专利摘要

本发明涉及从中国南海黑乳海参共附生真菌Dendrodochium.sp.中分离到的15种新的具有抗肿瘤和抗菌活性的十二元环内酯类化合物dendrochliodsA～O。本发明还提供了这15中化合物的用途。本发明优点在于：经体外抗肿瘤和体外抗菌活性实验，本发明化合物对人肺癌细胞、人结肠癌细胞和人骨肉瘤细胞等多种肿瘤细胞有明显抑制作用，对假丝酵母菌、丝状真菌以及大肠杆菌等有潜在的抗真菌和细菌活性，因此可用于制备抗肿瘤或抗菌药物；本发明为研制新的抗肿瘤或抗菌药物提供了先导化合物，有利于开发利用海洋药用资源。

权利要求

1.十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O，其特征在于，所述的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O具有如下化学结构通式：

所述的化合物的基团搭配分别如下所示：

。

2.根据权利要求1所述的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肺癌、抗结肠癌或抗骨肉瘤的药物。

4.根据权利要求1所述的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O在制备抗菌药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物是抗真菌或细菌的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的真菌是花药黑粉菌或壳针孢叶枯病菌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细菌是大肠杆菌或巨大芽孢杆菌。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是从中国南海黑乳海参共附生真菌Dendrodochium.sp.中分离到的15种新的具有抗肿瘤和抗菌活性的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O及其应用。 

背景技术

到目前为止，国内外对海参的内生真菌的研究鲜见报道。国际上仅有俄罗斯科学院远东分院太平洋生物化学研究所先后从海参Eupentacta fraudatrix的附生真菌Acremonium striatisporum中分离得到九个二萜皂苷类次生代谢产物，分别是virescenosides M、N、O、P、Q、R、S、T和U，药理实验研究表明，这些化合物具有很好的细胞毒活性。而国内对此方面的研究报道比较少，且发现的化合物也多为比较常见的结构。夏雪奎等从海参的内生真菌HS_1 Epicoccum sp. 中分离得到四个次生代谢产物：3，4-二氢-8-甲氧基-3，5- 二甲基-1H-2-苯吡喃、3，4-二氢-8-羟基-3-甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮、过氧麦角甾醇和丁二酸；刘昌衡等对黄海和渤海交汇海域的刺参进行了采集，并对共生真菌进行了分离，得到菌株HS_3 Alternaria.sp.，通过发酵培养，分离纯化得到4个代谢产物，分别为：1-羟基-3-甲基-9, 10-二酮蒽醌、大黄酚、sterigmatocystin、脑苷酯类化合物，其中sterigmatocystin具有细胞毒和致癌物质。 

目前对于Dendrodochium.sp次级代谢产物的研究少见报道，但是其宿主主要还是陆生植物，Sheo B等从哥斯达黎加州奥撒半岛采集的枯叶中分离出Dendrodochium sp. (MF6888)，并利用重组HIV-1整合酶对其次级代谢产物进行活性筛选，从中活性部位中分离得出 Integramides A 和B 两个新型的富含16个氨基酸的线性多肽。M. Gennaro等在橡树中分离出了内生真菌 Dendrodochium.sp，并发现其较多的存在于橡树的的健康嫩枝中，而枯萎的枝叶中少见。Phialemonium.sp从葡萄酒橡木桶中发现，研究表明此种内生真菌的代谢物具有提高葡萄酒品质的特点。 

目前对于十二元大环内酯类化合物的报道较少，仅有从天然产物中分离得到此类化合物9个和合成此类化合物5个，共14个十二元大环内酯类化合物。Raquel Jadulco等从海绵的内生真菌Cladosporium herbarum.sp.中分离得到化合物pandangolide 1、2、3、4。2005年，Shiri Gesner等从海绵的内生真菌Cladosporium sp.中分离得到两个十二元环内酯类化合物 pandangolide 1a , pandangolide 1；海绵内生菌中提取分离出十二元环内酯类化合物：pandangolide 1，pandangolide 2，cladospolide B。Ping Jia等从朽木的内生菌Chloridium Virescens var. chlamydosporum中分离得到一个新的十二元环内酯类化合物chloriolide 1。也有学者合成了十二元环内酯 Sporiolide A、(+)-Cladospolide C、Cladospolide B-D，此类化合物均显示了很强的植物毒性，抗真菌活性，抗病毒活性，植物生长调节等活性。 

中国专利文献CN102010396A公开了一种具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物，是从植物内生真菌Cytospora sp. 发酵物中分离的到的16种具有抗肿瘤和抗菌活性的十元环内酯类化合物Cytospolides A～P，可用于制备抗肿瘤或抗菌的药物。中国专利文献CN100465172C公开了一种具有抗菌活性的大环内酯类化合物Macrolactin Q，是从中国东海芽孢杆菌次级代谢产物中分离获得的，对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用；中国专利文献CN102008465B公开了这种化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。但是关于从Dendrodochium.sp.中分离到的具有抗肿瘤和抗菌活性的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O及其应用目前还未见报道。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O。 

本发明的再一的目的是，提供十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O在制备抗肿瘤药物中的应用。 

本发明的另一的目的是，提供十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O在制备抗菌药物中的应用。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O，所述的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O具有如下化学结构通式： 

所述的化合物的基团搭配分别如下所示：

。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O在制备抗肿瘤药物中的应用。 

所述的抗肿瘤药物是抗肺癌、抗结肠癌或抗骨肉瘤的药物。 

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O在制备抗菌药物中的应用。 

所述的抗菌药物是抗真菌或细菌的药物。 

所述的真菌是花药黑粉菌或壳针孢叶枯病菌。 

所述的细菌是大肠杆菌或巨大芽孢杆菌。 

本发明优点在于： 

1、经体外抗肿瘤和体外抗菌活性实验，本发明化合物对A549（人肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）等多种肿瘤细胞有明显抑制作用，对假丝酵母菌、丝状真菌以及大肠杆菌等有潜在的抗真菌和细菌活性，因此可用于制备抗肿瘤或抗菌药物；

2、本发明为研制新的抗肿瘤或抗菌药物提供了先导化合物，有利于开发利用海洋药用资源。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 

实施例1 本发明的十二元环内酯类化合物1～15（dendrochliods A～O）的制备

本发明从中国南海黑乳海参共附生真菌Dendrodochium.sp. 中分离到的15种新的具有抗肿瘤和抗菌活性的十二元环内酯类化合物dendrochliods A～O，上述化合物具有如下化学结构通式：

所述的化合物的基团搭配分别如下所示：

。

海参共附生真菌Dendrodochium.sp. (internal strain NO.10087)菌株分离自宿主黑乳海参(Holothuria nobilis Selenka)。此菌株在含5%生物麦芽提取物(biomalt)的固体琼脂培养基中室温发酵28天，然后用乙酸乙酯多次提取，提取液合并后浓缩减压蒸干得总浸膏8.0g。取微量浸膏进行TLC薄层板预实验，选取二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂。将浸膏进行正向硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇系统(100:0, 100:1, 85:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1,10:1, 0:100)洗脱，得到Fr.I～XXV共25个部分。Fr.I~ Fr.IV部分为小极性的脂肪族类成分。对Fr.XVI进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），得到化合物Dendrochliod A (3.4 mg)。对Fr.XIV进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），对其中的Fr. D进行硅胶柱层析（CH₂Cl₂：MeOH=30:1）并对Fr. D-4采用HPLC（MeOH：H₂O=50:50）得到Dendrochliod B(1.8 mg, 30 min)。采用同样的步骤，分别从Fr.XIV部分中得到Dendrochliod D(4.4 mg, 32min)和Dendrochliod J(1.8 mg, 34min)。对Fr.XIII进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），Fr. D经行硅胶柱层析（CH₂Cl₂：MeOH=40:1）得到化合物Dendrochliod C (12.1 mg)，对其中的Fr. D-3经HPLC（MeOH：H₂O=50:50）得到Dendrochliod J(1.8 mg, 34min)。对Fr.XII进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），对其中的Fr. A-3和Fr. C-5合并经HPLC（MeOH：H₂O=25:75）得到Dendrochliod I(4.5 mg, 90 min)、Dendrochliod G(1.0 mg 120 min)、Dendrochliod H(1.4 mg 130 min)。对Fr.IX和Fr.X进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），并经HPLC（MeOH：H₂O=30:70）得到Dendrochliod E (7.4 mg 88 min)、Dendrochliod F(41.7mg 102 min)。对Fr.VIII进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），对其中的Fr. C-3进行硅胶柱层析（PE：Acetone=4:1）得到Dendrochliod M(6.0 mg)。对Fr.VII进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1），得到化合物Dendrochliod K(29.6 mg)，对其中的Fr. D-1进行硅胶柱层析（PE：Acetone=5:1）得到Dendrochliod L(6.0 mg, 32 min)。对Fr.V进行凝胶柱层析（CHCl₃：MeOH=2:1）然后对其中的Fr. A-3和Fr. D-3采用HPLC（MeOH：H₂O=35:65）得到Dendrochliod N(2.7 mg, 42 min)、Dendrochliod O(2.1 mg，48 min)。 

实施例2 本发明的十二元环内酯类化合物1～15（dendrochliods A～O）的鉴定

1. Dendrochliod A：C₁₂H₂₀O₅，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表1。

2. Dendrochliod B：C₁₂H₁₈O₅，淡黄色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表2。 

3. Dendrochliod C：C₁₂H₁₈O₅，淡黄色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表3。 

4. Dendrochliod D：C₁₂H₁₈O₅，淡黄色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表4。 

5. Dendrochliod E：C₁₃H₂₀O₅，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表5。 

6. Dendrochliod F：C₁₃H₂₀O₅，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表6。 

7. Dendrochliod G：C₁₂H₂₀O₆，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表7。 

8. Dendrochliod H：C₁₂H₁₈O₄，淡黄色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表8。 

9. Dendrochliod I：C₁₂H₁₈O₄，淡黄色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表9。 

10. Dendrochliod J：C₁₂H₁₆O₄，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表10。 

11. Dendrochliod K：C₁₂H₂₀O₄，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表11。 

12. Dendrochliod L：C₁₂H₂₂O₄，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表12。 

13. Dendrochliod M：C₁₂H₂₀O₄，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表13。 

14. Dendrochliod N：C₁₂H₂₀O₄，无色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表14。 

15. Dendrochliod O：C₁₃H₂₀O₅，淡黄色油状物。¹H and ¹³C NMR数据见表15。 

表 1. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod A (in Acetone, 400MHz) 

表 2. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod B (in CDCl₃, 500MHz)

表 3. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod C (inCDCl₃ , 500MHz)

表 4. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod D (in CDCl₃, 500MHz)

表 5. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod E (in CDCl₃, 500MHz)

表 6. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod F (in CDCl₃, 500MHz)

表 7. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod G (in CDCl₃, 500MHz)

表 8. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod H (in CDCl₃, 600MHz)

表 9. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod I (in CDCl₃, 600MHz)

表 10. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod J (in CDCl₃, 500MHz)

表 11. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod K (in CDCl₃, 500MHz)

 表 12. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod L (in MeOD, 400MHz)

 表 13. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod M (in CDCl₃, 400MHz)

表 14. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod N (in CDCl₃, 600MHz)

表 15. ¹H and ¹³C NMR数据Dendrochliod O (in CDCl₃, 400MHz)

实施例3 本发明十二元环内酯类化合物1～15（dendrochliods A～O）的抗肿瘤实验

一、实验方法

采用常规的MTT法对本发明化合物进行肿瘤细胞增殖抑制试验。

1. 实验用细胞株：A549（人肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）和MG63（人骨肉瘤细胞）。实验用细胞株来源于中国科学院细胞所。 

2. 实验试剂、耗材和仪器： 

DMEM培养液（Invitrigen）；1640培养液（Invitrigen）；McCoy's 5a（Invitrigen）；血清（Invitrigen）；胰酶（Invitrigen）；DMSO(sigma)；MTT(sigma)；CCK8(日本同仁)；培养皿（Corning）；移液管（Corning）；96孔板（Corning）；CO₂孵箱（SANYO）；酶标仪（Biotek76833）

3. 实验用药：

本发明化合物1～15（Dendrochliods A～O）。

阳性对照药：阿霉素（Adriamycin）。 

4. 细胞培养 

A549细胞培养：人肺腺癌细胞（A549）用含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃ 5% CO₂  条件下培养，待细胞铺满培养皿底70%～80%后，用0.25%的胰酶进行消化，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100 μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。

Lovo细胞培养：人结肠癌细胞（Lovo）用含有10%胎牛血清的DMEM培养培养液中，37℃ 5% CO₂  条件下培养，待细胞铺满培养皿底70%～80%后，用0.25%的胰酶进行消化，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100 μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。 

MG63细胞培养：人骨肉瘤细胞（MG63），用含有10%胎牛血清的McCoy's 5a培养液中，37℃ 5% CO₂条件下培养，待细胞达到10⁶左右时，1000 rpm 5min 离心传代，调整细胞密度至10⁵个/ml，以每孔100 μl接种于96孔板中，于18～24h后进行实验。 

5. 细胞活力检测实验 

A549、Lovo和MG63细胞活力检测实验：于实验前24h以10⁴个/孔的细胞浓度接种96孔板。每孔分别给药1μl，终浓度分别达到30 μg/ml，设立三个重复组、及DMSO阴性对照组和阿霉素（30 μg/ml）阳性对照组。给药后，37℃ 5% CO₂条件下孵育24h。每孔加入10μl 5 mg/ml MTT(噻唑蓝)，37℃ 5% CO₂条件下孵育4h。吸去培养板中的细胞培养液。每孔加入150μl DMSO溶液，于37℃下摇床震荡15min。用酶标仪检测570 nm下的OD值。

二、实验结果 

通过MTT法测定化合物1～15（dendrochliods A～O）体外细胞毒活性，各化合物的肿瘤细胞抑制率见表16，其中：样品浓度为30 μg/ml，阿霉素浓度为30 μg/ml；抑制率单位为%。

表16 化合物1～15（Dendrochliods A～O）的肿瘤细胞增殖抑制试验 

由表16可见，化合物Dendrochliod B、Dendrochliod C、Dendrochliod D、Dendrochliod I、Dendrochliod J、Dendrochliod K、Dendrochliod M、Dendrochliod N、Dendrochliod O对A549（人肺癌细胞）有明显的抑制作用；化合物Dendrochliod I对Lovo（人结肠癌细胞）有明显的抑制作用，化合物Dendrochliod B、Dendrochliod C、Dendrochliod D、Dendrochliod I、Dendrochliod J、Dendrochliod K、Dendrochliod M、Dendrochliod N对MG63（人骨肉瘤细胞）有明显的抑制作用，其它化合物也有不等的潜在的抗肿瘤细胞作用。

实施例4 本发明十二元环内酯类化合物1～15（Dendrochliods A～O）的抗菌实验

一、实验方法

采用琼脂扩散法对本发明化合物进行体外抗菌试验

1. 试验用菌（由第二军医大学海洋药物研究中心提供）

真菌：花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)、壳针孢叶枯病菌(Septoria tritici)；

细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

2. 实验用药 

1）阳性对照药：青霉素(Penicillin)（购自哈药集团制药总厂）、链霉素(Streptomycin)（购自华北制药股份有限公司）、酮康唑（Ketoconazole）（购自华北制药股份有限公司）；

2）阴性对照品：丙酮(Acetone) （购自国药集团化学试剂有限公司）；

3. 实验步骤

将青霉素、链霉素、酮康唑、Dendrochliods A～O分别用丙酮配制成浓度为2 mg/ml的溶液，单次测试用量25μl。将上述2种真菌和2种细菌按无菌操作的要求分别用7ml灭菌水配制成菌液，浓度为1.0×10⁵ cfu/ml，各用喷雾器取4ml菌液，分别均匀喷洒于各自培养皿的培养基表面（花药黑粉菌采用MPY培养基，壳针孢叶枯病菌采用MPY培养基，大肠杆菌采用NB培养基，巨大芽孢杆菌采用NB培养基），再在每个培养皿内分别放置直径约1cm灭菌滤纸两块，覆盖于培养基表面，然后分别取上述配制的药液25μl滴于滤纸上，盖上培养皿盖子进行培养。各培养皿盖子上均注明相应培养基种类、菌种、化合物名称、接种时间。花药黑粉菌室温培养96小时，壳针孢叶枯病菌24℃培养96小时，大肠杆菌37℃培养24小时，巨大芽孢杆菌37℃培养24小时。按时观察结果，测量抑菌圈的大小(半径)，平行试验3次，结果见表17。

表17 琼脂扩散实验活性筛选（mm） 

由表17可见，Dendrochliod A、Dendrochliod B、Dendrochliod C、Dendrochliod I、Dendrochliod N对壳针孢叶枯病菌有显著抑制作用；Dendrochliod C、Dendrochliod D、Dendrochliod K、Dendrochliod O对花药黑粉菌有显著抑制作用；Dendrochliod A、Dendrochliod B、Dendrochliod F、Dendrochliod H、Dendrochliod L对大肠杆菌有显著抑制作用；Dendrochliod E、Dendrochliod G、Dendrochliod I、Dendrochliod M对巨大芽孢杆菌有显著抑制作用；其它化合物有潜在的抑菌作用。

上述实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性或潜在的抗菌活性，故可用于制备抗肿瘤或抗菌药物，本发明为深入研究和开发新的抗肿瘤或抗菌药物开辟了新的途径。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。 

具有抗肿瘤和抗菌活性的十二元环内酯类化合物及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。