专利摘要

一种光流体光生物反应器，包括具有输入端的光波导，其特征在于通过在所述光波导中传播的辐射产生的，限制沿着所述光波导外表面的渐逝光场，用于将光输入所述光波导的输入端的装置（means），和基本上设置于所述渐逝场内的所选定的光合微生物。一种光学激发光合微生物，由所述光学激发的光合微生物产生生物燃料、生物燃料前体或生物质的方法，所述方法包括使用来自所述光波导中传播的光辐射的渐逝光场来照射附着在所述波导表面的光合微生物，以及通过所述渐逝光场驱动所述微生物中的光合作用。

权利要求

1.一种光流体光生物反应器，包括：

具有输入端的光波导，其特征在于通过在所述光波导中传播的辐射产生的，限制沿着所述光波导外表面的渐逝光场；

用于将光输入所述光波导的输入端的装置（means）；和

基本上设置于所述渐逝场内的所选定的光合微生物。

2.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述光波导是具有直径d和输入端的无包壳光纤，其中10μm≤d≤100μm。

3.根据权利要求2所述的光生物反应器，其中所述光波导是多模光纤。

4.根据权利要求2所述的光生物反应器，其进一步包括设置于并列式阵列构型内部的多个光波导，并且所述光波导具有中心至中心的波导内部间距D，其中d≤D≤1.5d。

5.根据权利要求4所述的光生物反应器，其进一步包括具有输入端和输出端的光生物反应器外壳，在其内部设置多个光波导，其中所述光生物反应器外壳的特征为通过所述多个光波导周围的空隙空间产生的多个光学上暗的流体通道。

6.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述光波导进一步包括棱镜波导。

7.根据权利要求6所述的光生物反应器，其中所述用于将光输入所述光波导的输入端的装置（means）包括被直接输入至所述棱镜波导的激光输出。

8.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述用于将光输入所述光波导的输入端的装置（means）包括被引导至所述光波导输入端的太阳辐射。

9.根据权利要求5所述的光生物反应器，其进一步包括设置在所述空隙空间的液体微生物营养培养基。

10.根据权利要求5所述的光生物反应器，其进一步包括可操作地连接至所述光生物反应器外壳的控制器。

11.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述光合微生物是细菌和藻类中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的光生物反应器，其中所述细菌是蓝细菌。

13.根据权利要求12所述的光生物反应器，其中所述蓝细菌是聚球藻属（Synechococcus）。

14.根据权利要求13所述的光生物反应器，其中所述蓝细菌是细长聚球藻属（Synechococcus elongatus）。

15.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述光合微生物是基因工程化的、直接生产生物燃料的微生物。

16.根据权利要求1所述的光生物反应器，其进一步包括微流体芯片，多个光波导设置于所述微流体芯片内部或上面。

17.根据权利要求16所述的光生物反应器，其中所述微流体芯片的形式是高长宽比的（薄）片。

18.根据权利要求17所述的光生物反应器，其中所述高长宽比的（薄）片是波纹状的。

19.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述光波导是片状波导。

20.根据权利要求19所述的光生物反应器，其中所述片状波导是波纹状的。

21.根据权利要求1所述的光生物反应器，其中所述选定的光合微生物的形式是所述微生物的吸附单层。

22.根据权利要求1所述的光生物反应器，其进一步包括人造粘合剂，所述人造粘合剂设置于所述波导的外表面和所述选定的光合微生物中间，以使得所述微生物粘附于所述波导的外表面。

23.一种光学激发光合微生物，由所述光学激发的光合微生物生成生物燃料、生物燃料前体或生物质的方法，包括：

提供具有外表面的光波导；

将光辐射输入所述光波导；

在所述光波导中传播所述光辐射；

由所述光波导中传播的光辐射中产生与所述光波导外表面邻近的渐逝光场；

在所述光波导的渐逝光场内提供光合微生物；和

使用所述渐逝光场辐射所述光合微生物的至少一部分类囊体膜来驱动所述微生物中的光合作用。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述提供光波导的步骤进一步包括提供棱镜波导。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述将光辐射输入至光波导的步骤进一步包括以使光全内反射的方式将来自激光的光直接射入棱镜波导。

26.根据权利要求25所述的方法，其进一步包括注入波长范围为600nm≤λ≤700nm的光。

27.根据权利要求23所述的方法，其中在所述光波导的渐逝光场内提供光合成微生物的步骤进一步包括在伸出所述光波导的外表面不超过约5微米（5μm）的区域内提供与所述光波导外表面邻近的所述光合微生物。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述在光波导的渐逝光场内提供光合成微生物的步骤进一步包括在所述光波导的外表面上提供所述微生物的吸附层。

29.根据权利要求23所述的方法，进一步包括：

提供设置于并列式阵列构型内部的多个光波导；

提供具有输入端和输出端的光生物反应器外壳，在所述光生物反应器外壳内部设置多个光波导，其中所述光生物反应器外壳的特征为通过所述多个光波导周围的空隙空间产生的多个光学上暗的流体通道；

在所述多个光学上暗的流体通道内提供微生物营养培养基；和

从所述光生物反应器外壳输出端收获生物燃料、生物燃料前体或生物质。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述提供光合微生物的步骤进一步包括在所述外壳内提供自由浮动的微生物培养基。

31.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括将太阳光辐射输入至所述光波导。

32.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括提供控制器并控制输入至所述光波导的光辐射的参数。

33.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括提供适宜的光合微生物并从所述光生物反应器直接收获生物燃料。

34.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括提供适宜的光合微生物并从所述光生物反应器收获生物燃料前体。

35.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括提供适宜的光合微生物并从所述光生物反应器收获生物质。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请基于2010年11月15日提交的申请号为61/413,685美国临时专利申请，其全部内容通过引用作为依据和并入本申请，并基于35U.S.C.§119(e)特此要求其优先权。

政府资助

不适用。

背景

1.       发明领域

本申请的实施方式一般涉及光生物反应器及其相关光生物反应方法和应用。更具体地，本申请的实施方式针对光流体光生物反应器装置及其相关的方法和应用，其中通过来自于与微生物邻近的波导表面的渐逝辐射场将光传输至光合活性的实体（例如，细菌、藻类或其他光合微生物）。本申请非限制性的示例性应用涉及将所述渐逝辐射传输至所述微生物以直接地或间接地产生燃料、化学物质和/或生物菌体例如但不限于藻类，可以对其进一步处理以产生化学物质例如但不限于燃料。

2.       技术背景

通过光合藻类和蓝细菌的培养将太阳能转化为燃料主要依赖于光传输至微生物。常规的批量混悬液的直接辐射导致在强吸收培养物内不均匀的光分布以及相关的低效率。

对于全球气候变化和化石燃料成本增加的日益关注使得人们在可替代燃料来源上投入了大量的资金并进行了大量的研究。出于这个原因，人们开发了生物能方法以生产燃料如乙醇、甲醇、氢气和柴油。然而，为了与化石燃料竞争，生产生物燃料需要大原料体积的廉价生物质。尽管已对多种原料进行了研究，包括使用过的烹饪用油、粮食作物和生物废料，但是大部分均存在较低的净能量利益、较低的能量密度、较大的足迹需求和/或利用率不足的问题。或者，微藻类，其与更高等的植物相比显示出高生长速率和含油量并且具有在不同环境中生长的能力，人们已将其用于生产生物燃料。特别地，蓝细菌利用太阳能将二氧化碳和水转化成生物燃料，其使得接近碳中和的石油化学替代方案成为可能。

来自蓝细菌的成本效益好的生物燃料的生产与生物反应器内培养物的密度及其总体积直接相关。目前，大体积培养微藻类最简单的策略是与周围空气和阳光接触的开放式跑道样池塘。然而，由于与光线分布不足、温度控制、营养输送、污染和水消耗相关的问题，池塘运作在低细胞密度下进行。因此，池塘策略面临面积生产率差和总体功率密度低的问题。因此，人们设计出对培养环境提供精确控制和维持生长条件的全封闭光生物反应器。但是，开放式和封闭式培养策略的核心问题均为光到微生物有效传输。随着培养物体积和密度的增加，光均匀分布至单个细菌上变得越来越困难。在现有反应器中，暴露表面附近的区域往往过度曝光，结果导致光抑制，但较大的内部区域实际上仍处于黑暗中。必须使用流动的、稀释溶液使细菌循环通过具有可用于生产的光照水平的区域，这对这种技术的培养密度和总功率密度设置了根本的局限。

人们已开发了多种光生物反应器策略，以便通过在更大表面积的空间上稀释光向细胞提供更有效的光分布。一个策略是使用光导将光引导至反应器体积内并随后将光散射至培养基。在我们所报道的方法中使用嵌入培养槽的圆柱状玻璃光分配器来辅助分配光。将从菲涅尔透镜阵列收集的太阳光通过光纤引导至反应器。另一种已报道的方法使用嵌入培养槽的侧光式光纤来改善光传输。另一种方法使用嵌入培养室的光纤，其目标是将从外部太阳光收集器收集到的光散射至培养物。尽管这些早期的研究表明在光生物反应器内增加控制和被辐射的表面积能够提高生产率，但是这些技术均无法避开由伴随对批量培养物直接辐射而产生的过度照射和阴影问题造成的根本局限。

渐逝场是一种近场驻波，其强度展现出与边界间的距离相关的指数衰减，所述边界是波形成的位置。当通过全内反射在介质中移动的波以大于临界角的角度撞击所述边界时，形成了渐逝波。渐逝场现象是本领域所公知的。

鉴于上述已鉴定的和本领域公知的问题和缺陷，本申请提供了解决方案和有利的方法，其将有利于推进本领域和相关技术的状况。

发明概述

本申请的实施方式针对光流体光生物反应器。所述生物反应器包括具有输入端的光波导，其特征为限制沿着所述光波导的外表面的渐逝光场，所述渐逝光场是通过在所述光波导中传播的辐射产生的，以及基本上设置于所述渐逝场内的选定的光合微生物。通过下文的详细描述，可以更加充分地理解所述渐逝场有利地从所述波导伸出一段距离，所述距离与被渐逝场辐射的光合微生物的厚度（即，较小的直径）相当，因此所述微生物可以理解为基本上设置于渐逝场内。根据各种非限制性、示例性的方面：

-所述光波导是具有直径d和输入端的无包壳光纤，其中10μm≤d≤100μm；

-所述光波导是多模光纤；

-所述光生物反应器进一步包括设置于并列式阵列构型内的两个或多个光波导且所述光波导具有中心至中心的波导内部间距D，其中d≤D≤1.5d；

-所述光生物反应器进一步包括具有输入端和输出端的光生物反应器外壳，在其内部设置多个光波导，其中所述光生物反应器外壳的特征为通过多个光波导周围的空隙空间产生的多个光学上暗的流体通道；

-所述光波导进一步包括棱镜波导；

-所述光生物反应器进一步包括用于将光输入光波导的输入端的装置（means）；

-所述用于将光输入光波导的输入端的装置（means）包括被直接输入棱镜波导的激光输出；

-所述用于将光输入光波导的输入端的装置（means）包括被引导至光波导输入端的太阳辐射；

-所述光生物反应器包括设置于光生物反应器空隙空间内的液体微生物营养培养基；

-所述光生物反应器包括可操作性地连接至所述光生物反应器外壳的控制器；

-所述光合微生物是细菌和藻类中的至少一种；

-所述光合微生物是蓝细菌；

-所述蓝细菌是聚球藻属（Synechococcus）；

-所述蓝细菌是细长聚球藻属（Synechococcus elongatus）；

-所述光合微生物是基因工程化的、直接生产生物燃料的微生物；

-所述光生物反应器包括微流体芯片，多个光波导设置于所述微流体芯片内部或上面；

-所述微流体芯片的形式是具有较高长宽比的（薄）片；

-所述具有较高长宽比的（薄）片是波纹状的；

-所述光波导是片状波导；

-所述片状波导是波纹状的；

-所述选定的光合微生物的形式是所述微生物的吸附单层；

-所述光生物反应器包括人造粘合剂，所述人造粘合剂设置于所述波导的外表面和所述选定的光合微生物中间，以使得所述微生物粘附于所述波导的外表面。

本申请的实施方式针对一种光学激发光合微生物，由所述光学激发的光合微生物生成生物燃料、生物燃料前体或生物质的方法。所述方法包括的步骤有：提供具有外表面的光波导；将光辐射输入光波导；在光波导中传输光辐射；由光波导中传输的光辐射产生与光波导外表面邻近的渐逝光场；在所述光波导的渐逝光场内提供光合微生物；和使用渐逝光场辐射所述光合微生物的至少一部分类囊体膜来驱动微生物中的光合作用。根据各种非限制性、示例性方面：

-所述提供光波导的步骤进一步包括提供棱镜波导；

-所述将光辐射输入至光波导的步骤进一步包括以使光全内反射的方式将来自激光的光直接注入棱镜波导；

-注入波长范围为600nm≤λ≤700nm的光；

-所述在光波导的渐逝光场内提供光合成微生物的步骤进一步包括在伸出光波导的外表面不超过约5微米（5μm）的区域内提供与光波导外表面邻近的光合微生物；

-所述在光波导的渐逝光场内提供光合成微生物的步骤进一步包括在光波导的外表面上提供微生物的吸附层；

-提供设置于并列式阵列构型内部的多个光波导；

-提供具有输入端和输出端的光生物反应器外壳，在其内部设置多个光波导，其中所述光生物反应器外壳的特征为通过多个光波导周围的空隙空间产生的多个光学上暗的流体通道；

-在所述多个光学上暗的流体通道内提供微生物营养培养基；和

-从光生物反应器中收获生物燃料、生物燃料前体或生物质；

-所述提供光合微生物的步骤进一步包括在光生物反应器外壳内提供自由浮动的微生物培养基；

-将太阳光辐射输入至光波导；

-提供控制器并控制输入光波导的光辐射的参数；

-提供适宜的光合微生物并从光生物反应器直接收获生物燃料；

-提供适宜的光合微生物并从光生物反应器收获生物燃料前体；

-提供适宜的光合微生物并从光生物反应器收获生物质。

本申请的其他特征和益处将在下文中详细描述，如本申请所描述的根据下述详细的说明书、权利要求书以及附图的描述和认识实施本申请对本领域技术人员将是显而易见的。

应理解，前述的一般性描述和下述的详细描述对本申请而言仅是示例性的，其旨在为本申请所主张的性质和特性的理解提供概述或框架。附图用于进一步理解本申请，其并入和构成本说明书的一部分。附图对本申请的多个实施方式进行了解释，其与说明书一并用于解释本申请的原理和操作。

附图的简要说明

图1为根据本申请的示例性实施方式示意性描述的无包壳光纤形式的光波导阵列和设置于每个光纤外表面上的藻类层的透视图；

图2为根据本申请的示例性实施方式的，图1所示的利用光波导阵列的光生物反应器系统的原理概述图；

图3为根据本申请的示例性实施方式的，图1所示的光波导产生的渐逝场和设置于波导表面上的被渐逝场辐射的细长聚球藻属蓝细菌（藻类）的剖面示意图；

图4为根据本申请的示例性实施方式的，包含具有吸附的光合细菌的光纤阵列以及渐逝场不能透射的黑暗或空隙区域（流体通道）的光生物反应器外壳的俯视示意图；

图5为根据本申请的示例性实施方式的，台式基于光纤的光生物反应器的照片；

图6图示了使用渐逝光场对光合细菌的激发过程和装置；（A）为显示在波导表面的光合细菌渐逝偶合的剖面示意图。如右图中的曲线所示，光强的特征性衰减相当于细胞内径的大小；（B）在棱镜光波导表面产生渐逝波的实验设置的示意图。如图所示，输入光束是高斯型的，全内反射产生的渐逝场是椭圆形的；

图7A：直接辐射产生的蓝细菌生长图样的图像，其显示了光抑制（中心）、生长、生长可忽略区域周围的不同区域；B：径向生长强度和激光光强度的相关性图。超过1.2mm的远端峰是人为的图像设置其不对应于生长。根据本申请的示例性方面，生长区域的FWHM阈值对应于辐射光强66W/m²和12W/m²，其分别为上限和下限；

图8图示了通过已测量的细长聚球藻属培养物的吸收绘制的日光光谱功率分布和PSII吸收光谱。根据本申请的示例性方面，当通过所示的吸收光谱来联系时，在图7的实验中测量的在λ=633nm处的光抑制阈值（66W/m²）与既定的白光暴露光抑制强度具有相关性；

图9图示了在渐逝光场中的理论光强度分布，以及相应的预计生长图样：A：透射深度作为针对玻璃培养基界面的入射激光角度函数的图。将透射深度定义为场强为表面处的场强下降e^-2或者87%的位置。虚线表示在θ_i2=θ_C+0.074°时透射深度为1μm，插图显示了供参考的聚球藻属的几何形状；B：渐逝场的表面图，距表面1μm，基于所测量的辐射光的阈值，使用功率强度作图以表明光抑制、生长和生长可忽略的区域。根据（绿色）阴影区域2中的功率光谱的有效部分所示，基于这些值预计生长为椭圆形图样。根据本申请的示例性方面，垂直线图表明有效的光强度随着距离而衰减；以及

图10图示了使用渐逝光的光合细菌的生长：A-C：在玻璃培养基表面入射光功率分别为1mW、0.5mW和0.25mW的渐逝激发产生的蓝细菌生长图样图。所述的椭圆形生长图样与渐逝场的几何形状对应，并显示了光抑制（中心）和生长、生长可忽略区域周围的不同区域；D-F：各光功率下绘有相应的渐逝场强的，在表面上，距表面上方1μm，以及平均5μm处的对应生长图。通过直接辐射实验确定的功率范围（图7）以红色条带表示供参考。观察到表明生长起始的半峰宽位于1μm的79±10W/m²强度水平处以及位于平均5μm的光强度60±8W/m²处。根据本申请的示例性方面，这些值涵盖了在该波长下为辐射光而确定的66W/m²的阈值。

发明详述

可以参考附图来理解本发明的一些实施方式，其中相同的数字符号代表相同的或功能相似的部件。

图1示例性地图示了以具有直径d，其中10μm≤d≤100μm的无包壳光纤101为形式的光波导阵列100和设置于各光纤外表面上的藻类单层151的透视图。通过在光纤中传输光，在光纤的表面产生指数形式衰减的光场（称为渐逝场）303。图3是剖面示意图，其显示了渐逝场303，和被渐逝场辐射的吸附在波导101表面107上的细长聚球藻属蓝细菌（藻类）351。在非限制性的替代方面，可以使用适宜的粘合材料将细菌人为地附着于波导表面。

图2图示了光生物反应器系统200，在其中收集太阳辐射（202）并将其连接到光纤，然后使其通过反应器外壳207内的反应器体积。如插图212所示，蓝细菌的光合机制包含于蓝细菌周围的类囊体膜（～100nm）中。渐逝场伸出无包壳纤维表面约1μm（图3）并向细菌提供适宜的光强，I_O（参见214，图2）。如插图214所示，由于渐逝场为指数形式的衰减，因而黑暗区域218出现在光纤之间的间隙性空隙，其作为流体通道（亦参见图4）。可以使用这些流体通道向细菌运输CO₂和培养基并收集产生的生物燃料。使用渐逝场允许细菌对光的最佳利用并总体增强反应器的体积利用率。

图4显示了光生物反应器外壳207的俯视示意图，其含有具有吸附光合细菌151的光纤101阵列以及黑暗或空隙区域（流体通道）218，渐逝场303不在其中透射。所述光纤具有中心至中心的波导内间距D，其中d≤D≤1.5d。

图2进一步图示了控制元件237，其能够对参数进行精确调节使得细菌以最优条件暴露，所述参数包括，但不限于波长、强度和在光纤中的光工作周期。

对于将CO₂直接转化为生物燃料而言，由UCLA生产的经基因修饰的细长聚球藻属SA665显示出将CO₂直接转化为异丁醛的能力，可以将其转化为异丁醇（汽油替代品），其依面积的效率与当前的生物燃料生产策略相当或更优。

对图示的光流体生物反应器架构的可实现密度的评估可用于与当前的系统进行比较。如图4所示，光纤的六棱形包装将为产生燃料的细长聚球藻属提供吸附层，所述细长聚球藻属占总体积的10%，而其余90%的体积为光和液体。占反应器体积10%的活性细菌的密度比本领域公知的已有的管式光生物反应器多4500倍并且比可比的池塘反应器大八个数量级。根据本申请如图5所示，该比例表示单层5680m²管式设备的输出能够与桌面大小（2.5m³）的光流体反应器500-1相匹配。尽管此类反应器需要单独的光收集器和相应的辐射区域，反应器与收集的分离还提供了将光谱调制成光合活性范围（400-700nm）的功能；在光合活性最佳频率（一般为100Hz）循环光；根据需要在赤道区域以外的地区以高角度收集入射太阳光；以及控制反应器温度使得在燃料需求高的气候更冷的区域易于操作，如北美和欧洲。

具体实施方式

根据另一个示例性实施方式及其方面，图6A和6B分别图示了细菌651的渐逝激发过程600-1和用于产生渐逝激发场303的基于棱镜波导的光生物反应器600-2。根据图6B中更特定的图示，其显示了棱镜波导627的剖面图。由HeNe激光605提供的单色红（λ=633nm）光606直接射入棱镜波导的侧面。在玻片642的界面表面617产生渐逝场303，其中的光为全内反射。当光以大于临界角即θ_i2>θ_c的角度入射到玻璃培养基界面时，产生全内反射和相应的渐逝场。如图6B中的插图653所示，反射圆形剖面的输入光束在棱镜表面反射点位置产生椭圆形的渐逝场图。本领域技术人员应理解还有产生渐逝场的替代方法；但是，所示的方法简单且提供了能够用理论以所有三维方式来可靠地描述的渐逝光场分布。

在图6B的实验装置中，通过围绕聚（异丁烯酸甲酯）（PMMA）原模浇铸PDMS（Sylgard(R)184Elastomer试剂盒，Dow Corning）制备容纳细菌培养溶液的腔，以产生直径为10mm和深度为4.75mm的圆柱形腔（0.373mL）。使用氧等离子体处理将这些培养腔结合于1mm厚的BK7玻璃显微镜载玻片的表面。

使用野生型细长聚球藻属（ATCC33912）蓝细菌的细胞演示本申请。在最佳条件32-36°C和使用荧光灯的连续辐射50-75μE·m^-2·s^-1下培养细胞。通过使用新鲜的BG11蓝细菌生长培养基（Sigma Aldrich C3061）规律性稀释培养物，在恒定的细胞密度（在指数生长期）下保存储用培养物，以便在750nm（OD₇₅₀）维持恒定的光密度0.2。使用宽光谱卤素光源（Thorlabs OSL1）和分光仪（Edmond brc112e）测定OD₇₅₀并归一化至新鲜BG11生长培养基的OD₇₅₀。在我们的实验中使用了该培养物的样品。

一旦安装至玻璃板上并接种（通过注射器注射进行盲端填充），将培养物放置在直角BK7棱镜（Thorlabs PS908L-A）的顶面，如图6所示。使用指数匹配的浸油（Leica11513 859）达到光学接触。从氦氖激光（632.8nm Thorlabs HRR020）发出的光与腔室连接，通过安装在精确旋转支架（Thorlabs CRM1P；未显示）上的宽带电介质镜（Thorlabs CM1-4E；未显示）对其进行反射使其朝向棱镜。通过改变旋转支架上镜的角度来调整在玻璃介质表面上的入射角。将棱镜/培养物组件安装在滑动台上（未显示），其允许入射角变化时，激光束保持在培养腔室的中心。将棱镜组件对齐，以使得离开棱镜的光束反射不通过培养物。这确保了细菌的光激发完全是由于渐逝场产生的，其中光束在玻璃-细菌培养物界面处全内反射。

使用光电二极管功率传感器（Thorlabs S120C）测量进入和输出棱镜的激光束功率，在实验开始时测定一次，在结束时测定一次。整个实验装置通过使用由5mm厚的硬板（Thorlabs TB4）制成的外壳进行光学隔离。在渐逝生长实验期间使用950W的外壳风扇加热器（CR030599,OMEGA Engineering Inc.,USA）将这些腔室保持在提供最佳细胞生长速率的恒定温度32-36°C下。

实验结果和讨论

首先将细胞培养物置于直接激光暴露下，以确认使用单色红光（λ=633nm）对细长聚球藻属生长的效果，并测量对直接辐射光的细胞应答。使来自氦氖（HeNe）激光的光束通过垂直于底部玻片的培养腔（图6B），让培养物生长72小时（在上文所述的条件下）。在不同的激光功率下进行这种类型的直接辐射实验，得到与图7所示的那些一致的结果。图7A显示了典型的生长环图样700-1，根据所示对三个不同强度的区域712（中心）、714（中间）、716（外部）中生长的作用是显而易见的。存在在中心的脱色（在彩色视图中为橙黄色）区域712、生长区域714（在彩色视图中为绿色）和生长可忽略的外部区域716。为了在径向图中对生长进行定量，过滤图中的绿色强度并在圆周内进行积分。利用图7B中的激光强度图绘制所得到的径向生长图。利用生长位置半峰宽（FWHM）和入射光功率图的交叉点确定区域之间的电场强度阈值（低和高）。结果得到的阈值为66W/m²和12W/m²（如图7B生长峰内的矩形所示），其表明在λ=633nm的直接辐射下细长聚球藻属可生产的生长强度。

为了将这些直接辐射实验的结果与已知的细长聚球藻属的生长特性联系起来需要测定在λ=633nm下红光的日光等价功率。为了做到这一点，我们将日光的辐射量测量结果与文献中公开的最佳强度范围进行了比较。在较高的光强下，辐射诱发细胞光系统的损害的速率超过了细胞自身的修复能力，结果使得光合成活性急剧下降，或导致光抑制。据报道接近饱和强度的高光条件为在光合活性辐射（PAR）波长范围（400-700nm）内光合光子通量密度（PPFD）相当于150μE·m^-2·s^-1至500μE·m^-2·s^-1，或全日光的10-25%。为了将光合光子通量密度转化为辐射量单位（即，W/m²），在635nm下测量全日光的光功率为1.37W/m²（48°25′43”N，123°21′56”W）。然后利用该设置点和CIE标准光源D65定义的相对光谱功率分布来计算正常日光806的光谱功率分布，如图8所示。经计算光合活化辐射的总全日光辐射为472W/m²，其对应的光合光子通量密度为2137μE·m^-2·s^-1。通过QSR-2100（Biospherical Instruments Inc.）光度计测量2100-2300μE·m^-2·s^-1独立地对该值进行了确证。同时参见图8，光系统II（Sugiura M&Inoue Y(1999)Highly Purified Thermo-Stable Oxygen-Evolving Photosystem II Core Complex from the Thermophilic Cyanobacterium Synechococcus elongatus Having His-Tagged CP43,Plant Cell Physiol.40(12):1219-1231）的吸收光谱804。光系统II（PSII）是光合成途径中对光诱导的损伤最敏感的一环并且其是在高光环境中失败的最主要原因。在样品培养物802（OD₇₅₀为0.37）已测量的吸收光谱中也能够观察到已公开的吸收光谱的特征形状，如图8所示最明显的是位于～450nm、630nm和670nm的峰。光谱红光区域的吸收对光合作用的影响最为显著，而更低波长的吸收是由于不直接涉及电子传输过程的分子的存在。在正常日光条件下，细长聚球藻属PSII吸收30W/m²的红光（600nm<λ<700nm），其通过利用PSII的吸收光谱对日光光谱功率分布加权和对光谱的红光部分积分来确定。为了使用单色激光在λ=633nm下传送等量能量，需要考虑PSII在该波长的吸收能力以确定适宜的相应激光功率。在这种情况下，PSII吸收约13%的633nm光，其需要230W/m²的激光功率以模拟全日光条件。在直接辐射实验中测量的阈值为66W/m²，因此提示在严重的光抑制发生前，针对我们的培养物的上限为～28%的全日光。该值与文献中报道的被认为是高光条件的上限非常一致。

在表面平面内和依培养基内部深度，渐逝光场的光强度分布都不同。应用已建立的理论描述渐逝电场强度并用于联系场强度和实验生长结果之间的关系。图9A显示了作为入射角（x轴）函数的渐逝光场的透射深度904（y轴）。在此处，将透射深度定量为场强为表面处的峰强度下降e^-2，或者87%的位置。细长聚球藻属的几何形状见图9A中的插图（909）以供参考，虚线910表示透射深度为约1μm，其出现在入射角为θ_i2=θ_C+0.074°时。根据所示，渐逝场的透射深度是入射角的强函数，其值对应于细菌的固有长度级别，这种情况仅在入射角接近临界角（超过临界角0.5°以下）时出现。

图9B显示了在平面上的预计渐逝场强度，和针对在λ=633nm的0.5mm直径高斯入射光束的特征性椭圆形状。其所表明的强度值与距离玻璃-培养基界面1μm处的渐逝光强度相对应，其入射角为62°（θ_i2=θ_c+0.5°）以及透射深度为400nm。基于上述针对本申请使用的红光测定的光强度阈值（66W/m²，在633nm处），可以基于计算得到的渐逝场强度预测预期的生长区域。如图9B所示，在区域1中渐逝场强度超出了10%日光的红色组分，预计在辐射光系统中将导致光抑制。如区域2（在彩色图中的绿色阴影）中功率光谱的有效部分所示，该分析将预示生长的椭圆环图样。垂直线图表明有效的光强度随距离而衰减。预计在内部边界附近的生长相对较强，此处有效的光强度较高，生长速率将随光强度向外衰减。尽管生长图内边缘的锐度是人为的阈值边界条件，但是该模型对在这种渐逝场中培养的光合微生物提供了生长的预测图样。

使用图6B中所示的实验装置对培养物进行基于渐逝光的激发。使用三种激光功率（1mW、0.5mW、0.25mW）和入射激光角62°（θ_i2=θ_c+0.5°），并且通过测量输出强度以保证全内反射。各实验均进行三次，将培养物暴露于渐逝场72小时。图10A-C显示了在玻璃-培养基界面响应渐逝光场的大量的细菌生长。生长图样显示为椭圆形，反映了渐逝光场强度，并描绘了三个特征区域（光抑制、生长、生长可忽略），为在渐逝光下的生长起始提供了数据。随着激光功率的降低（图10A至C），径向分布向内部移动，这与光强度图的变化一致。为确定所观察到的生长与渐逝场强度的关系，过滤图像中的绿色强度，沿光束轴测量并积分以提供生长图。图10D-F显示了各光功率下绘有对应渐逝场强的，在表面上，距表面上方1μm和平均5μm位置处的生长图。由于渐逝场快速衰减的性质，表面强度大大高于距表面上1μm处的值，其还与前5μm处的平均强度接近（1μm和5μm均为这种棒状细菌的相关长度级别）。在直接辐射实验中确定的功率范围以红带1090表示以供参考。生长起始发生在径向位置，所述径向位置的渐逝光强度——根据1μm和5μm的平均值的测定结果，下降至与阈值66W/m²对应的值，其已在直接辐射实验中确认。随着总光强度的降低（图10A-C和D-F），起始强度的位置向内移动，与预计的功率曲线保持一致。特别地，观察到表明生长起始的半峰宽位于1μm的79±10W/m²强度水平处以及位于平均5μm的光强度60±8W/m²处。这些结果均证明了使用渐逝光的光合细菌生长，并提供了在该独特光场中成功培养光合细菌的度量。

图10所示的生长图样显示了某些顺着光束方向的偏离，即生长强度随着与激光源间距离而增加。当细胞与表面附近的渐逝场发生相互作用时，一些光被吸收和利用，而一些光被散射。在光束方向上，光将优先被散射。使用本实验装置时，在环形图样的顺着光束方向的一侧，该散射光将提供更高的生长速率和更厚的生物膜。在大多数情况情况下均观察到这种作用，如图10所示，在0.25mW、0.50mW、1.0mW的情况下，顺着光束方向的生长偏离分别为1%、8%和15%。尽管在各试验之间这种偏离的程度不同，在某些试验中可以忽略不计，甚至是少量逆着光束的偏离，该作用一般较小且在所有情况下均小于15%。但是顺着光束偏离和二次散射作用可能影响生长，生长图样的相对对称表明顺着光束的散射作用的影响较小。

使用超过临界角更大角度（θ_C<θ_i2<θ_C+5）的入射光研究光透射深度的附加作用。但是，在角度超过临界角0.5°时（如图10），仅观察到了淡淡的生长环。我们将在更大的角度下生长不足归因于透射深度的改变，其随着入射角的增加而迅速缩小，如图9A所示。特别地，仅在角度小于θ_C+0.074°时透射深度对应于棒状细菌的较小尺寸（1μm）。这样，这些结果与所观察到的渐逝生长图样一致，其中仅当偏离临界值较小角度时透射深度与细胞直径接近。

这样我们证明了基于渐逝光的方法，以便在用于光合作用的蓝细菌的长度级别上传输光。除了演示在渐逝场中细菌的培养以外，对生长图样的分析为从已知的辐射光暴露中确定适宜的基于渐逝光的暴露条件提供了指导。可以基于这些关于光透射深度和光密度的度量对生长进行预测。在光生物反应器技术中，这种光分布的方法不同于常规的批量辐射方法，其提供了一种控制传输至个体细胞而非批量培养物的能量的方法。基于所述渐逝光传输方法的光生物反应器架构可以具有多种形式。例如，一种方法可以在反应器中，所述反应器具有置于大培养基容器中的高密度细菌吸附纤维网或织物网，利用成本较低和相对普遍的光纤光技术。伴随对用于直接生产燃料如乙醇或异丁醛/异丁醇方面的蓝细菌的基因修饰的最新进展，此类策略为太阳能燃料生产带来了新的机遇。

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光流体光生物反应器装置、方法和应用专利购买费用说明

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