专利摘要

专利摘要

本发明提供一种利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法，涉及环境污染治理领域，本发明削减方法所用木醋液制备包括如下步骤：1)厌氧慢速热解法制备木醋原液WV；2)常压蒸馏法精制木醋原液，得到精馏组分分别为低温度段精馏组分F1，中间温度段精馏组分F2和高温度段精馏组分F3，能够降低根际和非根际土壤总抗生素抗性基因的绝对丰度，并且各精制组分具有明显选择性。

权利要求

1.一种木醋液在抗生素抗性基因污染土壤削减中的应用，其特征在于，

所用木醋液制备包括如下步骤：

1)厌氧慢速热解法制备木醋原液WV：将植物原料干燥至恒重，采用热解炭化炉热解植物原料制备木醋液，热解温度350℃-550℃，热解时间3h-6h，热解过程中所产生的气体经过冷凝，得到棕黑色且有刺鼻性气味的液体，然后在黑暗中静置3-6个月，取中间液体过微孔滤膜，即得木醋原液WV；

2)常压蒸馏法精制木醋原液WV：常压状态下，设置15℃-98℃低温温度段，加热蒸馏装置，采集该温度段的产物，得到精馏组分为15℃-98℃低温度段精馏组分F1，木醋原液WV或精馏组分F1分别作为所需木醋液；

具体的，将木醋原液WV或精馏组分F1分别作为土壤改良剂施用于抗生素抗性基因污染土壤中；

其中，应用木醋原液WV处理降低磺胺类、氨基糖苷类或大环内酯类抗生素抗性基因sul1，sul2，ermF,ermB，aadA5或strA，在根际和非根际土壤中的绝对丰度；应用木醋原液WV或精馏组分F1，处理降低tetO类抗生素抗性基因，在根际和非根际土壤中的绝对丰度；应用木醋原液WV，处理去除根际和非根际土壤的可移动遗传原件；

可移动遗传原件为intI1或Tn916/1545。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将木醋原液WV以及精制所得精馏组分F1施用于菌液培养基中，测定各类木醋液的抑菌性，按如下公式计算抑菌率：

抑菌率(％)＝(处理组抑菌圈直径–对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100％；和/或

将木醋原液WV及其精馏组分F1分别通过高效气相色谱-质谱联用测定进行组分分析，然后用每个峰谱的面积除以所有峰的总面积获得相对丰度面积计算每种物质的相对含量。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，木醋原液WV及其精馏组分F1的有机酸和酚类总含量为50wt％-85wt％；木醋原液WV中，有机酸含量为30wt％-50wt％，酚类含量为30wt％-50wt％；精馏组分F1中，有机酸含量为25wt％-30wt％，酚类含量为20wt％-27wt％。

4.根据权利要求1所述的应用，应用的实验方法包括：

①以蔬菜作为受试植物，将木醋原液WV及其精馏组分F1分别按比例添加至盆栽土壤，培养65d后采集根际和非根际土壤，②通过测定不同处理组根际和非根际土壤抗生素抗性基因和可移动遗传原件丰度，分析抗生素抗性基因和可移动遗传原件之间的相关性，③分别比较木醋原液WV及其精馏组分F1添加下根际和非根际土壤抗生素抗性基因变化的差异性，④分别得出木醋原液WV及其精馏组分F1对土壤抗生素抗性基因的削减评价。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在步骤①中，木醋原液WV及其精馏组分F1添加比例为木醋原液WV 140μL kg-1-180μL kg-1，精馏组分F1 100μL kg-1-120μL kg-1的比例，稀释200倍-500倍后添加至土壤；且按播种前、播种后15d和播种后30d分别按比例添加三次。

说明书

本申请是申请日为2019年11月28日，申请号为2019111948458，发明名称为“一种利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因的削减方法及应用”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及环境污染治理领域，具体涉及一种利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因的削减方法及应用。

背景技术

抗生素耐药性已经成为二十一世纪人类面临的最大公共卫生挑战之一。近年来，医疗、畜牧和水产养殖中ATs(Antibiotics，ATs)的滥用导致环境中抗生素抗性细菌(Antibiotic Resistance Bacterial，ARB)和抗生素抗性基因Antibiotic ResistanceGenes，ARGs)迅速增加，严重威胁人类健康和生态系统安全。欧洲委员会估计与抗生素耐药性感染相关的治理成本每年超过15亿欧元，而在美国，一项估计显示每年的成本高达550亿美元。ARB的产生导致大量的ARGs(存在于环境中。目前，已在多种水体、沉积物、大气和土壤等多种环境介质中检测出ARB和ARGs。土壤是ARGs的主要储存库之一。全球各地如美国、澳大利亚、墨西哥、中国等多个国家的土壤均有ARGs检出，含量为10-7-10-1copies/16S rRNAcopies。

ARGs具有“可复制或传播”的生物学特性，因此既可以通过遗传由亲代转移给子代，即垂直转移(Vertical gene transfer，VGT)，也可以通过基因水平转移(Horizontagene transfer，HGT)的方式在微生物种内和种间传播。VGT发生在同种微生物的亲代和子代之间，是自然界的正常现象，传播范围有限。而HGT可以使ARGs在种间传播，被认为是土壤中ARGs传播扩散的主要途径。

ARGs已经成为一类新型的环境污染物，现有技术对该类污染的控制策略不多。对施用到土壤中的粪肥或污泥主要进行好氧堆肥或者厌氧消化处理，以期从源头上减少ARGs。然而，对于已经进入土壤乃至积累多代的ARGs，只能通过添加土壤改良剂来进行削减。目前的土壤改良剂种类较少，且并不是所有的土壤改良剂都具有削减ARGs污染的正面效果。因此，针对日益严重的土壤ARGs污染的问题，亟需开发更多高效环保的土壤改良剂用于削减土壤ARGs污染。

木醋液是在生物质材料制备生物炭过程中产生的烟气经冷凝回流和再分离得到的有机混合物。该木醋液能够中和环境污染中的氨气、硫化氢等有害气体。然而，单纯冷却回收后得到的是粗木醋液，是棕黑色的液体。其含有大量焦油及有害物质，其能否直接用于农业污染处理，能否削减土壤中ARGs的污染并保证正面效果，是现有技术中所未涉及的。

发明内容

本发明是为了解决上述现有技术中土壤积蓄的抗生素抗性基因难于削减等问题，本发明的目的在于提供了一种采用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法以及该方法在农业土壤抗性基因污染削减中的应用，采用木醋液为主要原料，通过精制改性；在使用后能够降低根际和非根际土壤总ARGs的绝对丰度，并且各精制组分具有明显选择性。

本发明提供一种采用木醋液对抗生素抗性基因污染的削减方法，所用木醋液制备包括如下步骤：

1)厌氧慢速热解法制备木醋原液：将植物原料干燥至恒重，采用热解炭化炉热解植物原料制备木醋液，热解温度350℃-550℃，热解时间3h-6h，热解过程中所产生的气体经过冷凝，得到棕黑色且有刺鼻性气味的液体，然后在黑暗中静置3-6个月，取中间液体过微孔滤膜，即得木醋原液WV；

2)常压蒸馏法精制木醋原液：常压状态下，分别设置(0-98)℃，(98-130)℃，(130-220)℃三个温度段，加热蒸馏装置，采集不同温度段的产物，得到精馏组分分别为低温度段(0℃-98℃)精馏组分F1，中间温度段(98℃-130℃)精馏组分F2和高温度段(130℃-220℃)精馏组分F3。

优选的，所述植物原料为谷壳、秸秆、木屑、硬木和竹木中的至少一种。

进一步，将木醋原液以及精制所得精馏组分分别施用于菌液培养基中，测定各类木醋液的抑菌性，按如下公式计算抑菌率：

抑菌率(％)＝(处理组抑菌圈直径–对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100％。

优选地，将木醋原液WV及其精馏组分通过高效气相色谱-质谱联用测定进行组分分析，然后用每个峰谱的面积除以所有峰的总面积获得相对丰度面积计算每种物质的相对含量。

进一步，有机酸和酚类总含量为(50-85)wt％；木醋原液WV中，有机酸含量为(30-50)wt％，酚类含量为(30-50)wt％；精馏组分F1中，有机酸含量为(25-30)wt％，酚类含量为(20-27)wt％；精馏组分F2中，有机酸含量为(50-65)wt％，酚类含量为(15-25)wt％；精馏组分F3中，有机酸含量为(65-80)wt％，酚类含量为(8-15)wt％。

本发明同时提供一种上述削减方法在抗生素抗性基因污染土壤中的应用，具体的，将木醋原液WV、精馏组分F1、精馏组分F2和精馏组分F3中的至少一种作为土壤改良剂施用于抗生素抗性基因污染土壤中。

优选的，应用的实验方法包括：

①以蔬菜作为受试植物，将木醋原液WV及其精馏组分F1-F3按比例添加至盆栽土壤，培养65d后采集根际和非根际土壤，②通过测定不同处理组根际和非根际土壤ARGs和可移动遗传原件(MGEs)丰度，分析ARGs和MGEs之间的相关性，③比较木醋原液WV添加下根际和非根际土壤ARGs变化的差异性，④得出WV及其精馏组分对土壤ARGs的削减评价。

更优选的，在步骤①中，木醋原液WV及其精馏组分F1-F3添加比例为木醋原液WV(140-180)μL kg-1，精馏组分F1(100-120)μL kg-1，精馏组分F2(120-130)μL kg-1，精馏组分F3(10-30)μL kg-1的比例，稀释(200-500)倍后添加至土壤；且按播种前、播种后15d和播种后30d分别按比例添加三次。

更优选的，在步骤①中，采用根际袋区分根际和非根际土壤，步骤如下：用60目尼龙筛娟制作直径10cm、高9cm的一端开口圆柱状袋子作为根际袋，装风干土壤约500g放入花盆中，再将剩余的土壤装盆，保持根际袋的土壤与花盆土壤高度一致。

优选的，采用木醋原液WV和精馏组分F3降低根际和非根际土壤总ARGs的绝对丰度。

更优选的，ARGs绝对丰度的计算公式为：

式中，C0表示质粒DNA的浓度，单位ng/μL；X表示目的基因的片段长度，单位bp。

优选的，应用木醋原液WV及其精馏组分F2、F3，处理降低磺胺类、氨基糖苷类和大环内酯类ARGs，在根际和非根际土壤中的绝对丰度；应用木醋原液WV及其精馏组分F1、F2，处理降低tetO类ARGs，在根际和非根际土壤中的绝对丰度；应用木醋原液WV及其精馏组分F3，处理去除根际和非根际土壤的MGEs。

进一步，总ARGs优选具体包括tetO，sul1，sul2，ermF,ermB，aadA5和strA；MGEs优选包括intI1和Tn916/1545。

本发明所带来的综合效果包括：

①所用木醋液中含有大量酚类和有机酸类化合物，能够抑制病源微生物繁殖与活性；添加高浓度木醋液时，酚类和有机酸类化合物数量多，对微生物的毒害抑制强，选择性抑制微生物的繁殖和生物活性，从而削减特异性抗生素抗性基因。②本发明木醋原液及特定精馏组分能够降低总ARGs绝对丰度，且各精馏组分的削减应用具有明显选择性，为人工选择性去除特定环境中的特定抗性基因提供条件，进一步避免超抗细菌的产生。③公开了木醋原液及其精馏组分对应基因选择性应用及其初步原理，为人工合成或组配非天然木醋抗性基因削减剂及其工业化生产打下基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

在附图中：

图1是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法的木醋原液WV及其精馏组分F1-F3的溶液图片；

图2是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法的木醋原液WV及其精馏组分F1-F3的pH(a)和密度(b)；

图3是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法的木醋原液WV及其精馏组分F1-F3的FTIR图谱；

图4是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法的木醋原液WV及其精馏组分F1-F3对大肠杆菌NK5449抑菌效果图，其中(a)100％WV-3.75％WV；(b)100％F1-3.75％F1；(c)100％F2-3.75％F2；(d)100％F3-3.75％F3；

图5是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法的木醋原液WV及其精馏组分F1-F3对大肠杆菌HB101抑菌效果图，其中(a)100％WV-3.75％WV；(b)100％F1-3.75％F1；(c)100％F2-3.75％F2；(d)100％F3-3.75％F3；

图6是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法的木醋原液WV及其精馏组分F1-F3对大肠杆菌NK5449(a)和HB101(b)抑菌率。

图7是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法，在抗生素抗性基因污染土壤中的应用中，木醋原液WV及其精馏组分F1-F3对根际土壤(a)和非根际土壤(b)总ARGs绝对丰度(单位copies g-1)的影响；

图8是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法，在抗生素抗性基因污染土壤中的应用中，木醋原液WV及其精馏组分F1-F3对土壤各ARGs绝对丰度(单位copies g-1)的影响，其中ARGs依次为sul1，sul2，ermF,ermB，aadA5，strA和tetO；

图9是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法，在抗生素抗性基因污染土壤中的应用中，木醋原液WV及其精馏组分F1-F3对土壤MGEs绝对丰度(单位copies g-1)的影响。

图10是本发明实施例1利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因污染的削减方法，及其在抗生素抗性基因污染土壤中的应用的技术路线框图。

具体实施方式

HGT主要包括三种途径：转化(Transformation)、转导(Transduction)和接合(Conjugation)。转化是指存在于环境中的外源DNA片段被微生物吸收，通过同源重组或者异常重组整合进入微生物基因组。转导是噬菌体将DNA注入细菌细胞，与受体细胞DNA结合的过程。接合是一个质粒或一个编码抗性的可移动遗传元件(Mobile Gene Elements，MGEs)在细胞间转移。MGEs携带ARGs的转导或接合是本发明所针对土壤中HGT的主要削减过程。MGEs包括质粒(Plasmid)、转座子(Transposons)、整合子(Integron),以及可进行转导的噬菌体等。质粒是一类可自我复制的、双链的染色体外遗传元件，一般是编码非必须功能的辅助基因，可以赋予宿主一些特性，增强其对不利条件的适应性。

木醋液(Wood Vinegar，WV)作为生物炭制备过程中的一种副产物，因具有促进植物生长、抑菌、除草、防腐等多种作用，被广泛用作土壤改良剂。然而，WV能否削减土壤中ARGs的污染，及其具体机制，现有技术中尚不明确。因此，如图1所示，本发明以废弃木材为原料制备WV，采用常压蒸馏法精制获得3种不同的精馏组分(F1、F2和F3)，对比分析比较WV及其精馏组分的物理化学性质差异，具体通过应用于污染土壤的盆栽实验说明其对土壤中典型ARGs和可移动遗传元件丰度的影响，利用微生物群落结构和土壤理化性质与ARGs种类和丰度之间的关系与作用机制，应用于WV及其精馏组分削减土壤ARGs污染。本发明有助于扩展WV在农业方面的应用，为建立基于WV的土壤ARGs阻控技术打下基础。

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步解释说明，但应理解，本发明的范围不限于此。

实施例1-4

一种采用木醋液对抗生素抗性基因污染的削减方法，所用木醋液制备包括如下步骤：

1)厌氧慢速热解法制备木醋原液：将植物原料干燥至恒重，采用热解炭化炉热解植物原料制备木醋液，热解温度450℃，热解时间6h，热解过程中所产生的气体经过冷凝，得到棕黑色且有刺鼻性气味的液体，然后在黑暗中静置6个月，取中间液体过0.22μm微孔滤膜，即得木醋原液WV；

2)常压蒸馏法精制木醋原液：常压状态下，分别设置(0-98)℃，(98-130)℃和(130-220)℃三个温度段，加热蒸馏装置，采集不同温度段的产物，得到精馏组分分别为低温度段(0-98℃)精馏组分F1，中间温度段(98-130℃)精馏组分F2和高温度段(130-220℃)精馏组分F3。

将得到的木醋原液WV、精馏组分F1、精馏组分F2和精馏组分F3分别作为本发明实施例1、实施例2、实施例3和实施例4进行性质表征。

木醋原液及其精馏组分F1-F3性质表征：

通过测定WV及其精馏组分的pH、密度、表面官能团及化学组成，分析WV精制前后的性质变化，具体的测定方法如下：

(1)pH：用pH计(AB150，Thermo Fisher Scientific，美国)直接测定。

(2)密度：比重瓶法测定。分别称取1mL容量瓶的原重(M1)和加入WV或精馏组分样品后重量(M2)，前后质量M1和M2的差值(等于样品的质量)除以容量的体积就即为样品密度。

(3)ATR-FTIR光谱：使用傅里叶红外光谱仪(Tensor 27，Bruker，德国)测定。用移液枪将WV或其精馏组分(10μL)均匀涂布在ATR晶片上，晾干后开始扫描。仪器参数：扫描区域4000-500cm-1，50次扫描，分辨率4cm-1。

将木醋原液以及精制所得精馏组分分别施用于菌液培养基中，测定各类木醋液的抑菌性，按如下公式计算抑菌率：

抑菌率(％)＝(处理组抑菌圈直径–对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100％。

供试菌种：大肠杆菌HB101(E.coli HB101)和大肠杆菌NK5449(E.coli NK5449)，是目前广泛商用的一对用于接合转移研究的供受体菌，本实施例菌株购自上海唯地生物技术有限公司。保存于-80℃冰箱，使用之前将其转移至新鲜培养基活化，备用。

各类木醋液的检测结果及性质如下：

WV及其精馏组分的表观形态如图1所示。WV是深棕色液体，透光度较低；精馏组分F1、F2及F3是黄棕色液体，比较澄清；并且随着精馏温度升高，精馏组分颜色逐渐加深，由浅黄色变为浅棕色。此外，WV烟熏味较浓，精制后烟熏味减弱。主要因为蒸馏去除了WV中部分杂质及焦油等油性组分。

pH是评价WV的重要指标，可以直观判断其酸碱性。如图2(a)所示，WV的pH是2.81，精馏组分F1-F3的pH在1.81-2.36之间，WV及其精馏组分都呈强酸性，精馏组分的pH显著低于WV，F3的pH最低。这是由于WV是一种不稳定的有机混合物，富含有机酸和酚类物质，随着温度升高，WV中水分含量减少，有机酸组分逐渐分离出来。

WV及精馏组分的密度如图2(b)所示。WV的密度是1.08g mL-1、精馏组分F1、F2和F3密度分别是0.99g mL-1、1.06g mL-1和1.05g mL-1，精馏组分的密度都显著低于WV。此外，除F1外，WV和F2、F3的密度均比水的密度大，因为WV中的焦油等组分密度较大，精制后部分焦油去除以及部分大分子物质的分解导致精馏组分密度降低，而0-98℃蒸馏出来的多是水和一些小分子物质，所以F2的密度最小。

WV及其精馏组分的ATR-FTIR图谱如图3所示。可以看出，WV含有丰富的含氧官能团和碳碳双键以及芳香基，主要的吸收峰位置是：3359cm-1(O-H)、1665cm-1(酯基C＝O)、1380-1270cm-1(C-O/C-O-C，C＝C)，1088-1014cm-1(脂肪族C-O/C-O-C)，604cm-1(芳香族C-H)。这些结果表明WV含有有机酸、醇、酚及芳香族化合物。此外，相比WV，F1-F3精馏组分的官能团基本没有变化，表明精制前后WV化合物种类并没有明显变化。

木醋原液及其精馏组分F1-F3的全组份分析

WV及其精馏组分按GC-MS测定进行组分分析，然后用每个峰谱的面积除以所有峰的总面积获得相对丰度面积计算每种物质的相对含量。

化学组分分析方法：使用二氯甲烷萃取浓缩后用高效气相色谱-质谱联用(GCMS，岛津，日本)测定，具体方法如下：取2mL的WV，加入等体积的二氯甲烷，涡旋10min，静置10min，分别收集有机相和剩余水相。此过程重复四次，收集四次取得的有机相，剩余水相用PPL柱子浓缩富集，10mL二氯甲烷洗脱。将水相洗脱液和上述萃取得到的有机相混合后，用旋转蒸发仪浓缩到2mL，再氮吹至近干，用二氯甲烷转移至进样小瓶，定容到1mL。色谱升温条件为：50℃恒温3min，4℃/min升温至200℃，然后200℃恒温10min。质谱仪配备有70eV电离能的电子轰击源，离子源温度为250℃，设定为0.71s内从45至500Da扫描。载气为氦气，流速：1mL/min。进样体积为1μL，分流比为80:1。

表1 WV及其精馏组分中主要组分的相对含量

注：“nd”表示未检出。

WV及其精馏组分中主要组分的相对含量如表1所示。WV和组分F1、F2、F3分别检测出41、35、41、43种化合物，主要由有机酸、酚类、酮类、呋喃类、芳香醚类、醛类、酯类、醇类和糖类等9种化合物组成，主要官能团是甲氧基，羟基和羰基。其中，有机酸和酚类52.6％-81.8％是主要组分。然而，与现有技术相比，每种组分的相对丰度不尽不同，这取决于制备原料和条件。有机酸和酚类是木醋液抑菌的有效组分。和木醋原液WV相比，精馏组分F1的有机酸含量下降，而F2和F3的有机酸含量均有明显升高。对于酚类物质，精馏组分的含量均有所下降。有机酸和酚类总丰度的变化是F3>WV>F2>F1，因此组分F3有较好的抑菌性。此外，精馏组分F3的呋喃类物质含量较低，有更高的安全性。

木醋原液WV及其精馏组分F1-F3的抑菌性能

木醋原液WV及其精馏组分对大肠杆菌HB101和大肠杆菌NK5449的抑菌效果图如图4-2-5所示。从图中可以看出，WV及其精馏组分对大肠杆菌NK5449H和HB101的生长均有抑制作用，且抑菌圈直径随着WV及精馏组分的浓度降低而减小。WV及其精馏组分对两种大肠杆菌的抑菌率如图6所示。随WV和精馏组分浓度的增加，大肠杆菌NK5449H和HB101抑菌率均不断增加，抑菌效果逐渐增强。对于大肠杆菌NK5449来说，抑菌效果：WV>F3>F2>F1；且WV及精馏组分浓度为100％和50％时的抑菌率显著高于其它浓度，100％WV和100％F3的抑菌率分别高达45.9％和43.1％。对于大肠杆菌HB101来说，抑菌效果：F3>WV>F2>F1；类似地，WV及精馏组分浓度大于25.0％时抑菌率显著升高，100％WV和100％F3的抑菌率分别高达46.8％和50.3％。

综上，木醋原液WV和精馏组分F3的抑菌效果最佳。并且，WV中有机酸和酚类物质对病原菌和真菌有抑制作用。GC-MS结果显示，WV及精馏组分中52％以上为有机酸和酚类化合物，其中2个主要成分：2,6-二甲氧基苯酚和2-甲氧基苯酚具有抗菌活性。因此，WV及其精馏组分的抑菌性是由酚类物质和有机酸共同作用的结果。

实施例5-8

本系列实施例采用实施例1-4削减方法所得木醋原液WV及其精馏组分F1-F3，说明其在抗生素抗性基因污染土壤中的应用，应用方法包括：

①以油菜(Brassica napus L.)作为受试植物，将木醋原液WV及其精馏组分F1-F3按比例添加至盆栽土壤，培养65d后采集根际和非根际土壤，②通过测定不同处理组根际和非根际土壤ARGs和MGEs丰度，分析ARGs和MGEs之间的相关性，比较木醋原液WV添加下根际和非根际土壤ARGs变化的差异性，得出WV及其精馏组分对土壤ARGs的削减评价。

供试土壤：实验用土于2017年8月在山东即墨市段泊岚镇元晓养猪场(120.35°E,36.60°N)采集。该养殖场建厂已有15年，现有猪100头。猪粪通常用于沼气池厌氧发酵、露天堆放或者直接施用于周边土壤。采集的是地面0-20cm的表层土壤，多点混合采样后混匀，风干过2mm筛备用。

土壤的基本化学性质如下：pH值6.68，最大持水量42.3％，有机碳(SOC)含量22.6gkg-1，有效磷(AP)含量1.65g kg-1，有效氮(AN)含量21.1μg g-1，有效锌(AZn)0.42g kg-1，有效铜(ACu)48mg kg-1,有效铅(APb)169mg kg-1。

供试植物：供试植物为油菜(Brassica napus L.)，是一种原产于我国的十字花科植物，主要分布在安徽、河南、四川等地。营养丰富，维生素C含量高，是人们经常食用的蔬菜之一。油菜种子购买于山东省青岛市富鑫农种子店。

盆栽实验：采用直径12.5cm，高16.5cm的树脂塑料花盆，每盆装入3kg土壤。为了研究根际分泌物对土壤ARGs丰度的影响，采用根际袋区分根际和非根际土壤。具体步骤如下：

用60目的尼龙筛娟制作直径10cm、高9cm的一端开口圆柱状袋子作为根际袋，装风干土壤约500g放入花盆中，再将剩余的土壤装盆，保持根际袋的土壤与花盆土壤高度一致。然后将WV及其精馏组分以WV 167μL kg-1，精馏组分F1 113μL kg-1，精馏组分F2 123μL kg-1，精馏组分F3 13.3μL kg-1的比例，稀释300倍后添加至土壤，分别记为处理组WV、F1、F2和F3，对照组不添加任何木醋液成分记为CK。静置72h后播种油菜。采用穴播的方式，每盆播种3粒种子。播种油菜后的15d和30d再分别按上述比例分组添加WV或精馏组分F1-F3。每个处理设置5个重复。实验采用称重法浇水，土壤含水量为60wt％的田间最大持水量。定期改变盆栽摆放位置，尽量减小光照带来的系统误差。

样品采集：培养65d后采集植物和土壤样品。油菜分为根上部和根下部分别采集，测其鲜重。土壤样品分为根际土和非根际土分别采集，根际土为根际袋内黏附于油菜根部的土壤，非根际土为根际袋外远离根系的花盆土壤。采集的土壤一部分保存于灭菌离心管中于-20℃冰箱保存，用于测定土壤ARGs丰度和微生物群落结构；一部分土壤样品风干后置于自封袋中密封保存，用于测定土壤理化性质。

本实施例采用常规DNA提取及定量PCR测定技术进行实施，目标基因引物信息如表2所示，具体方法步骤如下：

DNA提取：DNA采用PowerSoil DNA提取试剂盒(Mobio,美国)提取，具体操作参照试剂盒说明书。提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳完成后用凝胶成像系统(AzureBiosystems C150，美国)观察电泳条带，DNA条带应满足条带单一，无拖尾。之后用超微量分光光度计(Colibri，中国山东)检测DNA的浓度和纯度。纯净的DNA样品A260/A280在1.8-2.0。比值低于1.8，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响；比值高于2.0，表明有RNA污染。

标准曲线构建：首先用普通PCR仪(analytikjena，德国)将目的ARGs和MGEs进行扩增。反应体系共20μL，包括：2×EasyTaq PCR SuperMix(TransGen Biotech，北京)10μL、10μM正、反向引物(上海生工，中国)各1μL、模板DNA 2μL、灭菌的超纯水6μL。得到的扩增产物用1％琼脂糖进行凝胶电泳(110V，30min)，之后用凝胶成像系统(Azure Biosystems C150，美国)观测目的基因位置，将目的片段切胶回收并进行纯化(TransGen Biotech，北京)，测定胶回收产物的浓度。

随后将目的基因片段连接到pEASY-T1(TransGen Biotech，北京)载体上，将其导入Trans1-T1感受态细胞，将感受态细胞涂布在含X-gal和IPTG的LB固体培养基上。随后挑取白色单克隆接种于含氨苄(10mg mL-1)的LB液体培养基，并在LB固体平板上划线保存。LB液体培养基37℃培养6-12h，将菌液送至公司(生工生物，上海)进行测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，确定选取的克隆子包含目的片段。然后用质粒提取试剂盒(TransGenBiotech，北京)提取质粒，超微量分光光度计(Colibri，中国山东)检测质粒的浓度和纯度。将质粒按10倍梯度稀释一系列浓度做标准曲线。标准曲线扩增效率满足90％-110％。

ARGs定量检测：选取土壤中常见的7种ARGs分别为tetO，sul1，sul2，ermF,ermB，aadA5和strA，2种MGEs分别为intI1和Tn916/1545，用实时定量PCR仪(Appliedbiosysterms，美国)进行定量检测。目标基因的引物信息见表2。反应体系共20μL，包括：10μL qPCR SuperMix(TransGen Biotech，北京)、2μL DNA模板、0.5μL的正、反向引物(10μM，生工生物，中国)、7μL灭菌超纯水，均为商业购得。此外，通过溶解曲线条件检查是否有非特异性扩增。

表2目标基因引物信息

木醋原液及其精馏组分对土壤ARGs丰度的影响

木醋原液WV及其精馏组分处理下土壤总ARGs的丰度变化如图7所示。对照组根际和非根际土壤总ARGs的绝对丰度分别为1.14×108和7.29×107copies g-1，各种ARGs的绝对丰度介于105-107copies g-1。相对丰度最高的两种ARGs是sul1和ermF，F3处理组中这两种基因分别在根际和非根际土壤总ARGs中占60.8％和56.0％，在WV及F1、F2处理组中，这两种基因的占比更是高达88.0％以上。

与对照组相比，WV及F2、F3处理均降低了根际土壤总ARGs的丰度，F3的削减效果最好，根际土壤总ARGs的去除率达到83.8％；其次是WV,处理后根际土壤总ARGs的丰度下降了75.5％；F2对根际土壤总ARGs的削减效果最弱，去除率为50.5％。而添加F1后根际土壤总ARGs的丰度增加了25.5％，这和F1添加后大部分ARGs(sul1,sul2,ermF,ermB,aadA5,andstrA)丰度增加有关。

不同处理组非根际土壤总ARGs的变化趋势与根际土壤相同，F1处理组总ARGs增加了50.4％，WV及F2、F3处理均降低了非根际土壤总ARGs的丰度，去除效果是F3(79.7％)>WV(65.3％)>F2(19.2％)。

综上，WV和F3均对根际和非根际土壤总ARGs有较好的削减效果(去除率>65％)，这与上述抑菌性数据一致，因此，WV及F3使得土壤中ARGs潜在宿主细菌减少是ARGs丰度减少的部分原因。而特定温度范围的精馏组分由于不影响部分宿主细菌生存，使该类菌群对应ARGs丰度增加。

具体地，磺胺类、氨基糖苷类和大环内酯类ARGs受WV及其精馏组分影响的变化趋势与总ARGs相似。WV及F2、F3处理显著降低了这三类ARGs在根际和非根际土壤中的绝对丰度(F2处理组根际和非根际土壤ermF的绝对含量分别增加了19.8％和2.56％，非根际土壤strA的绝对含量增加了36.8％)，而精馏组分F1处理后根际和非根际土壤中ARGs的绝对丰度显著增加(F1处理组根际土壤ermB的绝对含量降低了39.2％)。

WV及其精馏组分对tetO的作用效果与其他6种ARGs不同。WV及F1、F2处理均显著降低了根际土壤中tetO的绝对丰度，去除率是WV(58.8％)>F2(55.5％)>F1(37.8％)，WV对根际土壤tetO的削减效果最好。对于非根际土壤，仅WV和F2处理降低了其tetO的绝对丰度，且去除率分别只有2.27％和14.4％，表明WV和F2对根际土壤tetO的削减效果更佳。

此外，F3处理组根际和非根际土壤tetO的丰度均显著增加，这可能是因为组分F3的酸性最强，在添加初期降低了土壤pH，进而影响土壤微生物群落。四环素类ARGs(tetO、tetC、tetQ、tetX)的丰度在酸性条件下增加，这是由于酸性pH有利于变形菌门(Proteobacteria)、Caldiserica和厚壁菌门(Firmicutes)等携带四环素抗性的细菌的繁殖，而F3处理组土壤变形菌门的丰度增加导致了潜在宿主的增多。

木醋液及其精馏组分对土壤中MGEs丰度的影响

WV及其精馏组分对土壤中MGEs丰度的影响如图9所示。对照组intI1和Tn916/1545在根际和非根际土壤中的绝对丰度分别是3.84×107、2.63×107、5.70×107、3.75×107copiesg-1，根际土壤MGEs含量更高，表明根际是基因HGT的热点，是因为根系分泌物增加了一些细菌的相对丰度和代谢活性，并且通常植物根部附近的细胞密度更高。添加WV及其精馏组分后，根际和非根际土壤intI1的绝对丰度分别降低了32.6％-72.1％和6.19％-68.8％，F1对intI1的削减效果最差。类似地，WV及其精馏组分处理降低了根际和非根际土壤Tn916/1545的绝对丰度，根际和非根际土壤的去除率分别是28.2％-71.2％和7.06％-47.9％。其中，F1的去除率最低，F3次之。综上，WV及其精馏组分可有效去除土壤中MGEs

故而，本实施方式中的优选ARGs削减方案为：应用木醋原液WV及其精馏组分F2、F3，处理降低磺胺类、氨基糖苷类和大环内酯类ARGs，在根际和非根际土壤中的绝对丰度；应用木醋原液WV及其精馏组分F1、F2，处理降低tetO类ARGs，在根际和非根际土壤中的绝对丰度；应用木醋原液WV及其精馏组分F3，处理去除根际和非根际土壤的MGEs。

ARGs与MGEs的相关性分析

ARGs在环境微生物群落中的HGT是农业土壤中ATs抗性传播的重要途径。因在长期镍污染的农业土壤中ARGs丰度和MGEs丰度显著相关，进而镍污染土壤ARGs增加可能是由于镍污染导致土壤ARGs的HGT频率增加。如表3-1所示，Spearman相关分析表明，intI1丰度和磺胺类、大环内酯类以及氨基糖苷类ARGs丰度之间有显著正相关关系(r＝0.783-0.864，P<0.01)，Tn916/1545的丰度和这几种ARGs丰度之间也有正相关关系，但是相关性较低(r＝0.572-0.810，P<0.01)，这是因为MGEs中intI1的占比较高(80％以上)，而Tn916/1545的丰度较低。此外，两种MGEs均未检测到和四环素类ARGs(tetO)的相关关系(P>0.05)，但是由于tetO在总ARGs中的相对丰度较低，所以MGEs和总ARGs之间也有显著相关性(r＝0.810，P<0.01)，表明土壤ARGs与MGEs有显著相关关系。因此，ARGs借助质粒、转座子等MGEs，通过HGT导致使土壤细菌之间抗性交换与扩散。然而，土壤ARGs的HGT频率受许多非生物因素影响(例如，温度、土壤pH值、养分、土壤类型等)和生物因素的影响，它们与MGEs一起决定了复杂土壤环境中HGT的实际频率。

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。

一种利用木醋液对土壤中抗生素抗性基因的削减方法及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。