专利摘要
本发明一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β‑隐黄素及玉米黄素的方法，属于食品科学技术领域。该方法包括如下步骤：将特氏杜氏藻细胞接种至液体培养基中，培养，在培养过程中测定藻液的光密度，待OD630达到0.7～1.1时加入咪唑100～1000ppm，继续培养2～6d，然后测量β‑隐黄素及玉米黄素含量。本发明加入咪唑之后能够快速，有效地提高特氏杜氏藻中β‑隐黄素及玉米黄素的含量。本发明中使用的咪唑效果显著，生效迅速，且成本很低，是一种有效且经济的提高特氏杜氏藻中β‑隐黄素及玉米黄素的方法。
权利要求
1.一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将特氏杜氏藻细胞接种至液体培养基中，培养，在培养过程中测定藻液的光密度，待OD
积累β-隐黄素时，咪唑的用量为250～1000ppm，继续培养的时间为2～6d，培养所用的光照度为6000～10000Lx；
积累玉米黄素时，咪唑的用量为500～750ppm，继续培养的时间为2～4d，培养所用的光照度为10000Lx；或者，咪唑的用量为1000ppm，继续培养的时间为2d，培养所用的光照度为10000Lx；或者，咪唑的用量为500～750ppm，继续培养的时间为2d，培养所用的光照度为8000Lx；或者，咪唑的用量为750ppm，继续培养的时间为4d，培养所用的光照度为8000Lx。
2.根据权利要求1所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
积累β-隐黄素时，所述的咪唑的加入量为500～750ppm。
3.根据权利要求1所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
积累β-隐黄素时，所述的咪唑的加入量为500ppm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
待OD
积累β-隐黄素时，所述的继续培养的时间为4～6d。
5.根据权利要求1～3任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
所述的培养的条件为：光暗周期为16h/8h，温度为27～28℃，以转速50r/min的转速震荡培养。
6.根据权利要求5所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
所述的培养的条件为：积累β-隐黄素的光照度为8000Lx；光暗周期为16h/8h，温度为27～28℃，以转速50r/min的转速震荡培养。
7.根据权利要求1～3任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
所述的液体培养基为：配制特氏杜氏藻基本培养液，向基本培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至室温，得到液体培养基。
8.根据权利要求7所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
所述的特氏杜氏藻基本培养液，其成分为：NaNO
所述的A5微量元素溶液，其成分如下：H
所述的Fe-EDTA液为：Na
所述的灭菌的条件为：压力102.9kPa，温度121℃，时间20～25min。
9.根据权利要求1～3任一项所述的利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，其特征在于：
所述的测量β-隐黄素及玉米黄素的方法包括：
取10mL藻液，8000 rpm离心1 min，弃去上清液，重新加入2 mL丙酮，涡旋2～3min，浸提20 min，以10000～13000 rpm离心5～15 min，取上清液转移至新的离心管中，加入0.2 mL的60%KOH，去除叶绿素，静置分层，上层的丙酮相用0.45 µm的滤膜过滤；
使用高效液相色谱法分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为WelchUltimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97%甲醇+3%超纯水，B相为100%叔丁基甲醚，所用的流速为1.0 mL/ min，所用的柱温为25 ℃。
说明书
技术领域
本发明属于食品科学技术领域，具体涉及一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法。
背景技术
特氏杜氏藻是一种无细胞壁的单细胞绿藻，能够在盐度范围为0.5M～5.5M的环境中生长。特氏杜氏藻的高耐盐性使其可以在海水，咸水湖及盐池中生活，并在高盐水体中形成优势种群。特氏杜氏藻对环境适应力强，易于繁育，不会在水体表面结块，因此具有在室外甚至开放水域低成本大规模培养的可能性。此外，在高光及硝酸盐充足的情况下，特氏杜氏藻会在细胞内积累高价值的类胡萝卜素如β-胡萝卜素及叶黄素。因此，特氏杜氏藻被认为是天然类胡萝卜素的重要来源。
β-隐黄质(beta-cryptoxanthin)又名β-隐黄素，是一种羟基化的β-胡萝卜素，也是唯一具有维生素A原活性的叶黄素，多存在于水果和蔬菜中，其中以橘子，红辣椒以及南瓜含量相对较高，具有多种对人体健康很重要的功能。β-隐黄素可以作为视黄醇的来源，还是一种体外抗氧化剂，由于其抗氧化，抗癌特性，骨骼疾病预防能力，β-隐黄素也在全球市场中引起关注。玉米黄素由β-隐黄素羟化而成，是一种叶黄素类色素，一般用作天然食品着色剂，同样在蔬菜及水果中广泛存在。虽然玉米黄素不能在人体内转化为维生素A，但是也具有保护视力，预防心血管疾病等功效。天然来源的β-隐黄质及玉米黄素一般来自花果，生产提纯成本很高，因此急需寻找更合适的原料来源。特氏杜氏藻含有一种催化非亚铁血红素β-胡萝卜素羟化酶，通过羟化β-胡萝卜素形成β-隐黄素，并进一步生成玉米黄素。因此，特氏杜氏藻具有大量累积β-隐黄素及玉米黄素的潜质。
发明内容
为了满足市场对于大量且廉价的天然β-隐黄素及玉米黄素的需求，本发明的目的在于提供一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法。该方法显著地提高了特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量。本发明中使用的咪唑效果显著，生效迅速，且成本很低，是一种有效且经济的提高特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法，包括如下步骤：
将特氏杜氏藻细胞接种至液体培养基中，培养，在培养过程中测定藻液的光密度(OD值)，待OD630达到0.7～1.1(优选为1.0)时加入咪唑，继续培养2～6d(优选为4～6d，进一步优选为4d)，然后测量β-隐黄素及玉米黄素含量。
所述的培养的条件为：在光照度为6000～10000Lx，其中积累β-隐黄素的最优光照度为8000Lx，积累玉米黄素的最优光照度为10000Lx；光暗周期为16h/8h，温度为27～28℃，以转速50r/min的转速震荡培养。
所述的咪唑的加入量为100～1000ppm，优选为250～1000ppm；进一步优选为500～750ppm；更进一步优选为500ppm。
所述的液体培养基为：配制特氏杜氏藻基本培养液，向基本培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至室温，得到液体培养基。
所述的特氏杜氏藻基本培养液，其成分为：NaNO3为0.420g/L，NaCl为87.69g/L，NaH2PO4·2H2O为0.156g/L，NaHCO3为0.840g/L，KCl为0.074g/L，MgSO4·7H2O为1.230g/L，CaCl2·2H2O为0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L，调pH至7.5。
所述的A5微量元素溶液，其成分如下：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L，加入的量为1mL/L。
所述的Fe-EDTA液为：Na2EDTA 0.189g/L，FeCl3·6H2O 0.244g/L。溶液中Fe离子浓度0.1mg/mL，高压灭菌至溶解。
所述的灭菌的条件为：压力102.9kPa，温度121℃，时间20～25min。
所述的测量β-隐黄素及玉米黄素的方法为：
取10mL藻液，8000rpm离心1min，弃去上清液，重新加入2mL丙酮，涡旋2～3min(优选为2min)，浸提20min，以10000～13000rpm离心5～15min(优选为10000rpm离心10min)，取上清液转移至新的离心管中，加入0.2mL的60％KOH(用来去除叶绿素)，静置分层，上层的丙酮相用0.45μm的滤膜过滤，4℃冰箱保存。
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97％甲醇+3％超纯水，B相为100％叔丁基甲醚，所用的流速为1.0mL/min，所用的柱温为25℃。
β-隐黄素的峰高/含量换算公式为：y＝0.0069x；
玉米黄素的峰高/含量换算公式为：y＝0.021x。
换算公式通过标准品标定而得。
本发明的藻种来源：
所涉及的特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta FACHB-821)购于中科院水生生物研究所(武汉)，并采用液体培养基弱光保存。
利用高效液相色谱法法测定微藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量，表明加入咪唑后β-隐黄素及玉米黄素含量有一个明显增加的变化。加入咪唑的量为500ppm时，D.tertiolecta中β-隐黄素及玉米黄素的积累量提高最明显。其中最有利于β-隐黄素积累的最适光照度为8000Lx，最有利于玉米黄素积累的最适光照度为10000Lx。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明加入咪唑后能够明显提高特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量。
(2)本发明加入咪唑之后能够快速，有效地提高特氏杜氏藻中β-隐黄素及玉米黄素的含量，相比于其它方法如利用基因工程技术过表达非亚铁血红素β-胡萝卜素羟化酶或者抑制玉米黄素环氧化酶的表达量等等，本发明有着操作简单，成本低廉，生效更快等优势。虽然咪唑在某种程度上减少了特氏杜氏藻的总生物量，但是由于单细胞β-隐黄素及玉米黄素含量有了大幅度的提升，最终导致体系内的β-隐黄素及玉米黄素含量有了显著的提升。
(3)本发明使用的特氏杜氏藻是一类自养生物，适合在户外高盐水域环境中大量地户外培养，培养过程中无需大量添加碳氮源，是一种环境友好的且可持续的类胡萝卜素原料。
附图说明
图1是加入咪唑后，对照组和各实验组的β-隐黄素的含量。
图2是加入咪唑后，对照组和各实验组的玉米黄素的含量。
图3是在8000Lx光照度下培养96h的对照组的液相图谱。
图4是在8000Lx光照度下以500ppm咪唑培养96h的实验组的液相图谱。
图5是在10000Lx光照度下以500ppm咪唑培养96h的实验组的液相图谱。
图6为图4中出峰时间为13.00min的物质的波段扫描图。
图7为β-隐黄素标准品全波段扫描图。
图8为图5中出峰时间为10.35min的物质的波段扫描图。
图9为玉米黄素标准品全波段扫描图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
所涉及的特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta FACHB-821)购于中科院水生生物研究所(武汉)，并采用液体培养基弱光保存。
实施例1
(1)特氏杜氏藻培养液配制
配制盐藻培养液：NaNO3 0.420g/L，NaCl 87.69g/L，NaH2PO4·2H2O 0.156g/L，NaHCO3 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO4·7H2O 1.230g/L，CaCl2·2H2O 0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L。向培养液中加入A5微量元素溶液1mL/L，调pH至7.5。Fe-EDTA液成分如下：Na2EDTA 0.189g/L，FeCl3·6H2O 0.244g/L。A5微量元素溶液成分如下：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.04g/L。盐藻培养液按100mL每瓶分装至250mL的三角瓶中，四层纱布封口，在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。室温冷却后使用。
(2)接种培养
将处于对数生长期的藻液于4000r/min下离心3min，弃除培养液，按5％的接种量将藻细胞加入装有新鲜灭菌培养液的三角瓶中，用四层纱布包裹瓶口并用橡皮筋扎紧。将三角瓶置于光照培养箱中，分别在光照度为6000，8000及10000Lx(光暗周期为16h/8h)下，以温度为27～28℃，以50r/min的转速震荡培养。培养过程中用分光光度计测定藻液的光密度(OD值)，当其OD630达到1.0左右时分别加入咪唑0、250、500、750、1000ppm，继续培养约6天，每隔两天取样一次。
(3)类胡萝卜素的提取
取10mL藻液，8000rpm离心1min，弃去上清液，重新加入2mL丙酮，涡旋2min，浸提20min，以10000rpm离心10min，取上清液转移至4mL离心管，加0.2mL的60％KOH(用来去除叶绿素)，静置分层，上层的丙酮相用0.45μm的滤膜过滤，4℃冰箱保存。
(4)类胡萝卜素含量的测定
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97％甲醇+3％超纯水，B相为100％叔丁基甲醚，所用的流速为1.0mL/min，所用的柱温为25℃。
β-隐黄素的峰高/含量换算公式为：y＝0.0069x；
玉米黄素的峰高/含量换算公式为：y＝0.021x。
换算公式通过标准品标定而得。
(5)结论
当不加入咪唑时，在不同的光照度及培养时间下，β-隐黄素均无法通过上述方法被检测出来(图1，3)。在加入咪唑后，β-隐黄素开始积累(图6，7)，其出峰时间在13.1min附近(图4)。经过条件优化，最有利于β-隐黄素在特氏杜氏藻中积累的条件为在8000Lx的照度下用500ppm咪唑处理特氏杜氏藻96h，此时β-隐黄素的累积量达到0.40μg/mL提取液。
当不加入咪唑时，玉米黄素(出峰时间在10.3min附近，特征光谱见图8，9)在不同的光照度及培养时间下均有积累，影响其积累的最重要因素为光照度(图2)。在高光强下，玉米黄素的积累量大大提高(图2)。在加入500～750ppm咪唑后，在高照度的实验组中观测到玉米黄素含量的骤增(图2)。经过条件优化，最有利于玉米黄素在特氏杜氏藻中积累的条件为在10000Lx的光照度下用500ppm咪唑处理特氏杜氏藻96h，此时玉米黄素的累积量达到7.50μg/mL提取液(图2，5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
一种利用咪唑使特氏杜氏藻积累β-隐黄素及玉米黄素的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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