专利摘要

本发明涉及基于代谢调控高产土霉素的方法。本发明公开了一种在龟裂链霉菌中通过调控土霉素合成途径提高土霉素产量的方法，通过增加一个或多个土霉素生物合成途径的调控因子的拷贝数，从而提高土霉素合成途径中相关基因的表达水平，进而提高土霉素的产量。

权利要求

1.一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在龟裂链霉菌基因组中增加1-8个拷贝的rgC基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在龟裂链霉菌基因组中增加1-8个拷贝的otrC。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述表达载体中包含rgC基因的序列；

(2)将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源的rgC基因序列的重组龟裂链霉菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的表达载体中还包含otrC基因；和(2)中，选择基因组中整合有外源的rgC基因序列、otrC基因序列的重组龟裂链霉菌。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体中，rgC序列的5’端，包括ermEp1启动子。

6.如权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是pSET152载体。

7.一种重组的龟裂链霉菌，其特征在于，其基因组中整合有外源的1-8个拷贝的rgC基因。

8.如权利要求7所述的重组的龟裂链霉菌，其特征在于，所述的重组的龟裂链霉菌中还含有1-8个拷贝的外源的1-8个拷贝的otrC基因。

9.如权利要求7或8所述的重组的龟裂链霉菌，其特征在于，其是通过权利要求1-6任一所述的方法制备获得。

10.一种生产土霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求7-9任一所述的重组的龟裂链霉菌，从而生产土霉素。

说明书

技术领域

本发明属于链霉菌代谢工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于代谢调控高产土霉素的新工艺。

背景技术

链霉菌是抗生素的主要生产菌株，目前很多链霉菌的基因组已经完成测序，通过基因序列的同源性比对，很多功能基因(调控因子)被发现，并在体外和体内进行了鉴定，很多调控因子与抗生素合成相关，通过调控抗生素合成途径中的相关基因的表达量，从而提高抗生素的产量。这为进一步利用这些调控因子作为靶点进行基因改造，获得抗生素高产突变菌株提供了便利。

龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)作为工业用于生产四环素类抗生素的生产菌株，也是土霉素的主要生产菌株。土霉素(Oxytetracycline，OTC)是一种临床上广泛应用的广谱抗生素，由Finlay等人于1950年首次报道在Streptomycesrimosus中发现。目前报道的OTC生产菌还有：Streptomyces capuensis，Streptomyces henetus和Streptomyces platensis等。OTC对革兰氏阳性、阴性细菌，螺旋菌，立克次体以及一些病毒具有抗菌性，通过可逆地结合到30S核糖体亚基上，阻止氨酰tRNA核糖体复合体的形成，从而达到抑菌的效果。然而，为了提高土霉素的产量，本领域还有必要进一步研究提高土霉素产量的方法。

区别于传统菌种选育的方法，基因水平操作具有快速、有效获得定点突变株的优势。提高基因组中抗生素合成途径相关基因的拷贝数来提高抗生素的产量的方法尽管已在现有技术中被应用，但提高合成途径中哪个或哪些基因的拷贝有作用是不确定的，基因的选择难度很大。并且很多现有研究显示，提高基因的拷贝数不能保证基因的表达水平随着拷贝数的增加而增加，由于菌株本身存在自我调节作用，很多情况下即使提高基因拷贝数也不能改变基因表达水平，不能进一步提高抗生素的合成。提高基因拷贝数是否有作用还取决于基因本身的特性，很多基因并不能藉由提高拷贝数来增加表达。因此，为了提高土霉素的产量，需要对土霉素合成途径中相关基因进行筛选，以定位到关键性的，可有效实现调控的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于代谢调控高产土霉素的新工艺。

在本发明的第一方面，提供一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法，所述方法包括：在龟裂链霉菌基因组中增加1-8个拷贝(如2、3、4、5、6、7个拷贝)的rgC基因。

在一个优选例中，所述方法还包括：在龟裂链霉菌基因组中增加1-8个拷贝(如2、3、4、5、6、7个拷贝)的otrC。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述表达载体中包含rgC基因的序列；

(2)将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源的rgC基因序列的重组龟裂链霉菌。

在另一优选例中，所述的方法的步骤(1)中，所述的表达载体中还包含otrC基因；和(2)中，选择基因组中整合有外源的rgC基因序列、otrC基因序列的重组龟裂链霉菌。

在另一优选例中，所述的rgC与otrC基因的序列以串联的形式存在。

在另一优选例中，所述的表达载体中，rgC序列的5’端，包括ermEp1启动子。

在另一优选例中，所述的表达载体是pSET152载体。

在本发明的另一方面，提供一种重组的龟裂链霉菌，其基因组中整合有外源的1-8个拷贝的rgC基因。

在一个优选例中，所述的重组的龟裂链霉菌中还含有1-8个拷贝的外源的1-8个拷贝的otrC基因。

在另一优选例中，所述的重组的龟裂链霉菌是通过前面任一所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供一种生产土霉素的方法，所述方法包括：培养前述的重组的龟裂链霉菌，从而生产土霉素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、通过增加龟裂链霉菌中rgC基因的拷贝数来提高其土霉素产量的流程图。

图2、整合质粒pSET152的结构，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列，以及筛选标记阿普拉(Aprmycine)抗性基因序列。

图3、重组质粒pSET152-ermEp1-rgC(pSERC)，其中ermEp1为一个红霉素强启动子序列，在重组质粒中位于rgC基因的上游。

图4、测定重组菌SRI05/pSERC及出发菌株SRI05的土霉素效价。

图5、重组质粒pSET152-ermep1-rgC-OtrC(pSETERO12)，其中ermEp1为一个红霉素强启动子序列，在重组质粒中位于串联的rgC基因和otrC基因的上游。

图6、测定重组菌SRI05/pSETERO12及出发菌株SRI05的土霉素效价。

具体实施方式

为了克服目前土霉素工业生产菌株改造难的问题，本发明人经过深入的研究，开发了一种提高土霉素产量的方法，通过增加一个或多个土霉素生物合成途径的调控因子的拷贝数，从而提高土霉素合成途径中相关基因的表达水平，进而提高土霉素的产量。

本发明通过提高龟裂链霉菌染色体上一个全局调控因子rgC的拷贝数，从而提高龟裂链霉菌中土霉素合成途径中起始的三个结构基因的表达量，从而提高土霉素合成途径前体——四环素碳骨架，提高土霉素合成途径的通量，从而提高土霉素的产量。所述方法可提高土霉素产量超过40%。

所述的“龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)”是一种产土霉素的链霉菌，其可以从土壤中分离获得。其形态为：孢子丝螺旋形2～3圈，紧密，偶有松敞螺旋。孢子柱形，0.8×1.6～1×1.7微米。

所述的“土霉素”化学名称为：6-甲基-4-二甲氨基)-3,5,6,10,12,12a-六羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12α-八氢-2-并四苯甲酰胺。分子式：C₂₂H₂₄N₂O₉。其为四环素类抗生素，是广谱抑菌剂。

所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“rgC”或“otrC”基因是指土霉素生物合成途径中的基因，还包括在严格条件下与所述基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对龟裂链霉菌的土霉素产量具有显著的促进作用。该定义中还包含在严格条件下与“rgC”或“otrC”杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。

NCBI已公开了“rgC”或“otrC”的基因序列，因此，本领域人员易于获得和制备这些基因。作为本发明的优选方式，所述的rgC基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所示的核苷酸序列；所述的otrC具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

发明还涉及rgC或otrC的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽(酶)。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明的rgC或otrC的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

为了增加龟裂链霉菌的土霉素产量，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于进行改良的基因rgC或otrC，并构建了相应的构建物。

因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括：rgC、otrC的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的蛋白。

作为本发明的优选方式，所述的rgC与otrC以串联的形式存在于同一表达盒中。另外，可选择的，所述的rgC与otrC可分别存在于不同的表达盒中(具备各自的表达原件，包括启动子、终止子等)。

作为本发明的优选方式，将rgC与otrC串联，并以ermEp1驱动表达。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

所述的rgC与otrC可存在于同一表达载体的同一表达盒中或不同表达盒中；也可存在于不同表达载体中。应理解，只要能够实现在龟裂链霉菌中增加rgC、otrC的表达，任何重组表达rgC、otrC的方式均可选用的。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性。优选的，本发明的表达载体上的选择性标记是阿普拉霉素(Apramycin)抗性基因。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是龟裂链霉菌。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。作为一种优选的方式，可用电转化的方法进行。

作为本发明的优选方式，提供一种在龟裂链霉菌中提高土霉素产量的方法流程如图1所示。首先，提取龟裂链霉菌的基因组DNA，设计并合成引物，用于扩增全局调控因子rgC基因。第二步，将其克隆至穿梭载体中，获得重组载体。第三步，将第二步得到的重组载体通过电转或接合的方法转移到亲本菌株中。第四步，采用抗性筛选得到重组载体整合到亲本染色体中的突变株。第五步，采用PCR扩增的方法验证第四步得到的突变株。第六步，测定第五步得到的突变株的土霉素生产能力。

本方法通过在模式菌株和工业高产菌株中进行实验，结果表明，遗传背景清楚的模式菌株和遗传背景复杂的工业高产菌株都可以利用本方法进行改造，获得高产土霉素的突变菌株，简单易行。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、增加1个全局调控因子rgC基因(249bp)的拷贝数来增加产量

本实施例中，通过增加龟裂链霉菌中rgC基因的拷贝数来提高其土霉素产量的流程图如图1。

采用整合载体pSET152(链霉菌整合质粒，获自University of Strathclyde，Glasgow，UK)作为母体，质粒图谱如图2。pSET152的质粒骨架上已经包含有ΦC31整合酶及对应attP序列。由其构建的重组质粒可直接通过ΦC31介导的位点特异性重组整合进基因组的attB靶序列中。

1、包含有龟裂链霉菌基因组DNA的提取

首先，将龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus SRI05)接种至胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30℃220rpm培养30h。其次，离心收集菌丝体，用无菌水洗涤菌丝体。然后采用溶菌酶破碎细胞壁，用酚-氯仿抽提去除蛋白质等杂质。最后用异丙醇沉淀获得基因组DNA。

设计的扩增引物如下：

上游引物：5’CGCGGATCCATGAAGTTCCGCCGAATGGA(下划线为BamHI位点)(SEQ ID NO:3)；

下游引物：5’TGC TCTAGATCACGATGACAGCACCCACTG(下划线为XbaI位点)(SEQ ID NO:4)。

以上述获得的基因组DNA为模板，扩增获得rgC基因序列。

设计的ErmeP1启动子序列用引物如下：

上游引物：CCGGAATTCGTACCAGCCCGACCCGAGC(下划线为EcoRI位点)(SEQ ID NO:5)；

下游引物：CGCGGATCCTGTGGGGTCCTCCTGTGGAGT(下划线为BamHI位点)(SEQ ID NO:6)。

采用已有的ermEp1启动子的DNA为模板进行扩增，大小为301bp。

2、重组质粒和菌株构建

将PCR扩增获得的rgC基因片段以及ermEp1启动子DNA进行纯化，去除杂质后，用分别用BamHI/XbaI、EcoRI/BamHI限制性内切酶进行消化，对pSET152载体同样用EcoRI和XbaI限制性内切酶消化，然后回收消化后的片段用于连接，然后将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化产物涂布含有阿普拉霉素50μg/mL的LB平板，37℃静置培养12h，挑取平板上生长的单菌落至含阿普拉霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃220rpm培养12h，提取质粒，采用限制性内切酶酶切后，上样0.8%琼脂糖凝胶电泳，筛选酶切片段大小正确的质粒即为重组载体pSET152-ermEp1-rgC，如图3。

将筛选得到的重组质粒转化E.coli ET12567(pUZ8002)(获自University ofStrathclyde，Glasgow，UK)感受态细胞，转化产物涂布含有阿普拉霉素25μg/mL、卡那霉素25μg/mL、氯霉素34μg/mL的LB平板，37℃静置培养12h，挑取平板上生长的单菌落至含有阿普拉霉素25μg/mL、卡那霉素25μg/mL、氯霉素34μg/mL的LB液体培养基中，37℃220rpm培养12h，提取质粒。取10μL质粒加入100μL龟裂链霉菌SRI05感受态细胞中，混匀后加入预冷的电转杯(直径1cm)，在电压2KV，电容25μF，电阻400Ohm条件下电击链霉菌感受态细胞，然后迅速加入1mL预冷的液体培养基(CRM)，将菌悬液转入试管中30℃，150rpm培养3h后取100μL菌液涂布含有阿普拉霉素(Apramycin)500μg/mL的TSB平板，于30℃静置培养3天。筛选含有阿普拉霉素抗性的重组子。

提取含有阿普拉霉素抗性的重组菌的染色体DNA，采用PCR验证。

PCR验证引物为：

引物对1：

上游：GTTCACCCACAGCTGGAGGCC(SEQ ID NO:7)；

下游：GCTCGACTTCGCGCTGAAGGT(SEQ ID NO:8)；

引物对2：

上游：GCTATAATGACCCCGAAGCAG(SEQ ID NO:9)；

下游：TCGTCATGCCCCGCAGT(SEQ ID NO:10)；

引物对3：

上游：GTGCAATACGAATGGCGAAAA(SEQ ID NO:11)；

下游：TCAGCCAATCGACTGGCGA(SEQ ID NO:12)。

分别将经引物对1和2扩增的PCR产物连接T载体，进行测序，测序结果与预期相符，证明重组质粒已经定向插入至染色体细菌附着位点attB中。

将上述获得的重组菌株和对照菌株(转入pSET152空载体的SRI05/pSET152突变株)接种至摇瓶，发酵，通过高效液相-质谱联用测定土霉素发酵液生物效价。

3、摇瓶发酵条件

野生型龟裂链霉菌株SRI05或前述制备的重组菌株在麸皮斜面培养基上(7.5%麸皮，2.5%琼脂)，30℃培养7天，生长孢子，作为液体发酵的种子。

液体发酵时，从斜面培养基上取1cm²大小方块接种入50mL发酵种子培养基(淀粉3%，豆粉0.3%，硫酸铵0.4～0.5%，碳酸钙0.4%～0.5%，玉米浆0.4%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.015%～0.017%)在32℃，220rpm培养3天。然后将6mL的种子培养液转接到50mL发酵培养基(淀粉15%，豆粕粉2%，碳酸钙0.4%，硫酸铵1.4%，氯化钠0.4%，玉米浆0.5%，磷酸二氢钾0.01～0.02%，氯化钴10ug/ml，消沫剂0.01%，淀粉酶1-2‰)，30℃220rpm培养4-5天。

4、生物效价的测定

预处理：用9mol/L盐酸酸化发酵液至pH1.5-1.7，取1mL酸化的发酵液12000rpm离心10分钟，取上清液，用0.22m的滤膜过滤后，取20μl上样分析。高效液相色谱的分析条件为，采用5μm(4.6×200nm)C18柱；流动相为60%水，10%甲醇l，20%乙腈和10%磷酸(2mM)混合液，流速为0.8毫升/分钟，检测波长为350nm。

分析测定发酵液中土霉素的效价如图4所示，在所述摇瓶条件下，敲入了rgC基因的重组菌SRI05/pSET152-ermEp1-rgC的土霉素产量比对照菌株高了约45%。

上述方法中，用于敲入的串联的rgC片段序列如下(249bp)(SEQ ID NO:1)：

ATGAAGTTCCGCCGAATGGACGGGCGCCCCGACTACTTCCTCCGAGTCACCGTGGCCGACCACACCGCGTACGAAGCCTTCCTGACCAGACAAGCTCAGCTGCCTGCCCGCCGTCCTGCGCCTCGAATCCCATATGACCATGAAGGAGATCAAGGCCGACCGGTGAGGCGCCGACGCCCAGCCGCCGACGGCCTGACCTGGGCTGTCGGCCGGCTGTCGGTCGTTTGTCAGTGGGTGCTGTCATCGTGA

实施例2、同时增加龟裂链霉菌染色体上rgC调控因子以及一个ABC转运蛋白基因otrC的拷贝数，提高工业生产菌株产土霉素的能力

本实施例中，利用整合载体pSE T152为母体，同时串联rgC以及otrC基因，共同表达。

1、提取龟裂链霉菌(Streptomyces rimosusSRI05)基因组DNA

提取方法如实施例1中所述。

设计otrC基因的引物：

上游引物：5’CGC GAGGA GGGGGCATGACGCGAAAGACGATATCC(双下划线为NdeI位点)(SEQ ID NO:13)；

下游引物：5’TGCTCTAGATCAGGTCTTCTTGCGGAACTT3’(下划线为XbaI位点)(SEQ ID NO:14)；

扩增得到的otrC基因片段带有RBS序列(GGAGGA)。

设计rgC基因的引物：

上游引物：5’-CGC GGATCCATGAAGTTCCGCCGAATGGA(下划线为BamHI位点)(SEQ ID NO:15)；

下游引物：5’CGC CATATGTCACGATGACAGCACCCACTG(下划线为Nde I位点)(SEQ ID NO:16)；

以前述获得的基因组DNA为模板，扩增得到rgC片段。

2、将rgC和otrC基因以及实施例1中“1”所述获得的ermEp1启动子序列串联克隆至穿梭质粒pSE T152的EcoRI和XbaI位点之间，获得pSE T152-ermep1-rgC-otrC(pSETERO12)重组质粒(图5)，如实施例1中2所述转化大肠杆菌，并验证重组质粒。

如实施例1中“2”所述，将重组质粒pSETERO12去甲基化后转化龟裂链霉菌感受态细胞，利用抗性筛选获得突变株。

如实施例1中“2”所述，验证链霉菌突变株中重组质粒的整合以及整合位点的正确性，并验证重组菌生产土霉素的能力。

3、如实施例1中“3”所述，发酵链霉菌突变株。

4、如实施例1中“4”所述，检测重组菌的土霉素产量。

分析测定发酵液中土霉素的效价如图6所示，在所述摇瓶条件下，敲入了rgC基因和otrC基因的重组菌的土霉素产量比对照菌株高了约55%。

上述方法中，用于敲入的otrC基因的全序列如下(SEQ ID NO:2)：

ATGACGCGAAAGACGATATCCAACGGCGCGAGGAACGCCGTCGAAGTGCGGGGACTGGTCAAGCACTTCGGCGAGGTGAAGGCCGTGGACGGGGTGGATCTCGATGTGAGGGAAGGCACCGTGCTCGGTGTGCTCGGGCCGACCGGCGCGGCAACACAACGTGGTGCGCTGCCTGCCCACGTTGCTGGTCCGGACGCCGGCAGGCGACCGTGGCGGTTTCAAACGTGGTGCGCCAACCGGCGCGCGTTGCGCCGCACGATCGGCCGTCACCGGCCAGTACGCGTCGGTCGACGAGAAAGCTTCTCCGGCCGCGAGAACCTGTACATGATCGGCCGCCTGCTGGACCTCTCCCGCAAGGACGCCCGCGCGCGGGCCGACGAGCTGCTGGAGCGGTTCTCCCTCACCGAGGCCGCCGGCCGGGCCGCCGCCAAGTACTCCGGCGGTATGCGCCGCCGCCTCGACCTGGCCGCCTCCATGATCGGCAGGCCCGCGGTGCTGTATCTGGACGAGCCGACGACGGGCCTCGACCCCCGCACCCGCAACGAGGTGTGGGACGAGGTCCGCAGCATGGTGCGCGACGGCGCCACGGTCCTGCTCACCACCCAGTACATGGAAGAGGCCGAGCAGCTGGCCCACGAGCTGACGGTCATCGACCGCGGCCGGGTCATCGCCGACGGCAAGGTGGACGAGCTGAAGACCAAGGTCGGCGGCCGTACGCTCCAGATACGCCCGGCGCACGCCGCCGAGCTGGACCGGATGGTCGGCGCCATCGCGCAGGCCGGCCTGGACGGCATCGCGGGCGCCACCGCCGACCACGAGGACGGCGTGGTCAACGTCCCGATCGTCAGCGACGAGCAGCTGTCCGCCGTGGTCGGCATGCTCGGCGAGCGGGGCTTCACGATCTCCGGGCATCAACACCCATCTGCCCAGCTGGACGAGGTGTTCCTGGCCATCACCGGCCAGAAGACCTCGGAGGCCGCCGACGGCGGCCCGCAGGACGGACCGCAGGACCAGCAGGGCGTTCAGGACAAGCAGTACGAGGAGGTTCCGGCATGAGTGCCGCGACGGTGGCGGCGCCGGGCAAGCCGCAGCGGCCGGGTGCCGACGAGGGCCGGATCGGCCTGCGTGCCCATCTGCGTCACACGAGCGCCCTGGTGCGCCGCAACGCGATGCAGATCAAGAACGACCCCGAGTCGATGTTCGACGCCCTGTTGATGCCGATCGTCTTCACGCTGCTGTTCGTGTACGTCTTCGGCGGCGCGATGGGCGGCAGCCTCGGCGGCGACCGCTCCGCGTACGTGAACTACATCATCCCCGGCCTGCTGGCCATGGGCGGCCTGAACATCGCCATGTCGGTCGGCTCCGGCGTCAACGACGACTTCAACAAGGGGGTGATGGACCGCTTCCGCACCATGCCGATAGCCCGCTCCTCGGTGCTGACGGCGAAGATGCTCGTCGAGTCCGGGCGGATGCTGGTCTCCACCGTCATCCTGCTGGTGCTGGCGTTCCTGATCGGCTTCGACCTGAAGACCGGCCCGCTGGAGCTGCTGGCGGCCGTCGCCCTGGCGCTGCTCTTCGGCTCCTCGCTGACCTGGATATTCATGCTGCTGGGCCTGACCATGAAGACGCCGCAGGCGGTGCAGGGCGTCGGCCTTCATGGTATGATGCCGCTGCCCGTCGGCTCCTCCATCTTCGCCCCGCCGACCACGATGCCGGGCTGGATGGAGGCGTTCGCCAAGGTCAACCCGCTGTCGAACCTCGCGGACGCGGCACGGGCNNNGATGAACGGACAGGGCGCCGTCGCCCAGCCGGTGCTGATCACCCTGGCCTGGACCGTCGGCATCACCCTGGTGTTCGCGCCCCTGGCCGTGGCCAAGTTCCGCAAGAAGACCTGA

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

基于代谢调控高产土霉素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。