮凝好的发酵液压入板框压滤机中进行过滤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH值调节采用无机酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无机酸为盐酸、硫酸或磷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂为高分子有机阴离子絮凝剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂是聚丙烯酸或聚丙烯酸盐或两者的混合物。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂是聚丙烯酸钠。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述助滤剂优选硅藻土。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述助滤剂优选珍珠岩。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ε-PL发酵液是链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌ε-PL发酵液。

说明书

技术领域

本发明涉及一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法，特别涉及一种用絮凝剂去除ε-聚赖氨酸发酵液中菌体、纯化ε-聚赖氨酸的方法，属于生物化工领域。

背景技术

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌等微生物分泌产生的一种同型氨基酸聚合物。它一般由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH₂脱水缩合而成，分子量通常为2500-4500Da。由于ε-PL具有抑菌谱广、水溶性好、热稳定性强、安全性高等特点，目前主要作为生物食品防腐剂广泛应用于日本、韩国、欧美等国家和地区的食品工业。另外，ε-PL还被用于药物载体、基因芯片等领域的应用研究。因此，ε-PL被认为是一种具有重要工业应用价值的新型工业生物技术产品，近年来受到越来越多的食品和生物材料领域关注。目前ε-PL的生产还只能在少数国家实现，主要集中在日本。然而，随着国内ε-PL发酵水平的稳步提升，已经具备了产业化的潜力。因此，研发ε-PL高效分离和提取技术对实现其工业化生产至关重要。

目前ε-PL一般只能通过微生物发酵法进行生产。ε-PL发酵液是一个非常复杂的体系，除了含有少量目标产品(3-4％，干重)外，还含有大量的菌体细胞(20-30％，湿菌体体积)、细胞碎片、生物大分子(如蛋白质和核酸)和胶体物质等。同时，发酵液还具有较高的表观粘度并呈现出典型的非牛顿流体特性；另外，菌体细胞与发酵液密度相当，形成了稳定的胶体溶液。因此，使用一般的分离方法进行ε-PL发酵液的固液分离是十分困难的。然而，若要实现ε-PL高效分离和提取，去除发酵液中菌体和生物大分子等固体及可溶性固定杂质是首先需要解决的问题。

目前关于ε-PL发酵液中菌体细胞分离和去除的方法主要有离心法和过滤法。然而，在工业生产中，离心法存在设备投资大、运行费用高、分离效率不高等诸多缺点；另外，离心法对于粘度和固形物含量较高的发酵液进行分离时，还需要进行稀释处理，这样就额外增加了水资源的消耗和后续提取工序的负荷。还有一种基于酸化和热变性的过滤方法来对ε-PL发酵液进行固液分离处理，但是，加热操作往往会产生大量的色素，势必给后续的脱色工序增加负担，也容易降低产品的收率和纯度以及影响成品外观。另外，菌体细胞在没有形成絮凝体的情况下，过滤时会在滤布表面形成可压缩的胶粘状滤饼，极易堵塞滤布，造成过滤速率迅速下降，耗时耗能且效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种不需要加热和稀释处理的且能够高效分离ε-聚赖氨酸发酵液中菌体的方法，达到对ε-PL发酵液进行有效固液分离的目的。

本发明方法包括以下步骤：将ε-PL发酵液pH值调节至pH0.5-4.0，在搅拌条件下缓慢加入20-1200mg/L絮凝剂。缓慢搅拌10-20分钟。

在一种实施方式中，还向经絮凝处理的发酵液中加入0.5％-1.0％(g/100mL)助滤剂，然后将絮凝好的发酵液压入板框压滤机中进行过滤。

所述ε-PL发酵液优选链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌ε-PL发酵液。所述链霉菌优选白色链霉菌。

所述pH值调节优选无机酸。所述无机酸包括盐酸、硫酸、磷酸等。

所述絮凝剂优选高分子有机阴离子絮凝剂，可以是聚丙烯酸、聚丙烯酸盐，或两者的混合物。絮凝剂使用前优选溶解配制成0.1～2％(g/100mL)的水溶液。

所述絮凝剂进一步优选聚丙烯酸钠。

所述助滤剂的作用是减少滤饼过滤阻力。优选硅藻土。

所述助滤剂还优选珍珠岩。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

1、成本低：设备一次性投资低，运行维护费用低；不需要稀释，节约了水资源，也降低了后续提取操作负荷；也不需要加热，降低了能耗。

2、高效率：本发明将发酵液调至极酸条件(pH0.5-4.0)，使得菌体表面和蛋白质充分阳离子化再结合阴离子絮凝剂即可形成明显的絮凝体，且会自动分层。絮凝剂促进了菌体细胞和/或生物大分子颗粒成团，降低了发酵液粘度，提高了过滤速率，通量达到100L/h/m²左右。

3、高产物回收率和蛋白去除率：过滤液菌体去除彻底、澄清度高；ε-聚赖氨酸回收率大于95％；蛋白质去除率达到70％以上。

具体实施方式

下面结合实施例，对依据本发明技术方案作进一步描述：

其中，ε-PL的测定方法采用Itzhaki法(Itzhaki,R.F,Colorimetric method for estimating polylysine and polyarginine.Analytical Biochemistry,1972:50,569–574)；蛋白的测定方法采用Bradford法(Bradford,M.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry,1976,72:248–254)。

实施例1

发酵液含ε-聚赖氨酸30g/L，菌体干重40g/L，pH3.8，蛋白浓度1.2g/L。利用浓盐酸将发酵液pH值调节至0.5，将浓度为2％的聚丙烯酸钠(分子量500万)溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到800mg/L，再继续搅拌10分钟；随后往发酵液中加入0.5％硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0.05MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5％发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为90L/h/m²，ε-PL收率95.5％，蛋白质去除率74.4％。

实施例2

发酵液含ε-聚赖氨酸40g/L，菌体干重60g/L，pH4.0，蛋白浓度2.2g/L。利用浓硫酸将发酵液pH值调节至2.0，将浓度为0.5％的聚丙烯酸(分子量1000万)溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到20mg/L，再继续搅拌20分钟；随后往发酵液中加入0.5％珍珠岩，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0.1MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5％发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为100L/h/m²，ε-PL收率96.3％，蛋白质去除率73.2％。

实施例3

发酵液含ε-聚赖氨酸20g/L，菌体干重30g/L，pH3.5，蛋白浓度1.2g/L。利用磷酸将发酵液pH值调节至3.0，将浓度为1.0％的聚丙烯酸钠(分子量1000万)溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到1200mg/L，再继续搅拌5分钟；随后往发酵液中加入0.5％硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0.15MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5％发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为120L/h/m²，ε-PL收率95.2％，蛋白质去除率72.5％。

实施例4

发酵液含ε-聚赖氨酸35g/L，菌体干重45g/L，pH4.0，蛋白浓度1.6g/L。将浓度为1.5％的聚丙烯酸钠(分子量3000万)溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到600mg/L，再继续搅拌5分钟；随后往发酵液中加入1.0％硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0.15MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5％发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为110L/h/m²，ε-PL收率94.2％，蛋白质去除率78.5％。

实施例5

发酵液含ε-聚赖氨酸30g/L，菌体干重42g/L，pH0.5，蛋白浓度1.5g/L。将浓度为1.5％的聚丙烯酸钠(分子量3000万)溶液缓慢加入到上述酸化后的发酵液中，并伴随着温和搅拌，直到聚丙烯酸钠终浓度达到1000mg/L，再继续搅拌5分钟；随后往发酵液中加入1.0％硅藻土，搅拌均匀。将上述发酵液打入板框压滤机中，压力控制在0.15MPa进行过滤，并保持压力恒定，直到过滤结束。待过滤临近结束，用5％发酵液体积的水对滤饼进行冲洗，并用高压空气将滤饼吹干。过滤全程平均过滤速率为108L/h/m²，ε-PL收率92％，蛋白质去除率78％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一种ε-聚赖氨酸发酵液絮凝除菌的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。