专利摘要

本发明涉及天然药物化学领域和生物农药技术领域，公开了一种新的生物碱化合物及其制备方法和在制备抗菌农药中的用途。本发明公开的一种生物碱化合物，结构如摘要附图所示，化学名为二氢水仙克拉辛‑4‑O‑α‑L‑阿拉伯糖苷（dihydronarciclasine‑4‑O‑α‑L‑arabinopyranoside）。其特征在于：以石蒜科植物为原料，甲醇、乙醇或含水醇类提取，过滤、浓缩至小体积，用水分散后经大孔树脂柱层析，收集30%醇洗脱部位，再经反复柱层析，柱层析填料为硅胶或反相硅胶，即得新生物碱。所述石蒜科植物为葱莲，石蒜，长筒石蒜和忽地笑。该化合物作为一种天然植物杀菌剂，对水稻稻瘟病菌和棉花黄萎病菌抗菌效果显著，可以单独使用，也可以与其它杀菌剂复配，制成复配杀菌农药。

权利要求

1.一种生物碱化合物，其特征在于：化学名为二氢水仙克拉辛-4-O-α-L-阿拉伯糖苷(dihydronarciclasine-4-O-α-L-arabinopyranoside)，分子量为441，分子式为C19H23NO11，结构为式I所示。

2.根据权利要求1所述的生物碱化合物的制备方法，其特征在于：以石蒜科植物为原料，甲醇、乙醇提取，过滤、浓缩至小体积，用水分散后经大孔树脂柱层析，收集30％醇洗脱部位，再经反复柱层析，柱层析填料为硅胶或反相硅胶，即得新生物碱。

3.根据权利要求2生物碱的制备方法，其特征在于：所述石蒜科植物为葱莲(Zephyranthes candida)，石蒜(Lycoris radiata)，长筒石蒜(Lycoris longituba)和忽地笑(Lycoris aurea)。

4.一种天然植物杀菌剂，其特征在于以权利要求1的生物碱化合物作为杀菌组分。

5.根据权利要求4所述的天然植物杀菌剂，其特征在于：所述的天然植物杀菌剂用于水稻稻瘟病菌(Magnaporthe orythae)和棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)的杀菌剂。

6.根据权利要求4所述的天然植物杀菌剂，其特征在于：所述的天然植物杀菌剂与其它杀菌剂复配，制成复配杀菌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域和生物农药技术领域，公开了一种新的生物碱化合物及其制备方法和在制备抗菌农药中的用途。

背景技术

21世纪，随着人们环境保护意识的增强以及对食品安全的关注，化学农药的负面作用日益受到人们的重视，发展生物农药已成为保障人类健康和农业可持续发展的重要趋势。植物中含有丰富的次生代谢产物，一些次生代谢产物因其具有一定的防治病虫害等作用，成为近年来研究的热点。植物次生代谢物的种类有生物碱类、酚类物质、萜类、黄酮类、精油类、光活化毒素类等。其中生物碱是含量最大的一类，生物碱不仅对昆虫具有毒杀、忌避、拒食、抑制生长发育等作用，同时对多种植物病菌有很强的抑菌和杀菌作用[1]。

已开发的生物碱类植物源农药大多以杀虫农药为主，如烟碱、苦参碱等，近几年来，国内外许多学者开始研究一些植物生物碱提取物的抗菌、杀菌活性。如张曦燕等学者，采用PDA平板生长速率法，测定了牛心朴子生物碱提取液对稻瘟病、灰霉病的抑制作用和毒力。结果表明：提取液对两种病菌均有抑制作用，并随着提取液浓度的升高，对病菌菌丝生长的抑制作用也随之增强；添加附着剂的牛心朴子提取液无明显增强其抑制稻瘟病菌生长的作用。湖南用山苍籽油配制的乳剂，对茶树主要病害茶红锈病、茶黄萎病、茶云纹叶枯病和棉花枯萎病、黄萎病等有较好的防治效果。薄荷等粉碎物以土重0.5%～0.1%的用量处理严重感染棉花枯萎病的土壤，对枯萎病的防效可达43.9%～74.3%[2]。还未有报道某种具体结构的生物碱成分对水稻稻瘟病菌（Magnaporthe orythae）和棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）有抑菌、杀菌作用。

石蒜科(Amaryllidaceae)植物以其丰富多样的生物碱类成分而著称[3]，异喹诺酮类生物碱（isocarbostyril）是其中一类特殊的化合物，主要分布在石蒜科植物中[4]，经检索得知，分离得到该类天然产物化合物数量只有12个，具有良好的抗肿瘤、抗病毒和抗真菌的药理作用。据文献[5]报道抗真菌作用：pancratistatin，7-deoxynarciclasine对小肠脑炎微孢子虫有抗性，IC50分别是0.18μM和0.20 μM，这个浓度是化合物对宿主细胞的细胞毒IC50的1/8。还未有报道石蒜科植物对水稻稻瘟病菌和棉花黄萎病菌有抑菌、杀菌作用。我们从石蒜科植物中首次发现的新异喹诺酮类生物碱具有很好的抑制水稻稻瘟病菌和棉花黄萎病菌活性。

稻瘟病是世界性的水稻病害，是水稻三大病害之首，2014年安徽万亩超级稻因稻瘟病减产绝收事件引起社会广泛关注。由于该病原菌易变，新的致病和抗药性群体的产生分别易导致新选育的抗病品种和药剂失去利用价值，因此，新的稻瘟菌杀菌剂的研发和应用受到广泛重视。棉花黄萎病是目前严重制约棉花生产的世界性病害，其危害极其严重，被称为棉花的“癌症”，没有特效药。因此，菌、肥、药综合防治配套技术与抗病新品种的选育工作缺一不可。综上所述，新异喹诺酮类生物碱杀菌药的研制对防治稻瘟病和棉花黄萎病具有重要意义。

与本发明有关的现有技术有。

[1] 薛广厚，范海延，李航，高璐，李伊夫。生物碱在植物源农药中的应用研究。北方园艺，2009，6：131-134。

[2] 吕梅香，曾和平，王晓娟，谢彦，王辉。农药用生物碱的研究进展。农药，2004，43（6）：249-253。

[3] 李健，于淼，高世勇，袁洪亮，陈文强。石蒜科植物中生物碱的药理作用研究。哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2014，30（2）：168-171。

[4] 陈宁，董岩，凌娜，季宇彬。石蒜科两种典型异喹诺酮类生物碱及其衍生物的构效关系。食品与药品，2014，16（1）：52-54。

[5]Quarzane-Amara M, Franetich JF, Mazier D, et al. In VitroActivities of Two Antimitotic Compounds, Pancratistatin and 7-Deoxynarciclasine, against Encephalitozoon intestinalis, a MicrosporidiumCausing Infections in Humans [J]. Antimicrob Agents Chemother,2001, 45(12)：3409-3415。

发明内容

本发明旨在提供一种新的生物碱化合物及其制备方法和在制备抗菌农药中的用途。

本发明公开了一种生物碱化合物，其特征在于：化学名为二氢水仙克拉辛-4-O-α-L-阿拉伯糖苷（dihydronarciclasine-4-O-α-L-arabinopyranoside），分子量为441，分子式为C19H23NO11，结构为式I所示。

式I。

上述的生物碱的制备方法，其特征在于：以石蒜科植物为原料，甲醇、乙醇或含水醇类提取，过滤、浓缩至小体积，用水分散后经大孔树脂柱层析，收集30%醇洗脱部位，再经反复柱层析，柱层析填料为硅胶或反相硅胶，即得新生物碱。

根据权利要求2生物碱的制备方法，其特征在于：所述石蒜科植物为葱莲（Zephyranthes candida），石蒜（Lycoris radiata），长筒石蒜（Lycoris longituba）和忽地笑（Lycoris aurea）。

这种生物碱可以从植物中提取分离制备而得，也可以用化学合成方式获得。

一种天然植物杀菌剂，其特征在于以权利要求1的生物碱化合物作为杀菌组分。

根据权利要求4的应用，其特征在于：所述农作物病原真菌为水稻稻瘟病菌（Magnaporthe orythae）和棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）。

根据权利要求4的应用，其特征在于：所述的生物碱化合物与其它杀菌剂复配，制成复配杀菌农药。

生物碱具有高效、低毒、无污染、对人畜安全、作用方式独特、选择性高、对天敌和有益生物安全及害虫病原菌不易产生抗药性等优点的天然产物，符合人们对理想农药的要求，但目前仅少数植物生物碱在植物保护中得到广泛应用。水仙克拉辛具有很好的抗病毒、抗肿瘤等作用，但是对水稻稻瘟病菌（Magnaporthe orythae）和棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）的效果一般，二氢水仙克拉辛-4-O-α-L-阿拉伯糖苷在母核结构上连接阿拉伯糖后生物活性大大增加，具有很好的作为农用杀菌剂使用的价值。

为延缓抗药性和兼治病虫、杂草以提高农药防治效果，根据一药多治的原则，按照农药一定的混合比例采用复合配制方法配成的农药称为复配农药。在病虫害防治中单剂逐渐淡出历史的舞台，为增加防效达到兼治的效果，农药的复配得到推广和应用。二氢水仙克拉辛-4-O-α-L-阿拉伯糖苷作为一种新的天然生物农药，具有新的抗菌机理，与现有的农药复配后能延缓病菌耐药，减少意外损失。

附图说明

以下图可作为附件材料上报。

图1、本发明实施例1所得的化合物结构式。

图2、本发明实施例1所得的化合物质谱（ESI MS）谱图。

图3、本发明实施例1所得的化合物核磁共振氢谱（1H-NMR）谱图。

图4、本发明实施例1所得的化合物核磁共振碳谱（13C-NMR）谱图。

图5、本发明实施例1所得的化合物二维核磁共振（HSQC）谱图。

图6、本发明实施例1所得的化合物二维核磁共振（HMBC）谱图。

图7、本发明实施例1所得的化合物二维核磁共振（H-H COSY）谱图。

具体实施方式

结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。

实施例1。

新鲜葱莲鳞茎，切碎，晒干得到40 kg，用95%乙醇冷浸提取3次，每次10 天，过滤得到冷浸提取液，滤渣用95%乙醇热回流提取4 次，2h/次，合并冷浸和热提的浸提液，减压浓缩得到浸膏，加水溶解。水液经过大孔树脂D101柱，用不同浓度的乙醇洗脱，其中30%乙醇部位得到147 g提取物。将得到的147g提取物上硅胶柱，以氯仿-甲醇-水系统洗脱进行分段和反复柱层析，得到化合物Yzec-3，纯度经HPLC-MS检测大于98%。结构通过质谱和核磁共振解析后，命名为二氢水仙克拉辛-4-O-α-L-阿拉伯糖苷（dihydronarciclasine-4- O-α-L-arabinopyranoside），经SCIfinder检索后发现，该化合物为新化合物。

结构解析：化合物Yzec-3，白色固体，[α]D26.7 +18° (c 0.17，pyridine)，难溶于氯仿、水、甲醇；微溶于DMSO，吡啶。TLC遇三氯化铁显紫色，推测分子中可能含有酚羟基；Molish反应阳性，推测结构中含糖；改良碘化铋钾呈阴性。ES-TOF-MS：m/z 440.1[M-H]-，442.1 [M+H]+，推测该化合物的分子量为441.1；HR-ES-TOF-MS: 442.1351(calc.for[C19H23NO11+H]+ 442.1349)，结合1H-NMR和13C-NMR，推断化合物的分子式为C19H23NO11，不饱和度为9。1H-NMR中，δ 6.02和δ 6.04(each 1H，s，-OCH2O-)以及13C-NMR中，δ101.9(-OCH2O-)的碳信号，是石蒜科生物碱结构中与苯环相连的亚甲二氧基结构。δ 12.82(1H，s，7-OH)的氢信号，结合该化合物和三氯化铁显色的性质，说明结构中存在酚羟基，且该酚羟基信号出现在较低场，推测和苯环相连的羰基(C-6)有缔合作用。δ7.10(1H，s，H-5)的氢信号，在HSQC谱中未能找到与之相关的碳信号，推测该氢可能与N相连。δ 6.52(1H，s，H-10)通过HSQC谱，是与δ 96.7(C-10)碳相连，表明化合物含有1个未取代芳香氢。δ 2.94(1H，dt，J = 14.1Hz， 3.2 Hz，H-10b)，根据峰的裂分情况，说明该氢和一个仲碳(C-1)和一个叔碳(C-4a)相邻。在HMBC谱中，δ3.42(1H，m，H-4a )的氢信号和δ52.7(C-4a)的碳信号相关，推断δ52.7(C-4a)的碳与N相连。

13C-NMR中，在δ 169.2 有碳信号，说明结构中存在羰基(C-6)。13C-NMR图谱显示，该化合物在低场的碳信号共有9个，其中包括，1个亚甲二氧基的碳信号和1个羰基碳信号，6个苯环上碳信号，除苯环结构片段外不含有碳碳双键，分子中还含有1个端基碳。另外，根据分子结构中不饱和度为9，其中包括了1个苯环，及其与苯环相连的亚甲二氧基结构，1个羰基，因此，结构中只能还有3个环。分子中含氧较多有11个，应该是1个羰基氧，亚甲二氧基2个氧，1个酚羟基，根据其余的碳信号位移，另外的氧属于羟基氧和糖羟基。

结合相关文献和植物化学成分的生源关系及理化性质，推测化合物是石蒜科异喹诺酮类生物碱，其母核结构为dihydronarciclasine。在H-H COSY谱中，δ 2.94(1H，dt， J =14.1 Hz，3.2 Hz，H-10b)和δ3.42(1H， m，H-4a )无相关信号，且这两个氢的偶合常数J =3.2 Hz，推测这两个氢处于反式位置，推断母核结构为：trans-dihydronarciclasin。

HSQC谱中，δ 103.5(C-1’)的碳信号和δ 4.23(1H， J =7.4 Hz，H-1’)氢信号相关，推测是糖片段部位的端基碳信号和端基氢信号，结合HMBC谱，得知化合物分子结构中糖片段的其他碳信号是：72.9(C-2’)，75.6(C-3’)，69.7(C-4’)，66.0(C-5’)。推测含有一个五碳糖。水解生成的单糖为阿拉伯糖，由其旋光值推断其为L-阿拉伯糖，由端基氢的偶合常数J=7.4 Hz，因此推断为连接了α-L-阿拉伯糖。HMBC谱中，δ 4.23(1H，d，J =7.4 Hz)氢和δ79.4(C-4)的碳是相关，推断化合物Yzec-3结构中，糖的连接位置在δ 79.4(C-4)位上。

综合以上分析，Yzec-3鉴定该化合物为： trans-dihydronarciclasine-4-O-α-L-arabinopyranoside。经SCIfinder检索后发现，该化合物为新化合物。

实施例2。

石蒜鳞茎用80%乙醇热回流提取3 次，2h/次，过滤合并提取液，浓缩至小体积，用水分散后经大孔树脂AB-8柱层析，收集30%醇洗脱部位，再用反相C18硅胶柱层析，60%乙醇洗脱，反复3次，即得。纯度经HPLC检测大于90%。

实施例3。

长筒石蒜鳞茎用75%乙醇热回流提取3 次，2h/次，过滤合并提取液，浓缩至小体积，用水分散后经大孔树脂D101柱层析，收集30%醇洗脱部位，再用硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水系统洗脱，再用反相C18硅胶柱层析，60%乙醇洗脱即得。纯度经HPLC检测大于85%。

实施例4。

忽地笑鳞茎用80%甲醇热回流提取3 次，2h/次，过滤合并提取液，浓缩至小体积，用水分散后经大孔树脂D101柱层析，收集30%甲醇洗脱部位，用反相C18硅胶柱层析，60%甲醇洗脱，再用凝胶LH20柱层析，60%甲醇洗脱即得。纯度经HPLC检测大于90%。

实施例5。

杀菌剂抑菌圈测定法。

（1）、供试药液：新生物碱10μg/mL，水仙克拉辛10μg/mL。

（2）、加热PDA培养基，待冷却至50℃左右时加入待测药液，空白溶剂DMSO为对照。

（3）、将水稻稻瘟病菌（Magnaporthe orythae）和棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）连续培养两代，然后在菌落边缘用打孔器取5mm直径的菌碟。

（4）、将菌碟分别接种于含药和不含药的平板上，25℃培养至对照接近长满板。

（5）、采用十字交叉法测定菌落直径，并计算抑制率。

（6）、实验结果。

由表2可知，按本发明技术生产的新生物碱化合物由于结构上增加阿拉伯糖基团，对水稻稻瘟病菌和棉花黄萎病菌的抑制活性大大增强。而母核水仙克拉辛对水稻稻瘟病菌和棉花黄萎病菌效果一般。

此外，按本发明技术生产的新生物碱化合物对小麦赤霉病菌、葡萄炭疽病菌、玉米小斑病菌、草莓灰霉病菌、小麦纹枯病菌也有活性，但是不如其对水稻稻瘟病菌和棉花黄萎病菌活性显著，所以未进行详细描述。

本发明的一种生物碱化合物用于制备农用杀菌剂的用途已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

一种生物碱化合物及其制备方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。