专利摘要

本发明公开了一种以DMA为底物，利用酶催化合成DMAPP的方法，特别涉及具有催化合成DMAPP功能的酶及其应用。所述酶包括选自以下(a)～(c)所述的多肽:(a)由SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化DMA合成DMAPP功能由(a)衍生的多肽；(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有催化DMA合成DMAPP功能的多肽。本发明还涉及对该酶进行分子改造，提高酶的比活力，建立了一种原料价格低廉、合成途径全新的异戊烯二磷酸生物合成方法。

权利要求

1.一种具有催化DMA合成DMAPP功能的酶，其特征在于，所述酶是对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行定点突变改造得到的，所改造的突变位点为第72位的缬氨酸，所述第72位的缬氨酸突变为苏氨酸或异亮氨酸；

或第139位的异亮氨酸，所述第139位的异亮氨酸突变为缬氨酸；

或第140位的酪氨酸，所述第140位的酪氨酸突变为亮氨酸或缬氨酸；

或第203位的赖氨酸，所述第203位的赖氨酸突变为甘氨酸；

或第72位的缬氨酸和第140位的酪氨酸，所述第72位的缬氨酸突变为异亮氨酸，且第140位的酪氨酸突变为缬氨酸；

或第140位的酪氨酸和第203位的赖氨酸，所述第140位的酪氨酸突变为缬氨酸，且第203位的赖氨酸突变为甘氨酸；

或第72位的缬氨酸和第140位的酪氨酸和第203位的赖氨酸，所述第72位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第140位的酪氨酸突变为缬氨酸，且第203位的赖氨酸突变为甘氨酸；

或第72位的缬氨酸和第203位的赖氨酸，所述第72位的缬氨酸突变为异亮氨酸，且第203位的赖氨酸突变为甘氨酸。

2.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1中所述酶的多核苷酸。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种重组宿主细胞，其特征在于，转入了权利要求3所述的重组载体。

5.利用权利要求1所述具有催化DMA合成DMAPP功能的酶合成DMAPP的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：合成具有编码催化DMA合成DMAPP功能的酶的基因，并将其构建在载体上；

步骤二：将重组载体在宿主细胞中表达；

步骤三：从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化DMA合成DMAPP功能的酶；

步骤四：对步骤三得到的酶进行定点突变，以提高酶的比活力；

步骤五：以DMA为底物，进行磷酸化反应，利用步骤四得到的酶催化DMA磷酸化生成DMAPP。

说明书

技术领域

本专利属于生物技术领域，涉及一种以异戊烯醇(3-Methyl-2-buten-1-ol，DMA)为底物，利用酶催化合成异戊烯二磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)的方法，特别涉及具有催化合成DMAPP功能的酶的制备、应用及定点突变。

背景技术

异戊二烯是合成橡胶的重要单体，其用量占异戊二烯总产量的95％，主要用于合成异戊橡胶，其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶的第三位。其次，异戊二烯也是合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能，但用量很少，异戊二烯还用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶，还可用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。

DMAPP是生物合成异戊二烯途径中重要的前体物质，本专利描述了一种以DMA为底物并直接利用一个酶对其进行两步磷酸化来合成DMAPP的方法。目前，自然界主要有两条途径用以DMAPP的生物合成：甲羟戊酸代谢途径和4-磷酸甲基赤藓糖醇代谢途径。前者主要存在于真核细胞和植物的细胞质中，而后者主要位于真细菌，绿藻和高等植物的叶绿体中。随着越来越多古细菌基因组的测序和注释，也发现有类似甲羟戊酸的合成途径。异戊二烯的聚合便生成了萜类化合物。

萜类化合物是指具有(C5H8)n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，萜类化合物在自然界中广泛存在，高等植物、真菌、微生物、昆虫、以及海洋生物，都有萜类成分的存在。已知道的萜类化合物22000多种，萜类化合物是中草药中的一类比较重要的化合物，现代药理学研究表明，萜类成分中有些具有生理活性且具有药用价值，如龙脑，人参皂干，植物胡萝卜素等，他们具有抗菌消炎、降血脂、降血压、促进肝细胞再生等活性。同时它们也是一类重要的天然香料，是化妆品和食品工业不可缺少的原料。

发明内容

本专利的目的是提供一种具有催化DMA合成DMAPP功能的酶。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：

一种具有催化DMA合成DMAPP功能的酶IPK,包括选自以下(a)～(c)所述的多肽:

(a)由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化DMA合成DMAPP功能由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有催化DMA合成DMAPP功能的多肽。

本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸，选自如下(d)～(f)：

(d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸；

(e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

(f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化DMA合成DMAPP功能的多肽的多核苷酸。

可选的，为(d)编码的多核苷酸为ipk基因，用于编码IPK，其基因序列为SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中所示序列，分别来自于Thermoplasma acidophilum，Methanothermobacter thermoautotrophicum，Methanocaldococcus jannaschii。

优选的，不改变IPK氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，得到的基因序列为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ IDNO.9中所示序列。核苷酸序列SEQ ID NO:7为序列表中SEQ ID NO:4所示的DNA片段优化后核苷酸序列；核苷酸序列SEQ ID NO:8为序列表中SEQ ID NO:5所示的DNA片段优化后核苷酸序列；核苷酸序列SEQ ID NO:9为序列表中SEQ ID NO:6所示的DNA片段优化后核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种含有编码IPK多肽多核苷酸的重组载体。

所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。

优选地，所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示DNA片段后，得到的重组质粒(pET-28a-ipk)。可选的，克隆位点为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。

本发明的另一目的在于提供一种转入了含有编码IPK多肽多核苷酸的重组载体的重组宿主细胞。

所述重组宿主细胞包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选的为大肠杆菌、酵母。

本发明的目的还在于提供一种由IPK多肽经过定点突变改造形成的比活力高的多肽，其特征在于：是对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行定点突变改造得到的，所改造的突变位点包括第44位的甘氨酸、第72位的缬氨酸、第129位的缬氨酸、第139位的异亮氨酸、第140位的酪氨酸、第203位的赖氨酸中的任一个，或它们的任意组合。

优选的，所改造的突变位点为第72位的缬氨酸和第140位的酪氨酸，或第72位的缬氨酸和第203位的赖氨酸，或第140位的酪氨酸或第203位的赖氨酸，或第72位的缬氨酸和第140位的酪氨酸和第203位的赖氨酸。

进一步的，第44位的甘氨酸突变为丙氨酸；第72位的缬氨酸突变为苏氨酸或异亮氨酸；第129位的缬氨酸突变为丙氨酸；第139位的异亮氨酸突变为缬氨酸；第140位的酪氨酸突变为丙氨酸亮氨酸或缬氨酸；第203位的赖氨酸突变为丙氨酸。

本发明的目的还在于提供一种利用具有催化DMA合成DMAPP功能的酶合成DMAPP的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：合成具有编码催化DMA合成DMAPP功能的酶的基因，并将其构建在载体上；

步骤二：将该重组载体在宿主细胞中表达；

步骤三：从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化DMA合成DMAPP功能的酶；

步骤四：对步骤三得到的酶进行定点突变，以提高酶的比活力；

步骤五：以DMA为底物，进行磷酸化反应，利用步骤四得到的酶催化DMA磷酸化生成DMAPP。

本发明建立了全新的以DMA为底物，通过酶催化生物合成DMAPP的方法，并在此基础之上，对该酶进行分子改造，提高酶的比活力，建立了一种原料价格低廉、合成途径全新的异戊烯二磷酸生物合成方法。

附图说明：

图1为重组质粒pET-28a-ipk-ta的质粒图谱示意图。

图2为实施例3和实施例7中提取蛋白的12％SDS-PAGE电泳图

图3为IPK-TA及突变体活性检测图

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。

实施例1 ipk基因合成、载体构建

ipk基因种属来源为Thermoplasma acidophilum，其基因序列如SEQ ID NO.4所示，在不改变IPK氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如SEQ ID NO.7所示。

将该基因序列直接合成在pET-28a载体(Novagen，Kan+，见图1)上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒命名为pET-28a-ipk-ta。

实施例2 基因的表达

为了体外检测IPK酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将上述重组质粒转入BL21(DE3)中，采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(100mM Tris-HCl，20mM MgCl2，pH7.5)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

实施例3 蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL 50mM咪唑蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用20mL100mM，200mM，300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白IPK-TA。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为4mg/mL。

实施例4 目标产物DMAPP的检测

(1)异戊烯二磷酸(DMAPP)合成反应方程式如下：

(2)检测方法

体外检测-酶偶联法

对照样品溶液的制备：对照样品反应体系(200μL)如下：25U丙酮酸激酶，25U乳酸脱氢酶，2mM PEP，0.2mM NADH，2mM ATP，50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM KCl，8mM MgSO4，0.5mM DMA

待测样品溶液的制备：待测样品反应体系(200μL)如下：25U丙酮酸激酶，25U乳酸脱氢酶，2mM PEP，0.2mM NADH，2mM ATP，50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM KCl，8mM MgSO4，0.5mM DMA，1mg/ml IPK-TA。

在340nm光吸收值下检测对照样品溶液和待测样品溶液，通过NADH的减少量分析反应消耗的DMA的量，得到的结果见图3。

实施例5 定点突变

对重组质粒pET-28a-ipk-ta进行定点突变。定点突变采用Fast site-directMutagenesis System kit(购自Transgene，FM111-02)试剂盒方法。

将214位起密码子GTT改造为ACC,即将第72位的缬氨酸突变为苏氨酸，简写为V72T。

(1)引物设计

S：5’-GTTACTCTATCACCCACCGTGACATGGAAAACCTGG-3’

AS：5’-GGTGATAGAGTAACCGATAGAAGAACGCGGGT-3’

引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。

引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约在30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。

突变引物：突变位点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。

退火温度的计算不包括突变碱基。

(2)PCR体系(50ul)：

PCR循环：

(3)电泳检测

取10ul PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)PCR产物的消化

加1ul DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。

(5)转化

a.加入3ul DMT酶消化产物于50ul DMT感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。

b.42℃准确热激45s,立即置于冰上2min。

c.加入200ul平衡至室温的LB培养基，220rpm/min，37℃培养1h。

d.取200ul菌液涂LB，100mg/ml Kan+平板，37℃培养箱过夜培养。

(6)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6。

(7)提质粒，并将该质粒命名为ipk-ta-v72t，送去测序。经测序验证，214位的GTT突变为ACC，即Val突变为Thr。

实施例6 突变体蛋白的表达

(1)将实施例5中(7)所提质粒转入BL21(DE3)中，采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(100mM Tris-HCl，20mM MgCl2，pH7.5)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

实施例7 突变体蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清、制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL 50mM咪唑蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用20mL100mM，200mM，300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次；得到纯化蛋白IPK-TA-V72T。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为4mg/mL。

实施例8 利用突变后的蛋白对目标产物DMAPP的检测

(1)异戊烯二磷酸(DMAPP)合成反应方程式如下：

(2)检测方法

体外检测-酶偶联法

对照样品溶液的制备：对照样品反应体系(200μL)如下：25U丙酮酸激酶，25U乳酸脱氢酶，2mM PEP，0.2mM NADH，2mM ATP，50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM KCl，8mM MgSO4，0.5mM DMA

待测样品溶液的制备：待测样品反应体系(200μL)如下：25U丙酮酸激酶，25U乳酸脱氢酶，2mM PEP，0.2mM NADH，2mM ATP，50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM KCl，8mM MgSO4，0.5mM DMA，1mg/ml IPK-TA-V72T。

在340nm光吸收值下检测对照样品溶液和待测样品溶液，通过NADH的减少量分析反应消耗的DMA的量，检测结果见图3。

其他突变位点及其引物设计如下：

(1)G44A：

S：5’-TTTGCGTTGTTCACGGTGCTGGTTCTTTCG-3’

AS：5’-AGCACCGTGAACAACGCAAACCAGGTCTTC-3’

(2)V72I：

S：5’-TTCTATCGGTTACTCTATCATTCACCGTGAC-3’

AS：5’-AATGATAGAGTAACCGATAGAAGAACGCGG-3’

(3)V129A：

S：5’-GTTTCTTACGGTGACGCATACATCAAAGACGAACAC-3’

AS：5’-TGCGTCACCGTAAGAAACCGGAACGAAAC-3’

(4)Y140L：

S：5’-CACTCTTACGGTATCCTGTCTGGTGACGACATCA-3’

AS：5’-CAGGATACCGTAAGAGTGTTCGTCTTTGATGTAA-3’

(5)Y140V：:

S：5’-CACTCTTACGGTATCGTTTCTGGTGACGAC-3’

AS：5’-AACGATACCGTAAGAGTGTTCGTCTTTGATGTA-3’

(6)I139V：

S：5’-AAGACGAACACTCTTACGGTGTGTACTCTGGTGA-3’

AS：5’-CACACCGTAAGAGTGTTCGTCTTTGATGTAA-3’

(7)K203G：

S：5’-TTACCGGTGGTATCGGTGGTAAATTCGAATC-3’

AS：5’-ACCACCGATACCACCGGTAACGTCGTTCTGA-3’

(8)K203A：

S：5’-TACCGGTGGTATCGGTGCAAAATTCGAATC-3’

AS：5’-TGCACCGATACCACCGGTAACGTCGTTCTG-3’

其蛋白的提取纯化方法同实施例5-8，活性检测结果见图3。

实施事例9累加突变

根据活性检测的结果，选取活性较高的突变位点V72I，Y140V，K203G进行突变的累加。方法如下：

例1：V72I+Y140V

以已经经过测序验证的质粒V72I为模板，并以Y140V的引物为引物进行累加突变的PCR。

(1)PCR体系(50ul)：

PCR循环：

(2)电泳检测

取10ul PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)PCR产物的消化

加1ul DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。

(4)转化

a.加入3ul DMT酶消化产物于50ul DMT感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。

b.42℃准确热激45s,立即置于冰上2min。

c.加入200ul平衡至室温的LB培养基，220rpm/min，37℃培养1h。

d.取200ul菌液涂LB，100mg/ml Kan+平板，37℃培养箱过夜培养。

(5)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD600为0.6。

(6)提质粒，并将该质粒命名为ipk-ta-v72t-y140v，送去测序。经测序验证，214位的GTT突变为ACC，即Val突变为Thr，418位ATC突变为GTT，即Tyr突变为Val。

V72I+K203G，Y140V+K203G，V72I+Y140V+K203G的突变累加方法同实施例9。蛋白的提取和纯化同实施例6-8。

各中突变位点的IPK酶的活性检测数据如下表所示：

一种具有催化DMA合成DMAPP功能的酶及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。