专利摘要

本发明公开了一种生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法。所述方法为以儿茶酚氧甲基转移酶为催化剂，以S-腺苷甲硫氨酸类似物为烃基供体，酶催化儿茶酚类化合物的烃基化，得到相应的产物。该方法具有反应条件温和，环境友好，操作简单，且兼具原料适应范围广，催化转化率高，化学及区域选择性好的优点。此外，通过添加固体酸催化剂可实现烃基化供体的循环再生。

权利要求

1.一种生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：反应的表达式如下：

烃基化的具体方法为，以SAM类似物为烃基供体，在溶液中，温度为10-40℃，反应1-72h，以生物催化剂催化儿茶酚类化合物酚羟基的烃基化，得到相应的产物；其中SAM类似物的用量与儿茶酚类化合物用量的物质的量的比为1：0.1-100，生物催化剂的用量与儿茶酚类化合物用量的物质的量的比为1：0.1-100。

2.按照权利要求1所述的生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：表达式中的R为C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含有杂原子的C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；或R为 其中R₂为C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含杂原子C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；

R₁为a)氢原子，b)卤素原子，c)羟基，d)羧基，e)氰基，f)氨基，g)硝基，h)醛基，i)C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，j)含杂原子的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，k)(C₁-C₁₀烷基)-CO基团，l)(环烷基)-C(O)–基团，m)(C₁-C₁₀烷基)-SO₂–基团，n)3到7元饱和环烃基，o)4到7元饱和杂环基。

3.按照权利要求2所述的生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：R中所述的杂原子为N、S或O；R₁中b)所述的卤素原子为氟、氯、溴或碘原子；j)所述的含杂原子的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基中的杂原子为N、S或O；l)所述的(环烷基)-C(O)–基团中环烷基为3到7元环；o)所述的4到7元饱和杂环基为包含-NH-、-O-或-S-作为环的成员并通过碳原子成键的基团。

4.按照权利要求1所述的生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：所述的SAM类似物的结构如下：

其中R为C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含有N，S或O的C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；或R为 其中R₂为C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含N，S或O的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基。

5.按照权利要求1所述的生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：所述的生物催化剂为纯化的儿茶酚氧甲基转移酶、含有儿茶酚氧甲基转移酶的细胞裂解液或二者的任意比混合物。

6.按照权利要求1所述的生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：所述的溶液的pH为5.5-8.5。

7.按照权利要求1所述的生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法，其特征在于：所述的SAM类似物可以通过在反应体系中添加固体酸催化剂和R-X原位再生；所述固体酸催化剂为SiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、ZnO、SiO₂-Al₂O₃、SiO₂-MgO、SiO₂-ZrO₂、B₂O₃-Al₂O₃、Cr₂O₃-Al₂O₃、ZrO₂-TiO₂、ZnO-TiO₂、MoO₃-Al₂O₃、MgO-B₂O₃、天然沸石、ZnCl₂、AlCl₃、MnSO₄、CuSO₄、十二钼磷酸、十钼二钒磷酸、十二钨磷酸中的一种或二种以上的混合物，固体酸催化剂用量为SAM类似物物质的量的0.1-3倍；

R-X中X为I、Br、o-CH₃-Ph-SO₃-、CF₃SO₃-、CH₃SO₃-；R为C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含有N，S或O的C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；或R为 其中R₂为C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含N，S或O的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；R-X用量为SAM类似物物质的量的1-30倍。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：在反应体系中添加固体酸催化剂和R-X时，需要同时添加有机溶剂以溶解R-X，有机溶剂为己烷、戊烷、石油醚、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或二种以上的混合物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物催化转化技术领域，具体涉及一种生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法。

背景技术

儿茶酚衍生物广泛存在于自然界中，具有抗氧化，抗衰老，消除有害自由基等作用。基于其母核酚羟基修饰的化合物也多被用于制备新型医药中间体及具有生物活性的天然产物。Li等人合成系列儿茶酚类烷基化产物用于流感病毒神经氨酸酶抑制剂的活性评价(J.Li,et al.Mar.Drugs 2011,9,1887-1901)； 等人合成糖基化的多巴胺用于潜在的抗帕金森药物研究(C. et al.Carbohydr.Res.2000,327,353-365)；Fumeaux等人基于3,4-二羟基苯甲醛酚羟基的多种修饰合成了24种潜在的人咖啡多酚代谢物(R.Fumeaux,et al.Org.Biomol.Chem.2010,8,5199-5211)。传统的化学烃基化方法(G.L.Plourde,et al.Molecules,2002,7,697-705；US19730427200)通常在强碱催化作用下与卤代烷烃反应，或将儿茶酚类化合物与醇、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯经光延反应生成(X.Wang,et al.Synlett 2010,19,2947-2949)。反应条件苛刻，环境不友好。当所需烃基化的儿茶酚类化合物含多个亲核基团时，反应均需考虑酚羟基以外亲核基团的选择性保护及脱保护，增大合成难度。儿茶酚类化合物含两个酚羟基，现有烃基化方法的区域选择性均依赖于酚羟基的酸性，偏好烃基化酸性较强的酚羟基，对酚羟基酸性无明显差异的儿茶酚类化合物无选择性。例如，在对以儿茶酚烃基化结构为研究的神经氨酸酶、儿茶酚氧甲基转移酶抑制剂的合成中，具有强吸电子基团的儿茶酚类化合物如3,4-二羟基苯甲酸甲酯的化学单烃基化产物以4-位酚羟基修饰为主，为合成3-位酚羟基取代产物，则需对反应物先进行双烃基化，随后借助Pd/C催化还原获得3-位烃基化修饰产物，而Pd/C的催化还原本身也具有一定选择性(M.Hayashida,et al.Chem.Pharm.Bull.2006,54,1299-1303)。儿茶酚类化合物选择性烃基化新方法的开发将为儿茶酚衍生物的合成及应用提供更广阔的发展空间。

生物催化具有反应条件温和、环境友好、选择性强等突出优点，是拓展和替代传统有机化学合成的重要方法。儿茶酚氧甲基转移酶(COMT，E.C.2.1.1.6)广泛存在于哺乳动物的多种组织中，以辅酶S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基化供体，可对儿茶酚类化合物酚羟基进行选择性甲基化修饰，释放等当量的副产物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。反应底物范围广，具有良好的化学及区域选择性，其区域选择性不依赖于底物结构化学性质。天然COMT催化儿茶酚类化合物甲基化偏好性生成间位取代产物，通过对COMT定向进化可调整其区域偏好性(J.Zhang,et al.J.Am.Chem.Soc.2011,133,17134-17137)。COMT可通过发酵方式批量制备，表达COMT的工程菌株也曾被开发用于生产食用香料香兰素(K.Li,et al.J.Am.Chem.Soc.1998,120,10545-10546)。良好的生物催化潜力激发我们开发并利用COMT的催化潜力于催化儿茶酚类化合物的烃基化。

对COMT的辅酶特异性进行拓展，以甲基取代的SAM类似物为烃基化供体，实现儿茶酚类酚羟基选择性烃基化。目前，相似的策略在小分子烷基化上报道仅有两例。利用来源于抗生素香豆霉素A1及新生霉素生物合成路径中的甲基转移酶Novo及CouO催化香豆素类化合物的付克烷基化(H.Stecher,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,9546-9548)；利用rebeccamycin生物合成路径中的甲基转移酶RebM催化rebeccamycin同系物羟基烷基化(S.Singh,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,3965-3969)。尽管专利(WO2013029075 A1；AT511856 A1)曾对这种烃基化方法进行报道，其权利要求烃基化对象为所有含亲核中心的小分子化合物，方法涉及元件包括烃基化的硫盐及SAM依赖的甲基转移酶含COMT—其权利要求范围广而不具体，无对应儿茶酚烃基化修饰适用对象，具体操作方法及对应实施案例。利用该方法制备烃基化产物需消耗化学当量的SAM类似物，如能实现SAM类似物的循环再生，则可使反应更具经济性及实用性，但目前还未见SAM类似物循环再生利用的报道。

本发明以SAM类似物为烃基化供体，利用COMT催化儿茶酚类化合物的烃基化，通过添加固体酸催化剂可实现SAM类似物的循环利用。这种酶催化儿茶酚类化合物烃基化的方法反应条件温和，环境友好，操作简单，原料适用范围广，烃基化供体可循环再生，催化转化率高，化学及区域选择性好，其区域选择性不依赖反应物酚羟基酸性，以间位取代产物为主。

发明内容

本发明的目的是提供一种具体的生物催化儿茶酚类化合物酚羟基烃基化的方法。反应式如下：

反应可直接获得单烃基化取代产物。当烃基化对象为 烃基化产物以间位修饰产物 为主，间位产物占总单烃基化产物的70-99.9％；当烃基化对象为 烃基化产物以间位修饰产物 为主，间位产物占总单烃基化产物的70-99.9％。

反应式中R₁为a)氢原子，b)卤素原子，c)羟基，d)羧基，e)氰基，f)氨基，g)硝基，h)醛基，i)C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，例如甲基、乙基、烯丙基等，j)含杂原子的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，例如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基等，k)低级酰基，l)环烷基羰基，m)低级烷基磺酰基，n)环烷基，o)杂环烷基；

R为C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含有杂原子的C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；或R为 其中R₂为C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含杂原子C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；

术语“杂原子”是指N，S或O原子；

术语“卤素原子”是指氟、氯、溴或碘原子；

术语“低级酰基”是指(C_1-10烷基)-CO基团，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基、异戊酰基等；

术语“环烷基羰基”是指(环烷基)-C(O)–基团，例如环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基、环己基羰基等；

术语“低级烷基磺酰基”是指(C_1-10烷基)-SO₂–基团，例如甲烷磺酰基、乙烷磺酰基、丁烷磺酰基、戊烷磺酰基、己烷磺酰基等；

术语“环烷基”是指3到7元饱和环烃类，例如环丙基、环丁基等；

术语“杂环烷基”是指4到7元饱和杂环基，所述杂环基包含-NH-、-O-或-S-作为环的成员并通过碳原子成键。例如四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡咯烷-2-基、哌啶-2-基等。

烃基化的具体方法为，以SAM类似物为烃基供体，在溶液中，温度为10-40℃，反应1-72h，以生物催化剂催化儿茶酚类化合物酚羟基的烃基化，得到相应的产物；其中SAM类似物的用量与儿茶酚类化合物的物质的量的比为1：0.1-100，生物催化剂的用量与儿茶酚类化合物的物质的量的比为1：0.1-100，溶液的pH为5.5-8.5。

所涉及的SAM类似物具有如下通式：

其中R为C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基如乙基、异丙基、烯丙基等，或含有N，S或O原子的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基如3-氯烯丙基、3-氨基烯丙基、C₄H₉OCH₂-、CF₃CH₂-、HOCH₂-等；

或R为 其中R₂为C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基如甲基、乙基、异丙基、烯丙基等，或含N，S或O原子的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基如3-氯烯丙基、3-氨基烯丙基、C₄H₉OCH₂-、CF₃CH₂-、HOCH₂-等；

其中，R为 时为优选烃基供体；R₃为H或C₁-C₉饱和或不饱和的直链或支链烃基如氢、甲基、乙基、异丙基、烯丙基等，或含有N，S或O原子的C₁-C₉饱和或不饱和的直链或支链烃基如羟基、氨基、3-氯烯丙基、3-氨基烯丙基、CH₃OCH₂-、CF₃CH₂-、HOCH₂-等。

所述的SAM类似物可以通过在反应体系中添加固体酸催化剂和R-X原位再生；所述固体酸催化剂为SiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、ZnO、SiO₂-Al₂O₃、SiO₂-MgO、SiO₂-ZrO₂、B₂O₃-Al₂O₃、Cr₂O₃-Al₂O₃、ZrO₂-TiO₂、ZnO-TiO₂、MoO₃-Al₂O₃、MgO-B₂O₃、天然沸石、ZnCl₂、AlCl₃、MnSO₄、CuSO₄、十二钼磷酸、十钼二钒磷酸、十二钨磷酸中的一种或二种以上的混合物，固体酸催化剂用量为SAM类似物物质的量的0.1-3倍；

R-X中-X为-I、-Br、o-CH₃-Ph-SO₃-、CF₃SO₃-、CH₃SO₃-，R为C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含有N，S或O的C₂-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；或R为 其中R₂为C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基，或含N，S或O的C₁-C₁₀饱和或不饱和的直链或支链烃基；R-X用量为SAM类似物物质的量的1-30倍。

在反应体系中添加固体酸催化剂和R-X时，需要同时添加有机溶剂以溶解R-X，有机溶剂为己烷、戊烷、石油醚、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或二种以上的混合物。

本发明的具体实施包括以下几个典型方案，概述如下：

A)将COMT纯蛋白，SAM类似物及儿茶酚类化合物，在pH5.5-8.5含有物质的量浓度为0-20mM镁的氯盐、硝酸盐、溴盐、硫酸盐或磷酸盐，0-10mM二硫苏糖醇，0-10mM乙二胺四乙酸二钠盐中的一种或二种以上的混合物和体积百分浓度为0-50％有机溶剂的水溶液中，10-40℃，恒温反应1-72h。加入等体积乙酸乙酯萃取3次，有机相柱层析分离纯化获得目标产物。

B)将含有COMT的细胞裂解液，SAM类似物及儿茶酚类化合物，在pH5.5-8.5含有物质的量浓度为0-20mM镁的氯盐、硝酸盐、溴盐、硫酸盐或磷酸盐，0-10mM二硫苏糖醇，0-10mM乙二胺四乙酸二钠盐中的一种或二种以上的混合物和体积百分浓度为0-50％有机溶剂的水溶液中，10-40℃，恒温反应1-72h。加入等体积乙酸乙酯萃取3次，有机相柱层析分离纯化获得目标产物。

C)将含有COMT纯蛋白和/或细胞裂解液，SAM类似物，儿茶酚类化合物，固体酸催化剂，R-X和体积百分浓度为0-50％的有机溶剂，在pH 5.5-8.5含有物质的量浓度为0-20mM镁的氯盐、硝酸盐、溴盐、硫酸盐或磷酸盐，0-10mM二硫苏糖醇，0-10mM乙二胺四乙酸二钠盐中的一种或二种以上的混合物和体积百分浓度为0-50％有机溶剂的水溶液中，10-40℃，恒温反应1-72h。加入等体积乙酸乙酯萃取3次，有机相层析柱分离纯化获得目标产物。

其中，COMT纯蛋白为商品化酶制剂。COMT纯蛋白也可参照文献(N.J.H.Cotton,et al.J.Biol.Chem.2004,279,23710-23718)构建重组表达COMT的菌株，再通过常规蛋白质纯化技术获得；

细胞裂解液来源于一种表达儿茶酚氧甲基转移酶的宿主，包括但不限于原核微生物如大肠杆菌、真核微生物如酿酒酵母、动物细胞株如中国仓鼠卵巢细胞或哺乳动物肾脏组织。

SAM类似物参照文献方法(Y.Zhang,et al.Chembiochem.2013,14,1438-1443)，以R-X为原料合成；

在实施方案C)中，利用添加固体催化剂及R-X，原位循环再生SAM类似物，具体反应原理如下：

利用COMT催化反应可生成等当量的SAH，在固体酸催化下可与R-X反应，原位合成SAM类似物。在中性或偏酸性反应体系中再生效果最佳，碱性及不添加固体酸催化剂不能实现SAM类似物的再生。

本发明特点在于是一种生物催化儿茶酚类化合物酚羟基单烃基化的方法，反应条件温和，具备良好的化学选择性及区域选择性；烃基化供体可再生，催化转化率高；

良好的化学选择性体现在当R₁含-NH₂、-OH、-COOH、-SH等一个或多个亲核反应官能团时，反应只针对儿茶酚母核酚羟基烃基化，生成单烃基化产物；

良好的区域选择性体现在反应产物结构以 或 为主，占总烃基化产物产量的65-99％，区域选择性与酚羟基的酸性无关；

催化转化率高体现在通过调节生物催化剂用量，延长反应时间及使用SAM类似物循环再生策略可使儿茶酚类化合物在烃基化反应中完全转化。

具体实施方式：

以下实施例有助于了解本专利，但不局限于本发明的内容。

实施例中所用的SAM类似物参考文献(Y.Zhang,et al.Chembiochem.2013,14,1438-1443)合成；

按照文献(N.J.H.Cotton,et al.J.Biol.Chem.2004,279,23710-23718)构建表达COMT的大肠杆菌重组菌株，并按照文献(J.X.Wang,et al.Protein Expr.Purif.2007,53,97-103)表达纯化COMT；

按照文献(E.H.Hansen,et al.Appl.Environ.Microbiol.2009,75,2765-2774)构建表达COMT的酿酒酵母重组菌株；

表达COMT的大肠杆菌重组菌株或酿酒酵母重组菌株全细胞裂解液制备具体操作为将收集到的表达COMT的菌体重悬于含10％甘油的水相体系中，菌体超声破碎后4℃离心，获得上清液可溶蛋白。

仓鼠肾脏活性COMT的提取按照文献(B.T.Zhu,et al.J.Biol.Chem.1994,269,292-299)进行。

实施例1

将纯化的COMT(终浓度6.3mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)，儿茶酚(终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA的溶液中，40℃反应1h。加入30mL质量浓度为26％的NaCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)为洗脱剂，得目标产物2-(烯丙氧基)苯酚1，产率48.3％。

目标产物1 ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.61(d,J＝5.2Hz,2H),5.42(dd,J＝13.6,36.6Hz,2H),5.64(s,1H),6.01-6.11(m,2H),6.79-6.94(m,4H)；¹³C NMR(160MHz,CDCl₃)δ69.8,112.2,114.7,118.2,120.0,121.7,132.8,145.5,146.0；HRMS:Calculated for C₉H₁₁O₂([M+H]⁺):151.0714；obtained:151.0719。

实施例2

将纯化的COMT(终浓度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)，2,3-二羟基萘酚(终浓度6.0mM)，烯丙基溴(终浓度4mM),Al₂O₃(0.4mM)于20mL含有60％50mM NaH₂PO₄，pH 5.5，1mM MgCl₂，1mM DTT，40％甲醇的溶液中，10℃搅拌反应72h。加入20mL的26％的NaCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10,v/v)为洗脱剂，得目标产物2-(烯丙氧基)萘酚2，产率为80.2％。

目标产物2 ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(dt,J₁＝5.6Hz,J₂＝1.2Hz,2H),5.35-5.50(m,2H),5.93(s,1H),6.09-6.18(m,1H),7.13(s,1H),7.27(s,1H),7.28-7.34(m,2H),7.66(dd,J＝7.4,1.8Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ69.7,107.0,109.5,118.7,123.8,124.4,126.3,126.4,128.9,129.7,132.4,145.7,146.3；HRMS:Calculated for C₁₃H₁₁O₂([M-H]^－):199.0759；obtained:199.0765。

实施例3：

将表达COMT的大肠杆菌重组菌株全细胞裂解液(终浓度5.8mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)，多巴胺 (终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.5，1mM DTT，20mM MgCl₂，10mM EDTA的溶液中，37℃反应5h后，加入30mL的26％的NaCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，甲醇/二氯甲烷(1/10,v/v)为洗脱剂，得目标产物3m，产率20.1％。

目标产物3m ¹H NMR(400MHz,D₂O)δ3.15(t,J＝7.4Hz,2H),4.55(t,J＝6.0Hz,2H),5.21-5.34(m,2H),5.93-6.04(m,1H),6.72-6.93(m,3H)；HRMS:Calculated for C₁₁H₁₆NO₂([M+H]⁺):194.1181；obtained:194.1176；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为70％50mM Na₂HPO₄，pH 2.5，1mM 1-庚烷磺酸钠，30％甲醇，检测280nm紫外吸收信号，异构体比例为3m:3p＝3.5:1。

实施例4：

将表达COMT的大肠杆菌重组菌株全细胞裂解液(终浓度5.8mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)，于30mL含有50mM HEPES,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA，1mM DTT的溶液中，37℃反应12h，加入30mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，产物柱层析分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10,v/v)为洗脱剂，得目标产物4m，产率40.8％。

目标产物4m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.69(d,J＝5.2Hz,2H),5.34-5.46(dd,J＝8.0,12.0Hz,2H),6.02-6.12(m,1H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),7.60(d,J＝1.6Hz,2H)，7.74(dd,J＝0.4,1.8Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ70.0,113.5,114.4,118.9,125.3,132.2,145.1,150.9,171.2；HRMS:Calculated for C₁₀H₁₁O₄([M+H]⁺):175.0657；obtained:175.0649；

NMR测定反应生成异构体比例，反应液经Millipore’s Ultra-0.5 10K超滤离心管离心除蛋白后加入1mL 1N HCl酸化，旋转蒸发除水，剩余固体残留物重悬于D₂O中NMR测定。两种异构体通过芳香环氢化学位移区分，产物以4m为主，通过计算峰面积比值获得异构体比例为4m:4p＝50:1。

实施例5：

将表达COMT的酿酒酵母重组菌株全细胞裂解液(终浓度6.2mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM MgCl₂，10mM DTT的溶液中，37℃反应12h。加入30mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)为洗脱剂，得目标产物5m，产率59.2％。

目标产物5m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.28(s,9H),4.61(d,J＝5.6Hz,2H),6.99(dd,J＝39,13Hz,2H),5.49(s,1H)，6.02-6.11(m,3H),8.86-8.90(m,3H)；HRMS:Calculated for C₁₃H₁₇O₂([M-H]^－):205.1229；obtained:205.1238；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为45％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，55％甲醇，检测270nm紫外吸收信号，异构体比例为5m:5p＝1:0。

实施例6：

将表达COMT的酿酒酵母重组菌株全细胞裂解液(终浓度7.1mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA,8mM DTT的溶液中，37℃反应2h，加入30mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)为洗脱剂，得目标产物6m，产率30.2％。

目标产物6m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.62(dt,J＝5.6,1.4Hz,2H),5.28-5.43(m,2H),5.43(s,1H)，6.01-6.10(m,1H),6.65-6.68(m,1H),6.71-6.71(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ65.1,102.7,104.0,104.2,113.4,113.6,113.7,127.3,128.9,129.0,141.9,142.0,144.4,146.7；HRMS:Calculated for C₉H₉FO₂([M+H]⁺):169.0665；obtained:169.0659；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为50％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，50％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为6m:6o＝7.4:1。

实施例7：

将纯化的COMT(终浓度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度6.0mM)，烯丙基溴(终浓度120mM),AlCl₃(12mM)于30mL含有80％50mM Tris-Cl,pH 7.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA，20％正己烷的溶液中，20℃反应72h，加入30mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/20，v/v)为洗脱剂，分离主产物7m，产率75.6％。

目标产物7m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.85(s,3H),4.58(dt,J＝6.0,1.0Hz,2H),5.25-5.39(m,2H),5.76(s,1H)，6.02-6.12(m,1H),6.48(dd,J＝4.4,1.2Hz,1H),6.61(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),6.94(t,J＝8.2Hz,1H)；HRMS:Calculated for C₁₀H₁₂O₃([M+H]⁺):181.0865；obtained:181.0859；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为65％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，35％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为7m:7o＝2.1:1。

实施例8：

将纯化的COMT(终浓度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度6.0mM)，烯丙基溴(终浓度20mM),ZnCl₂(2mM)于30mL含有80％50mM Tris-Cl,pH 7.0，0.5mM EDTA，2mM DTT，20％丙酮的溶液中，20℃反应72h，加入30mL1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)为洗脱剂，分离主产物8m，产率80.5％。

目标产物8m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.11(t,J＝6.8Hz,3H),1.31-1.38(m,4H),1.72(m,2H),3.18(t,J＝7.2Hz,2H),4.78(d,J＝5.2Hz,2H),5.27-5.34(m,2H),5.38(s,1H)，6.08-6.11(m,1H),7.21(d,J＝4.4Hz,1H),7.32(d,J＝4.4Hz,1H),7.51(s,1H)；HRMS:Calculated for C₁₄H₂₁O₄S([M+H]⁺):285.1116；obtained:285.1110；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为65％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，35％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为8m:8p＝3.1:1。

实施例9：

将纯化的COMT(终浓度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度6.0mM)，烯丙基溴(终浓度10mM),

目标产物9m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.37-1.68(m,6H),1.89(m,2H),2.78(m,1H),4.72(d,J＝5.8Hz,2H),5.28-5.34(m,2H),5.62(s,1H)，6.12-6.17(m,1H),6.78(d,J＝6.8Hz,1H),6.90(d,J＝6.7Hz,1H),7.12(s,1H)；HRMS:Calculated for C₁₄H₁₉O₂([M+H]⁺):219.1340；obtained:219.1349；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为55％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，45％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为9m:9p＝5.9:1。

实施例10：

将表达COMT的大肠杆菌重组菌株全细胞裂解液(终浓度5.8mg/mL)，Allyl-SAM(终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)于30mL含有50mM HEPES,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA，2mM DTT的溶液中，37℃反应12h，加入30mL 1M HCl终止反应，产物柱层析分离，乙酸乙酯/石油醚(1/60,v/v)为洗脱剂，得目标产物10m，产率20.8％。

目标产物10m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.52-2.68(m,2H),3.42-3.48(m,1H),4.58-4.68(m,4H),5.39(s,1H)，5.41-5.51(m,2H),6.09(m,1H),6.74(d,J＝7.2Hz,1H),6.88(d,J＝7.0Hz,1H),7.21(s,1H)；HRMS:Calculated for C₁₃H₁₅O₄([M+H]⁺):235.0926；obtained:235.0927；

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为55％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，45％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为10m:10p＝7.1:1。

实施例11：

将仓鼠肾脏细胞裂解液(终浓度7.8mg/mL)， (终浓度4.0mM)，儿茶酚(终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Mops,pH 6.5，1mM DTT，10mM MgCl₂，10mM EDTA的溶液中，20℃反应5h。加入30mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)为洗脱剂，分离产物11，产率20.1％。

目标产物11¹H NMR(400MHz,D₂O)δ3.48(s,1H),4.54(s,1H),6.02-6.33(m,4H)；¹³C NMR(400MHz,D₂O)δ33.2,57.4,80.6,84.8,115.7,115.9,131.2,131.3,146.5,148.7；HRMS:Calculated for C₁₀H₁₂NO₂([M+H]⁺):178.0823；obtained:178.0820；

实施例12：

将纯化的COMT(终浓度6.3mg/mL)， (终浓度4.0mM)，儿茶酚(终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA的溶液中，40℃反应1h。加入30mL质量浓度为26％的NaCl止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/5，v/v)为洗脱剂，分离产物12产率20.1％。

目标产物12 ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.76-1.78(m,2H),1.91-1.95(m,2H),2.28-2.38(m,4H),2.78(t,J＝6.8Hz,2H),3.62(t,J＝5.2Hz,2H),4.75(s,1H),5.39(s,1H),6.12(s,2H)6.85-6.96(m,4H)；HRMS:Calculated for C₁₆H₂₃N₂O₃([M+H]⁺):291.1664；obtained:291.1658。

实施例13：

将表达COMT的大肠杆菌重组菌株全细胞裂解液(终浓度5.8mg/mL)， (终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)，于30mL含有50mM HEPES,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA，1mM DTT的溶液中，37℃反应12h，加入30mL1M HCl终止反应，产物柱层析分离，乙酸乙酯/石油醚(1/70,v/v)为洗脱剂，获得目标产物13m产率为30.9％；

主产物13m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.69(d,J＝5.2Hz,2H),5.34-5.46(dd,J＝8.0,12.0Hz,1H),6.02-6.12(m,1H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),7.60(d,J＝1.6Hz,2H)，7.74(dd,J＝0.4,1.8Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ70.0,113.5,114.4,118.9,125.3,132.2,145.1,150.9,171.2；HRMS:Calculated for C₁₀H₁₀ClO₄([M+H]⁺):229.0268；obtained:229.0254。

NMR测定反应生成异构体比例，反应液经Millipore’s Ultra-0.5 10K超滤离心管离心除蛋白后加入1mL 1N HCl酸化，旋转蒸发除水，剩余固体残留物重悬于D₂O中NMR测定。两种异构体通过芳香环氢化学位移区分，通过计算峰面积比值获得异构体比例为13m:13p＝20:1。

实施例14：

将表达COMT的酿酒酵母重组菌株全细胞裂解液(终浓度7.1mg/mL)， (终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM MgCl₂，0.5mM EDTA,8mM DTT的溶液中，37℃反应2h，加入30mL 1M HCl终止反应，产物柱层析分离，乙酸乙酯/石油醚(1/10-1/2,v/v)为洗脱剂，获得目标产物14m，产率30.2％；

主产物14m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ2.98(s,1H),4.62(dt,J＝5.6,1.4Hz,2H),5.28-5.43(m,1H),5.43(s,1H)，6.01-6.10(m,1H),6.65-6.68(m,1H),6.71-6.71(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ65.1,80.6,80.1,102.7,104.0,104.2,113.4,113.6,113.7,127.3,128.9,129.0,141.9,142.0,144.4,146.7；HRMS:Calculated for C₁₁H₁₀FO₂([M+H]⁺):193.0620；obtained:193.0617。

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为50％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，50％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为14m:14o＝6.3:1。

实施例15：

将表达COMT的酿酒酵母重组菌株全细胞裂解液(终浓度6.2mg/mL)， (终浓度4.0mM)， (终浓度4.0mM)于30mL含有50mM Tris-Cl,pH 8.0，1mM MgCl₂，10mM DTT的溶液中，37℃反应12h。加入30mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/20，v/v)为洗脱剂，获得目标产物15m，产率37.2％；

主产物15m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.28(s,9H)，2.14(s,3H)，4.61(d,J＝5.6Hz,2H),5.49(s,1H)，8.86-8.90(m,3H)；HRMS:Calculated for C₁₃H₁₈O₃([M+H]⁺):223.1289；obtained:223.1280；

HPLC测定反应液中两种异构体比例，流动相为45％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，55％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为15m:15p＝5.2:1。

实施例16：

将表达COMT的大肠杆菌全细胞裂解液(终浓度8.5mg/mL)，

(终浓度4.0mM)， (终浓度6.0mM)，烯丙基溴(终浓度120mM),AlCl₃(12mM)

碘代异丁烷(终浓度90mM),SiO₂(2mM)于20mL含有70％50mM HEPES,pH 6.5，5mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM DTT，30％正己烷的溶液中，室温25℃搅拌反应30h。加入20mL 1M HCl终止反应，离心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有机相旋转蒸发除溶剂，粗产物硅胶层析柱分离，乙酸乙酯/石油醚(1/20-1/10，v/v)为洗脱剂，获得目标产物16m，产率89.8％。

主产物16m ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.01(d,J＝2.2Hz,6H),2.12(m,1H),3.69(d,J＝2.7Hz,2H),3.89(s,1H),6.48(dd,J＝4.4,1.4Hz,1H),6.67(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),6.99(t,J＝7.8Hz,1H)；HRMS:Calculated for C₁₁H₁₇O₃([M+H]⁺):197.1133；obtained:197.1129。

HPLC测定反应液中两种异构体的比例，流动相为50％50mM Na₂HPO₄，pH 5.2，50％甲醇，检测276nm紫外吸收信号，异构体比例为16m:16o＝3:1。

表1为实施例1-16羟基化的儿茶酚类及其对应的化学结构。

1实施例1-16羟基化的儿茶酚类及其对应的化学结构

实施例17：

选取化合物2，3m，4m，5m，8m，13m，15m进行流感病毒H1N1神经氨酸酶体外活性抑制评价，活性检测方法参照文献(J.Li,et al.Mar.Drugs 2011,9,1887-1901)，以神经氨酸酶抑制剂Tamiflu作为正对照。如表-2所示，浓度为50μM的儿茶酚类烃基化物分别具有对神经氨酸酶15.8-130.8％的抑制活性，其中化合物4m与13m具有较高活性抑制能力，分别为Tamiflu的120.6％和130.8％。

表-2 神经氨酸酶活性抑制测定结果

由以上实施例可见，通过生物催化制备的儿茶酚类化合物4m和13m比Tamiflu更高的抑制神经氨酸酶活性。亦可说明本发明反应条件温和，具备良好的化学选择性及区域选择性；烃基化供体可再生，催化转化率高。

一种生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。