专利摘要

本发明克隆表达并公开了一种来源于假单胞菌的单加氧酶PMO-6814及其应用。具体涉及从假单胞菌基因组中克隆单加氧酶PMO-6814的编码基因，并构建表达载体导入大肠杆菌内，得到的一种具有单加氧酶活性的基因工程菌。该单加氧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示，相应的编码基因核苷酸序列如SEQ？ID？No.2所示。该酶蛋白重组表达后能有效催化硫醚底物生成亚砜，具有较高的转化效率和立体异构对映选择性，可用于手性亚砜类药物的生物合成。

权利要求

1.一种蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质：

1）由序列表中的SEQ ID No.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2）将序列表中的SEQ ID No.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有硫醚单加氧酶功能的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为具有硫醚单加氧酶功能的蛋白质。

3.权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1)、或2）所示：

1）序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列；

2）与序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列具有90%以上的同源性；且编码的蛋白具有硫醚单加氧酶功能的核苷酸序列。

5.含有权利要求3所述的编码基因的重组表达载体、或含该重组表达载体的基因工程菌。

6.含有权利要求4所述的编码基因的重组表达载体、或含该重组表达载体的基因工程菌。

7.权利要求1所述的蛋白及其编码基因在手性亚砜类药物制备中的应用。

说明书

技术领域

一般地，本发明涉及生物催化与生物合成和分子生物学领域。具体地，本发明涉及在生物催化与生物合成领域应用单加氧酶基因进行手性药物的合成。本发明还涉及单加氧酶基因克隆及重组蛋白表达的方法。

背景技术

手性亚砜类化合物是许多药物如抗肿瘤药Ustiloxin A、抗消炎药舒林酸，治疗胃溃疡药奥美拉唑，抗菌素司帕索霉素等合成过程中的关键中间体，在药物合成中有非常广泛的应用。目前，除了一些过渡金属催化剂如钛、钒能有效催化硫醚底物的不对称氧化反应生成手性亚砜外，大多数化学催化剂在催化反应中还存在过度氧化、副产物多和反应条件苛刻等不足，且这些化学催化反应体系通常使用重金属催化剂和过氧酸及双氧水等强氧化剂，不利于环境保护和可持续性发展的需求。而生物酶催化硫醚底物的不对称氧化反应可以直接形成手性中心，是合成手性亚砜类化合物最方便直接的技术手段。另外，通过酶催化硫醚底物氧化合成手性亚砜类化合物，还具有选择性高、环境友好等特点。鉴于此，生物催化的硫醚不对称氧化反应可望发展成为工业化绿色制备手性亚砜类药物的新型生物制造技术。但是，现有研究表明，具有高活性，高对映选择性和高底物耐受性的硫醚单加氧酶还十分匮乏。无论是利用分离后的单加氧酶、产硫醚单加氧酶菌株，还是重组表达硫醚单加氧酶的基因工程菌，催化效率都很低，无法满足绿色工业化生产的需求。因此，本发明的目的是筛选和获得高活性单加氧酶用于手性亚砜类化合物的生物合成。

发明内容

本发明的目的是提供一种单加氧酶及其在手性亚砜类化合物生物合成中的应用。

本发明所提供的单加氧酶，来源于假单胞菌属Pseudomonas monteilii CCTCC M2013683菌株，命名为PMO-3546，是如下1）或2）的蛋白质：

1）由序列表中序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

SEQ ID No.1、蛋白序列

MQTVEHEYKTIDPMALRRAFGTFVTGVTVVTTRDEQGSPRGMTANSFTSVSLDPALLLVCIGKGAASYPVFLQADSFAVNLLHEGQVALSNVFASKAPDKFDQVSHVAVHTGAPVLTDCLTWFDCTVHQCIDAGDHIILLGQVQAFGTSPEAPLGFCRGRYAQVKDPLPPGWLSASDMITGYLIESEGRLLLAEDGKGGWVLPTASRRLKDGRLPLSVGGELALLPDDTFLYSVFDTADNDPGYLIYRAKLAETLVEGALPPSLRFFALDQLPYSAIASHEIRAMLQRYARETERGSFGIYMDSQEGGRVAMVGSAQSWDKAY

2）将序列表中序列SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列SEQ ID No.1所示蛋白具有相同活性的由1）衍生的蛋白质。

序列表中的序列SEQ ID No.1由323个氨基酸残基组成。

为了便于序列SEQ ID No.1蛋白的纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述PMO-6814可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行重组表达得到。上述PMO-6814的编码基因可通过将序列表中序列SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述单加氧酶（PMO-6841）的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述单加氧酶（PMO-6841）编码基因的序列为如下1）或2）的DNA分子：

1）序列表中序列SEQ ID No.2所示的DNA分子；

SEQ ID No.2、基因组DNA序列

ATGCAGACCGTTGAACACGAATACAAGACGATAGACCCAATGGCCCTGCGCCGTGCCTTCGGTACGTTCGTCACCGGGGTAACCGTGGTCACAACCCGTGACGAGCAGGGCAGCCCAAGGGGCATGACGGCCAATTCGTTCACCTCCGTCTCTCTTGACCCGGCGTTGCTGCTGGTGTGCATTGGCAAGGGTGCAGCGAGCTATCCGGTGTTCCTGCAGGCCGACAGCTTTGCCGTCAACCTGCTGCACGAAGGGCAGGTCGCGCTTTCCAACGTCTTCGCCTCCAAAGCCCCCGACAAATTCGACCAGGTTAGCCACGTTGCGGTGCACACCGGGGCACCGGTGCTGACCGATTGCCTGACCTGGTTCGACTGCACGGTGCACCAGTGCATCGATGCTGGTGACCATATCATCCTGCTCGGTCAGGTCCAGGCGTTCGGTACCAGCCCCGAGGCGCCGTTGGGTTTCTGTCGCGGCCGCTATGCCCAGGTCAAGGACCCGCTGCCACCGGGCTGGCTCTCGGCGAGCGACATGATCACCGGCTACCTGATCGAATCCGAAGGGCGCTTGCTCCTGGCCGAGGATGGCAAGGGCGGCTGGGTGCTGCCGACCGCTTCGCGTCGACTCAAAGACGGCCGTCTGCCGCTGTCCGTGGGCGGCGAGTTGGCTCTGTTGCCCGATGACACCTTCCTCTATTCGGTGTTCGACACCGCCGATAACGACCCGGGTTATCTGATCTATCGCGCCAAACTGGCCGAAACGCTGGTGGAGGGCGCGCTGCCGCCGTCGCTGCGCTTCTTCGCCCTGGATCAGTTGCCCTACTCAGCCATCGCCTCCCACGAGATACGCGCCATGTTGCAACGCTATGCCCGTGAGACCGAGCGCGGCAGCTTTGGCATCTACATGGACTCCCAGGAGGGCGGGCGTGTCGCGATGGTCGGCAGCGCGCAGAGCTGGGACAAAGCCTACTGA

2）与序列表中序列SEQ ID No.2的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且编码蛋白具有硫醚单加氧酶功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全长为972个核苷酸，包含一个长度为972个核苷酸的开放阅读框（ORF，自序列2的第1-972位核苷酸序列），编码一个长度为323个氨基酸（序列表中序列1）、分子量约为35 KDa的蛋白，即为硫醚单加氧酶。

含有所述单加氧酶编码基因的重组表达载体、含该重组表达载体的基因工程菌均属于本发明的保护范围。

上述单加氧酶及其编码基因在制备手性亚砜类化合物中的应用也属于本发明的保护范围。

经实验表明，本发明的假单胞菌硫醚单加氧酶PMO-6814，能催化2mM浓度的苯甲硫醚转化为R构型的苯甲亚砜，转化率为8.5%，对映选择性为59%。

附图说明：

图1为单加氧酶基因扩增示意图；M：DNA分子量标志。

图2为单加氧酶基因表达载体酶切检测电泳图；M：DNA分子量标志；1-3为不同单克隆菌落重组质粒酶切检测电泳图谱。

图3为单加氧酶蛋白在基因工程菌表达电泳图；1：含重组质粒的基因工程菌诱导前蛋白表达图谱；2：含重组质粒的基因工程菌诱导后蛋白表达图谱。箭头所示为目标蛋白条带。

图4为含该单加氧酶蛋白的基因工程菌催化硫醚底物结果。

具体实施方式

我们从假单胞菌基因组中克隆了一个单加氧酶基因全长，构建表达载体导入了基因工程菌，并以基因工程菌为催化剂以硫醚为底物合成了手性亚砜。下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1. 单加氧酶编码基因的获得

分析假单胞菌菌株基因组序列，确定了一条长为972 bp的单加氧酶序列，设计一对特异性引物利用PCR技术进行扩增并最终获得了该基因全长编码框序列。具体方法如下：以提取的基因组DNA为模板，使用引物F：5’-actcGGATCCatgcagaccgttgaacacgaat-3’和R：5’-accgAAGCTT

gtaggctttgtcccagct-3’ 进行PCR扩增。PCR反应体系如下：2×TaqPCR Master Mix 12.5 ul 、基因组DNA 1 ul、上下游引物各0.5 ul、ddH2O 10.5 ul。PCR反应条件：95 ℃ 10 min； 98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s循环；72 ℃延伸10 min，30个循环。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。

实施例2. 单加氧酶基因表达载体构建

以pET32a(+)载体（购自Clonetech公司）为骨架，构建了单加氧酶基因pmo-6814的原核表达载体。具体方法如下：利用 DNA凝胶回收试剂盒回收pmo-6814的PCR产物，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对PCR产物及载体pET32a(+)进行双酶切，酶切回收的目的片段和载体。用T4 DNA连接酶，16 ℃连接4 h后，连接产物转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落摇菌并提取质粒，利用BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切检测。选取阳性重组质粒pET32a- pmo-6814进行DNA测序以确保序列准确。最后将测序准确的阳性重组质粒转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，甘油（终浓度为20%）保存于-80 ℃冰箱。

实施例3. 单加氧酶蛋白重组表达与检测

将保存于甘油中含pET32a- pmo-6814质粒的基因工程菌BL21(DE3)划平板活化后，挑单菌落于3 ml含相应抗生素的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h，次日以1%接种量转接于新鲜的含抗生素的50 mL LB液体培养基中，37 ℃ 250 rpm振荡培养OD600为0.6(约3h)，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，25 ℃ 160 rpm诱导培养8h。诱导结束后8000 rpm/min离心5 min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液中，超声波破碎菌体，15000 rpm离心5 min去细胞碎片，取上清与5x上样缓冲液混合后，于恒温金属浴中100 ℃加热5 min后作SDS-PAGE电泳分析。

实施例4. 含单加氧酶蛋白基因工程菌催化活性分析

将0.25g表达单加氧酶蛋白的基因工程菌加入5 mL的反应体系中，同时加入2 mM的苯甲硫醚，30 ℃，250 rpm振荡反应24 h，反应结束后加入5mL乙酸乙酯振荡终止反应，萃取反应的底物和产物，离心取上层有机相用无水硫酸钠干燥，取上清300 uL于样品瓶中，并加入同等体积的异丙醇，经HPLC分析，依据峰面积计算产物产率和光学纯度。使用高效液相色谱仪对苯甲亚砜进行手性分析，流动相正己烷/异丙醇（93:7，V/V），流速为0.7 ml/min，检测器波长为254 nm使用OD-H柱分析苯甲亚砜。

SEQ ID No.1、蛋白序列

Met Gln Thr Val Glu His Glu Tyr Lys Thr Ile Asp Pro Met Ala

Leu Arg Arg Ala Phe Gly Thr Phe Val Thr Gly Val Thr Val Val

Thr Thr Arg Asp Glu Gln Gly Ser Pro Arg Gly Met Thr Ala Asn

Ser Phe Thr Ser Val Ser Leu Asp Pro Ala Leu Leu Leu Val Cys

Ile Gly Lys Gly Ala Ala Ser Tyr Pro Val Phe Leu Gln Ala Asp

Ser Phe Ala Val Asn Leu Leu His Glu Gly Gln Val Ala Leu Ser

Asn Val Phe Ala Ser Lys Ala Pro Asp Lys Phe Asp Gln Val Ser

His Val Ala Val His Thr Gly Ala Pro Val Leu Thr Asp Cys Leu

Thr Trp Phe Asp Cys Thr Val His Gln Cys Ile Asp Ala Gly Asp

His Ile Ile Leu Leu Gly Gln Val Gln Ala Phe Gly Thr Ser Pro

Glu Ala Pro Leu Gly Phe Cys Arg Gly Arg Tyr Ala Gln Val Lys

Asp Pro Leu Pro Pro Gly Trp Leu Ser Ala Ser Asp Met Ile Thr

Gly Tyr Leu Ile Glu Ser Glu Gly Arg Leu Leu Leu Ala Glu Asp

Gly Lys Gly Gly Trp Val Leu Pro Thr Ala Ser Arg Arg Leu Lys

Asp Gly Arg Leu Pro Leu Ser Val Gly Gly Glu Leu Ala Leu Leu

Pro Asp Asp Thr Phe Leu Tyr Ser Val Phe Asp Thr Ala Asp Asn

Asp Pro Gly Tyr Leu Ile Tyr Arg Ala Lys Leu Ala Glu Thr Leu

Val Glu Gly Ala Leu Pro Pro Ser Leu Arg Phe Phe Ala Leu Asp

Gln Leu Pro Tyr Ser Ala Ile Ala Ser His Glu Ile Arg Ala Met

Leu Gln Arg Tyr Ala Arg Glu Thr Glu Arg Gly Ser Phe Gly Ile

Tyr Met Asp Ser Gln Glu Gly Gly Arg Val Ala Met Val Gly Ser

Ala Gln Ser Trp Asp Lys Ala Tyr

SEQ ID No.2、基因组DNA序列

ATGCAGACCGTTGAACACGAATACAAGACGATAGACCCAATGGCCCTGCGCCGTGCCTTCGGTACGTTCGTCACCGGGGTAACCGTGGTCACAACCCGTGACGAGCAGGGCAGCCCAAGGGGCATGACGGCCAATTCGTTCACCTCCGTCTCTCTTGACCCGGCGTTGCTGCTGGTGTGCATTGGCAAGGGTGCAGCGAGCTATCCGGTGTTCCTGCAGGCCGACAGCTTTGCCGTCAACCTGCTGCACGAAGGGCAGGTCGCGCTTTCCAACGTCTTCGCCTCCAAAGCCCCCGACAAATTCGACCAGGTTAGCCACGTTGCGGTGCACACCGGGGCACCGGTGCTGACCGATTGCCTGACCTGGTTCGACTGCACGGTGCACCAGTGCATCGATGCTGGTGACCATATCATCCTGCTCGGTCAGGTCCAGGCGTTCGGTACCAGCCCCGAGGCGCCGTTGGGTTTCTGTCGCGGCCGCTATGCCCAGGTCAAGGACCCGCTGCCACCGGGCTGGCTCTCGGCGAGCGACATGATCACCGGCTACCTGATCGAATCCGAAGGGCGCTTGCTCCTGGCCGAGGATGGCAAGGGCGGCTGGGTGCTGCCGACCGCTTCGCGTCGACTCAAAGACGGCCGTCTGCCGCTGTCCGTGGGCGGCGAGTTGGCTCTGTTGCCCGATGACACCTTCCTCTATTCGGTGTTCGACACCGCCGATAACGACCCGGGTTATCTGATCTATCGCGCCAAACTGGCCGAAACGCTGGTGGAGGGCGCGCTGCCGCCGTCGCTGCGCTTCTTCGCCCTGGATCAGTTGCCCTACTCAGCCATCGCCTCCCACGAGATACGCGCCATGTTGCAACGCTATGCCCGTGAGACCGAGCGCGGCAGCTTTGGCATCTACATGGACTCCCAGGAGGGCGGGCGTGTCGCGATGGTCGGCAGCGCGCAGAGCTGGGACAAAGCCTACTGA

一种源自假单胞菌的硫醚单加氧酶及其合成应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。